Name: Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę podwójnego mapowania optycznego potencjału transbłonowego i wapnia w retikulum sarkoplazmatycznym w izolowanym sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (R01 HL 111600) i American Heart Association (12SDG9010015).

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis i przestrzegane zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych opublikowanym przez National Institutes of Health.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotować wcześniej dwa skoncentrowane (25X) zapasy zmodyfikowanego roztworu Tyrodego i przechowywać w temperaturze 4 °C: (1) Stado I (w mM: NaCl 3,205, CaCl2 32,5, KCl 117,5, NaH2PO4 29,75, MgCl2 26,25) i (2) Stado II (w mM: NaHCO3 500).
	<ol>
		<li>Świeżo przygotować 2 l roztworu Tyrode'a o następującym składzie (w mM): NaCl 128,2, CaCl2 1,3, KCl 4,7, MgCl2 1,05, NaH2PO4 1,19, NaHCO3 20 i glukozy 11,1, łącząc 1840 ml wody dejonizowanej (DI), 80 ml bulionu I, 80 ml bulionu II i 4 g glukozy. Nie mieszaj bezpośrednio Stocka I i Stocka II; dodać je do 1,840 ml DI, aby uniknąć wytrącania się.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wcześniej roztwór podstawowy blebbitatyny rozprzęgającego wzbudzenie-skurcz o stężeniu 10 mg/ml w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe barwników fluorescencyjnych: (1) barwnik wrażliwy na napięcie RH237 (1 mg/ml w DMSO) i (2) wskaźnik wapnia o niskim powinowactwie Fluo-5N AM (2 mg/ml w DMSO) zgodnie z zaleceniami producenta. Preparaty należy zużyć natychmiast, aby uniknąć rozkładu i późniejszej utraty ładowności.</li>
	<li>Recyrkulacyjny system perfuzyjny Langendorffa zalać natlenionym (95%O2, 5% CO2) roztworem Tyrode'a. Dostosuj przepływO2/CO2 , aby utrzymać pH roztworu Tyrode na poziomie 7,4 ± 0,05. Użyj wbudowanego filtra siatkowego z nylonu (wielkość porów: 11 μm), aby w sposób ciągły filtrować perfuzat.
	<ol>
		<li>Zalać system perfuzyjny w RT, ponieważ kolejne ładowanie Fluo-5N AM jest wykonywane w RT. Do ładowania Fluo-5N AM należy użyć niewielkiej objętości perfuzatu recyrkulacyjnego (~ 150 ml). Po załadowaniu barwnika użyj większej objętości perfuzatu (1 - 2 l, patrz rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz system akwizycji danych i przygotuj się na ciągłe monitorowanie EKG i ciśnienia perfuzyjnego. Przygotuj system monitorowania ciśnienia: Podłącz przetwornik ciśnienia do linii perfuzyjnej i monitoruj ciśnienie perfuzji za pomocą wzmacniacza transbridge. Dostosuj podstawowe ciśnienie perfuzji do 0 mmHg, gdy serce nie jest podłączone do systemu perfuzyjnego.</li>
	<li>Ustaw kamery do mapowania optycznego, aby zapewnić wyrównanie przestrzenne między sygnałami Vm i SR Ca2+.
	<ol>
		<li>Najpierw ustaw ostrość kamer, umieszczając linijkę lub przedmiot z tekstem w naczyniu perfuzyjnym. Przełącz kamery mapujące w tryb podglądu na żywo i dostosuj ostrość, aż tekst będzie ostry i wyraźny. Uzyskuj pojedynczy obraz z każdej kamery.</li>
		<li>Nałóż te obrazy i dostosuj przezroczystość górnego obrazu, tak aby oba obrazy były widoczne. Tekst na obrazach powinien dokładnie na siebie zachodzić. Jeśli nie są idealnie wyrównane, dostosuj kąt lustra dichroicznego lub położenie każdej kamery, aż oba obrazy zostaną wyrównane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zbiór, perfuzja i ładowanie barwnika serca królika
<ol>
	<li>Zabezpiecz królika w zatwierdzonym unieruchomieniu dla królika. Głębokie znieczulenie poprzez dożylne wstrzyknięcie (żyła brzeżna) pentobarbitalu sodu (50 mg / kg) i heparyny (1 000 j.m.).
	<ol>
		<li>Kiedy królik wykazuje brak odruchów nocyceptywnych, wykonaj nacięcie skóry w linii środkowej, aby odsłonić mostek i żebra. Przeciąć mostek nożyczkami chirurgicznymi od ksyloidu do brzucha. Uważaj, aby nie uszkodzić serca podczas otwierania mostka. Rozłóż żeberka, aby odsłonić serce.</li>
		<li>Szybko wyciąć cały blok płuco-serce, szybko przecinając wszystkie naczynia i tkankę łączną. Natychmiast umieść blok płuco-serce w lodowatym roztworze Tyrode'a.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zlokalizuj aortę do perfuzji wstecznej. Przetnij aortę wstępującą tuż proksymalnie do trzech gałęzi łuku aorty. Kankaniul aortę do kaniuli 8 G połączonej z systemem perfuzyjnym. Użyj kawałka jedwabnego szwu USP 0, aby przymocować aortę do kaniuli.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj tchawicę, płuca i tłuszcz nasierdziowy z serca. Za pomocą ostrych kleszczy i nożyczek preparacyjnych zlokalizuj zastawkę mitralną i ostrożnie uszkodzić lub usunąć jedną ulotkę, aby zapobiec przekrwieniu roztworu w lewej komorze.</li>
	<li>Zanurz serce w komorze perfuzyjnej ze szklanym płaszczem poziomo, z przednią powierzchnią serca skierowaną do góry w celu obrazowania. Przymocuj kaniulę do kawałka Sylgarda za pomocą kołków w kształcie litery U na silikonowym dnie naczynia, aby zapobiec ruchowi serca podczas mapowania (ryc. 1D). W razie potrzeby włóż małą szpilkę do owadów na wierzchołku serca w celu stabilizacji.</li>
	<li>Umieść elektrody elektrody elektrokardiogramu (EKG) w kąpieli po prawej i lewej stronie serca. Całkowicie zanurz elektrody w kąpieli i upewnij się, że nie stykają się z powierzchnią serca, aby zapewnić EKG przewodzone objętościowo analogicznie do konfiguracji odprowadzenia I. Sprawdź prawidłową morfologię EKG odprowadzeniowego I. Dostosuj przepływ (25 - 35 ml/min), aby upewnić się, że ciśnienie w aortze jest utrzymywane na poziomie 60 - 70 mmHg.</li>
	<li>Wyłączyć oświetlenie w pomieszczeniu i dodać 0,3 - 0,6 ml roztworu podstawowego bróbstatyny (krok 1.2) do perfuzatu (stężenie końcowe 10 - 20 μM).
	<ol>
		<li>Wyłącz światła w pomieszczeniu, aby uniknąć fotoinaktywacji blebbistatyny. W razie potrzeby można użyć małego reflektora lub czołówki, aby zapewnić oświetlenie zadaniowe. 
		Uwaga: Blebbistatyna jest inhibitorem ATPazy miozyny i rozprzęgaczem pobudzenie-skurcz. Ponieważ obciążenie Fluo-5N wymaga przedłużonych (60 min) warunków RT (hipotermii) (patrz kroki 2.8 – 2.10), produkcja energii serca może być zagrożona. W związku z tym dodanie blebbistatyny do perfuzatu przed obciążeniem barwnikiem może zmniejszyć zapotrzebowanie na energię16 i wyeliminować artefakty ruchu podczas kolejnych zapisów optycznych17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ustaniu skurczu serca (10 - 15 minut, zweryfikowany na zapisie ciśnienia w aorcie), należy przełączyć się na system perfuzji recyrkulacyjnej o małej objętości (patrz krok 1.4.1).</li>
	<li>Przygotuj i załaduj roztwór nasycający Fluo-5N AM: Dodaj 0,25 ml roztworu podstawowego Fluo-5N AM (krok 1.3) do 0,25 ml ciepłego 20% Pluronic F127. Dodać 0,5 ml ciepłego roztworu Tyrode'a do mieszaniny, dobrze wymieszać i dodać do systemu recyrkulacyjnej perfuzji o małej objętości.</li>
	<li>Stale monitoruj ciśnienie perfuzyjne i EKG i w razie potrzeby dostosuj przepływ. Ładowanie barwnika trwa około 1 godziny przy RT. 45 minut po rozpoczęciu ładowania włącz obiegową łaźnię wodną, aby rozpocząć podgrzewanie systemu perfuzyjnego i perfuzuj do 37 °C.</li>
	<li>Po 60 minutach ładowania Fluo-5N AM przełącz perfuzję na system perfuzji recyrkulacyjnej o większej objętości (patrz krok 1.4).</li>
	<li>Rozcieńczyć 50 μl roztworu podstawowego barwnika wrażliwego na napięcie RH237 (krok 1.3) w 1 ml ciepłego roztworu Tyrode'a i dodawać powoli (przez ~ 5 min) do portu iniekcyjnego proksymalnego do kaniuli.</li>
</ol>
3. Mapowanie optyczne
<ol>
	<li>W końcowych momentach ładowania barwnika ustaw serce i ustaw ostrość kamery do mapowania optycznego, aby zapewnić odpowiednie pole widzenia dla eksperymentu.</li>
	<li>W razie potrzeby umieść bipolarną elektrodę stymulacyjną na powierzchni nasierdzia serca w celu stymulacji.</li>
	<li>Umieść plastikowe lub szklane szkiełko nakrywkowe na powierzchni komory perfuzyjnej, aby zmniejszyć artefakt ruchu na powierzchni cieczy, który może być obecny w wyniku recyrkulacji perfuzatu. 
	Uwaga: Jako alternatywę dla szkiełka nakrywkowego należy użyć czystej plastikowej osłony szalki Petriego o średnicy 50 mm.</li>
	<li>Skoncentruj światłowody, aby równomiernie oświetlić powierzchnię serca światłem wzbudzającym. Użyj źródeł światła z diodami elektroluminescencyjnymi (LED) i dodatkowo przefiltruj światło za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 475 - 495 nm (rysunek 1A).</li>
	<li>Zbieraj emitowaną fluorescencję za pomocą makroskopu i dwóch komplementarnych kamer do mapowania optycznego metal-tlenek-półprzewodnik (CMOS). Podziel emitowane światło za pomocą lustra dichroicznego o długości fali 545 nm.
	<ol>
		<li>Filtr długoprzepustowy ugrupowanie o dłuższej długości fali, zawierające sygnał Vm, przy długości fali 700 nm. Filtr pasmowo-przepustowy ugrupowania o krótszej długości fali, zawierającego sygnał SR Ca2+, od 502 do 534 nm (rysunek 1A). Ustaw częstotliwość optycznej akwizycji danych na 0,5 - 1 kHz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla każdego nagrania optycznego najpierw zainicjuj żądany protokół stymulacji, włącz światło wzbudzenia i zbierz 1-4 sekundy danych. W razie potrzeby zsynchronizuj protokoły stymulacji i akwizycję danych. 
	Uwaga: Nie ma możliwości ponownego załadowania Fluo-5N AM, dlatego stosunek sygnału do szumu (SNR) będzie się zmniejszał przez cały czas trwania eksperymentu z powodu wycieku barwnika z SR. Ogranicz protokół eksperymentalny do 1 - 2 godzin, aby zapewnić wysokie wartości SNR.</li>
	<li>Po eksperymencie umyj system perfuzyjny w sekwencji wody DI, 70% alkoholu odczynnika i ponownie wodą DI.</li>
	<li>Przefiltruj każdy zestaw danych za pomocą przestrzennego filtra Gaussa (promień 3 piksele) przy użyciu dostępnych na rynku pakietów oprogramowania zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>W razie potrzeby wyrównaj przestrzennie zestawy danych Vm i SR Ca2+. Podobnie jak w kroku 1.6, nałóż na siebie obrazy z każdej kamery i sprawdź, czy struktury anatomiczne serca (tj. naczynia wieńcowe, krawędzie przedsionków lub komór) lub inne elementy w polu widzenia (np. kaniula, elektroda stymulacyjna) dokładnie się pokrywają. Jeśli nie, konieczne jest przestrzenne wyrównanie zbiorów danych.</li>
	<li>Przesuń górny przezroczysty obraz w kierunku x i y, aż do uzyskania dokładnego nałożenia, zwracając uwagę na liczbę pikseli, o które obraz musi być przesunięty w każdym kierunku. Cały zestaw danych odpowiadający górnemu obrazowi (Vm lub SR Ca2+) musi być następnie przesunięty o określoną liczbę pikseli w każdym kierunku, aby zapewnić precyzyjne wyrównanie między zestawami danych Vm i SR Ca2+.</li>
</ol>

<ol><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22tissues.+Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells.</a> tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circulation research. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optical+mapping+of+the+Langendorff-perfused+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).</li>
<li>Kong, W., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dye+affinity+in+optical+measurements+of+Cai%282%2B%29+transients+in+cardiac+muscle.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBers%2C+DM+%22Excitation-Contraction+Coupling+and+Cardiac+Contractile+Force%22">Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force</a>. , 2nd edn, Kluwer Academic. (2001).</li>
<li>Bers, D. M., Shannon, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+movements+inside+the+sarcoplasmic+reticulum+of+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).</li>
<li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+roles+of+calsequestrin+and+triadin+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle.</a> The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+calsequestrin+regulation+of+single+cardiac+ryanodine+receptor+in+normal+and+pathological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions.</a> The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).</li>
<li>Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuation+is+the+key+to+cardiac+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans.</a> Circulation research. 94, 650-656 (2004).</li>
<li>Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+scraps%3A+local+depletions+of+free+%5BCa2%2B%5D+in+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+during+contractions+leave+substantial+Ca2%2B+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve.</a> Circulation research. 93, 40-45 (2003).</li>
<li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+Ca%282%2B%29+content+regulates+intracellular+Ca%282%2B%29+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts%3A+effect+of+exogenous+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).</li>
<li>Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+alternans+do+not+rely+on+diastolic+sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations.</a> Circulation research. 99, 740-748 (2006).</li>
<li>Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractoriness+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+determines+Ca2%2B+alternans+in+atrial+myocytes.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+in+the+intact+heart%3A+ryanodine+receptor+refractoriness+during+alternans+and+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation.</a> Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).</li>
<li>Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R. 3rd, Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+Changes+During+Hypoxia%2C+Ischemia%2C+and+Increased+Work+Differ+Between+Isolated+Heart+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).</li>
<li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+rhythm+%3A+the+official+journal+of+the+Heart+Rhythm+Society%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).</li>
<li>Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+beta-adrenergic+stimulation+overcomes+source-sink+mismatch+to+generate+focal+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia.</a> Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).</li>
<li>Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+proteins+and+heart+failure%3A+mechanisms+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).</li>
<li>Cutler, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+ATPase+2a+gene+delivery+to+restore+electrical+stability+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.</a> Circulation. 126, 2095-2104 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kluczem do udanego ładowania barwnika Fluo-5N jest konfiguracja recyrkulacyjnej perfuzji o małej objętości, która pozwala na wysokie stężenie Fluo-5N bez konieczności stosowania dużych ilości barwnika, długość czasu ładowania (1 godzina) i wykonywanie ładowania w temperaturze pokojowej. Jeśli ładowanie odbywa się w temperaturach fizjologicznych, komórkowa aktywność enzymatyczna szybko rozszczepia znacznik –AM, gdy barwnik przechodzi przez błonę komórkową, zatrzymując cząsteczki barwnika w cytozolu i nie pozwalając im prz...

Podwójne optyczne mapowanie wewnątrzkomórkowego Ca2+ i potencjału transbłonowego (Vm) w nienaruszonym sercu z perfuzją Langendorffa stało się podstawą badań w elektrofizjologii serca, w tym mechanizmów arytmii i sprzężenia pobudzenie-skurcz1-4. Podejście to dostarczyło bezprecedensowej wiedzy na temat normalnej i nieprawidłowej elektrofizjologii oraz, co ważne, na temat dwukierunkowej relacji między Vm a wewnątrzkomórkowym Ca2+. Jednak mapowanie optyczne wewnątrzkomórkowego Ca2 + za pomocą wskaźników fluorescencyjnych o wysokim powinowactwie (takich jak Rhod-2 i Fluo-4) informuje tylko o masowych zmianach w wewnątrzkomórkowym Ca2 + i nie jest w stanie odróżnić, czy zmiany te są spowodowane transbłonowym strumieniem Ca2 +, uwalnianiem i wychwytem zwrotnym do magazynów wewnątrzkomórkowych, czy w większości przypadków jakąś kombinacją obu. Co więcej, wskaźniki Ca2 + o wysokim powinowactwie mają powolną kinetykę włączania i wyłączania i mogą nie wykazywać dokładnie szybkich zmian stężenia Ca2 + 5.
Każdy potencjał czynnościowy powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego Ca2+, znanego jako wewnątrzkomórkowy Ca2+ przejściowy (CaT). W sercu ssaków około 70 – 90% całkowitego CaT jest spowodowane uwalnianiem Ca2+ z retikulum sarkoplazmatycznego (SR) poprzez otwarcie receptorów ryanodine (RyRs)6. W SR około połowa całkowitego Ca2+ jest związana z kalsekwetryną (CSQ) i innymi wewnątrz-SR7, które odgrywają ważną rolę w homeostazie Ca2+ SR8,9. Ilość wolnego SR Ca2+ dyktuje siłę napędową uwalniania SRCa 2+, a także bramkowania RyR, a zatem ma znaczący wpływ na wewnątrzkomórkowy CaT. Co więcej, zmiany w uwalnianiu lub wychwytie zwrotnym SR Ca2 + mogą z kolei wpływać na Vm poprzez elektrogeniczną wymianę Na+-Ca2+, co może mieć konsekwencje arytmogenne. Dlatego, oprócz CaT, monitorowanie wolnego SR Ca2+ może dostarczyć ważnych informacji na temat dysfunkcji skurczowych i elektrofizjologicznych.
W ciągu ostatnich kilku lat, badacze poczynili znaczne postępy w monitorowaniu SR Ca2+ w izolowanych miocytach serca i z jednego miejsca na nienaruszonym sercu. Jedna z takich metod wymaga szybkich impulsów kofeiny w celu otwarcia RyR, a zawartość SR Ca2 + jest następnie wnioskowana lub obliczana na podstawie natychmiastowego wzrostu wewnątrzkomórkowego Ca2 + 10. Inne intrygujące podejście wykorzystuje wskaźniki Ca2+ o niskim powinowactwie, takie jak Fluo-5N11 lub Mag-Fluo412, które wiążą się z wolnym SR Ca2+. Wskaźniki te mają stałe dysocjacji (Kd) w zakresie 10 – 400 μM i dlatego wykazują minimalną fluorescencję w cytozolu w porównaniu do światła SR, gdzie stężenie Ca2+ ([Ca2+] SR) mieści się w zakresie milimolowym. Za pomocą wskaźników Ca2 + o niskim powinowactwie zbadano kilka aspektów cyklu SR Ca2 + na poziomie izolowanych miocytów, w tym frakcyjne uwalnianie SRCa 2 + i mechanizmy alternanów Ca2 + 13,14. Jednak, aby w pełni zrozumieć niejednorodną naturę cykli SRCa2+ w nienaruszonym sercu oraz rolę SR Ca2+ w przestrzennie odrębnych zjawiskach arytmicznych, potrzebne są metody obrazowania SR Ca2+ na powierzchni nasierdzia nienaruszonego serca15.
Ten artykuł opisuje metodologię podwójnego mapowania optycznego wolnego SR Ca2+ i Vm w nienaruszonym sercu królika perfundowanym przez Langendorffa ze wskaźnikiem Fluo-5N o niskim powinowactwie Ca2+. Oprócz ujawnienia cech SR Ca2+ przestrzennie na powierzchni nasierdzia serca, podejście to ma tę zaletę, że umożliwia jednoczesne monitorowanie Vm, co pozwala na badanie dwukierunkowej zależności między Vm a SRCa 2+.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td>Składnik roztworu Tyrode'a</td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Składnik roztworu Tyrode'a</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td>Składnik roztworu Tyrode'a</td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>Składnik roztworu Tyrode'a</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>Składnik roztworu Tyrode'a</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>Składnik roztworu Tyrode'a</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td>Składnik roztworu Tyrode'a</td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td><td>AirGas</td><td>karbogen</td><td>Do natleniania i pH roztworu Tyrode'a</td></tr><tr><td>Blebbistatyna</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td>Rozprzęgacz wzbudzająco-skurczowy</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>Barwnik wrażliwy na napięcie</td></tr><tr><td>Fluo-5N AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-26915</td><td>Wskaźnik Ca2+ o niskim powinowactwie; Alternatywa: Invitrogen F-14204; Załadunek musi odbywać się w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td>Do ładowania wskaźnika Ca2+; Przed użyciem podgrzeć, aż roztwór będzie klarowny</td></tr><tr><td>Sulfoxide dimetylu (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Do rozpuszczania blibstatyny i barwników</td></tr><tr><td>Filtr</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700</td><td>11 &#956; m filtr liniowy</td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia</td><td>WPI</td><td>BLPR2</td><td>Do pomiaru ciśnienia perfuzji</td></tr><tr><td>Wzmacniacz przetwornika mostkowego</td><td>WPI</td><td>SYS-TBM4M</td><td>Do transdukcji/wzmacniania sygnału ciśnienia; PowerLab może być również używany z odpowiednimi</td></tr><tr><td>ADInstrumentami</td><td></td><td>BioAmp PowerLab 26T</td><td>Do ciągłej rejestracji ciśnienia i sygnałów EKG</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Macroscopic optical setup. Szczegóły: obiektyw 0,63X (NA = 0,31), obiektyw kondensacyjny 2X, wynikowe pole widzenia = 3,1 cm x 3,1 cm, głębokość ostrości = ~ 1,5 mm</td></tr><tr><td>MiCam Ultima-L CMOS</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Optyczne kamery mapujące</td></tr><tr><td>Precyzyjne światło punktowe LED</td><td>Mightex</td><td>PLS-0470-030-15-S</td><td>Źródło światła LED</td></tr></tbody></table>

mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą langendorffa

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarkoplazmatyczne obchodzenie się z retikulum (SR) Ca2+ odgrywa kluczową rolę w normalnym sprzężeniu wzbudzenia-skurczu, a nieprawidłowa obsługa SR Ca2+ jest znana z tego, że odgrywa znaczącą rolę w niektórych typach arytmii. Ponieważ arytmie są przestrzennie odrębnymi, wyłaniającymi się zjawiskami, muszą być badane na poziomie tkankowym. Jednak metody bezpośredniego sondowania SR Ca2+ w nienaruszonym sercu pozostają ograniczone. W artykule opisano protokół podwójnego mapowania optycznego potencjału transbłonowego (Vm) i wolnego intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) w sercu królika perfundowanego metodą Langendorffa. Podejście to wykorzystuje wskaźnik Ca2 + o niskim powinowactwie Fluo-5N, który ma minimalną fluorescencję w cytozolu, w którym wewnątrzkomórkowy [Ca2+] ([Ca2 +] i) jest stosunkowo niski, ale wykazuje znaczną fluorescencję w świetle SR, gdzie [Ca2 +] SR znajduje się w zakresie milimolowym. Oprócz ujawnienia cech SR Ca2 + przestrzennie na powierzchni nasierdzia serca, podejście to ma wyraźną zaletę w postaci jednoczesnego monitorowania Vm, co pozwala na badanie dwukierunkowego związku między Vm a SR Ca2+ oraz roli SR Ca2+ w zjawiskach arytmogennych.

Rysunek 1A przedstawia schemat konfiguracji optycznej dla podwójnego mapowania Vm oraz Ca2+ w siateczce śródplazmatycznej (SR). W tej konfiguracji uzyskano całkowitą separację spektralną sygnałów Vm i Ca2+ SR (Rysunek 1B). Schemat systemu perfuzji z podwójną pętlą stosowanego do ładowania barwnika Fluo-5N zilustrowano na Rysunku 1C. Rysunek 1D pokazuje poziomą orientację serca w naczyniu perfuzyjnym. Reprezenta...

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesne mapowanie optyczne wolnego wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej oraz potencjału błonowego w nienaruszonym, izolowanym i perfundowanym sercu królika w układzie LOR. Jest to realizowane poprzez najpierw wycięcie serca królika i kaniulację aorty w celu przeprowadzenia wstecznej perfuzji lanor. Drugim krokiem jest wyeliminowanie skurczów poprzez dodanie do perfuzatu środka rozsprzęgającego pobudzenie i skurcz.Następnie perfuzję przełącza się na pętlę recyrkulacyjną o małej objętości i w temperaturze pokojowej dodaje wskaźnik wapnia o niskim powinowactwie. Ostatnie kroki polegają na ogrzaniu serca do 37 stopni Celsjusza przy użyciu pętli perfuzyjnej o dużej objętości oraz dodaniu barwnika wrażliwego na napięcie. W ten sposób podczas eksperymentu zmiany stężenia wapnia i potencjału błony komórkowej są mierzone poprzez pobudzanie serca światłem niebieskim i pomiar emitowanego światła za pomocą szybkich kamer CMOS.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że pozwala ona badaczom na bezpośrednie badanie krótkotrwałej dynamiki wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej (SR) bez zakłóceń ze strony transbłonowych sy

optical-mapping-intra-sarcoplasmic-reticulum-ca2-transmembrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Niniejszy raport zawiera szczegółowy opis metodologii i wyników jednoczesnego endokardialnego i epikardialnego mapowania optycznego wzbudzenia elektrycznego w nienaruszonym lewym przedsionku serca owczego perfundowanego metodą Langendorffa podczas indukowanego rozciąganiem migotania przedsionków.

Optyczne mapowanie wysokiej rozdzielczości wsierdzia i osierdzia w owczym modelu migotania przedsionków wywołanego rozciąganiem

Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).

Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Tutaj prezentujemy protokół optycznego mapowania aktywności elektrycznej z prawego przedsionka myszy, a zwłaszcza węzła zatokowo-przedsionkowego, w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Ten protokół wprowadza dwubarwne optyczne mapowanie serc myszy uzyskanych od zwierząt typu dzikiego i knock-in dotkniętych katacholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym, w tym elektrofizjologiczne pomiary napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+ o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej.

Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym

Poznaj metodę podwójnego mapowania optycznego potencjału transbłonowego i wapnia w retikulum sarkoplazmatycznym w izolowanym sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa (Wideo) | JoVE Journal

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca²⁺ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Przeglądaj więcej filmów