Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa
10 września 2015
Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.
Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne optyczne mapowanie wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego, potencjału wapniowego i transbłonowego w nienaruszonym izolowanym perfundowanym sercu królika LOR. Osiąga się to poprzez najpierw wycięcie serca królika i kaniulację aorty w celu wstecznej perfuzji lanorowej. Drugim krokiem jest wyeliminowanie skurczu poprzez dodanie rozprzęgnięcia skurczu wzbudzenia do ósemki perfu.
Następnie perfuzja jest przełączana na pętlę recyrkulacyjną o małej objętości i dodaje się wskaźnik wapnia o niskim powinowactwie w temperaturze pokojowej. Ostatnim krokiem jest ogrzanie serca do 37 stopni Celsjusza za pomocą pętli obfitości o dużej objętości i dodanie barwnika wrażliwego na napięcie. Tak więc podczas eksperymentu zmiany w potencjale wapniowym i transbłonowym są mierzone poprzez wzbudzanie serca niebieskim światłem i pomiar emitowanego światła za pomocą szybkich kamer CM OS.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że pozwala badaczom na bezpośrednie badanie retikulum sarkoplazmatycznego lub SR pod kątem krótkiej dynamiki wapnia bez zakłóceń ze strony transbłonowych sygnałów wapniowych. Metoda ta może również pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z rolą obchodzenia się z wapniem SR w przyczynianiu się do arytmii, ponieważ potencjał transbłonowy jest rejestrowany jednocześnie z wapniem SR, Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ optyczne sygnały wapnia SR mają bardzo niską amplitudę. Dlatego niezbędne jest prawidłowe obciążenie wskaźnika wapnia W przypadku tego protokołu konieczne jest posiadanie pod ręką świeżo przygotowanego roztworu tyro.
Wystarczą cztery litry. Nie mieszaj stężonych roztworów podstawowych bez rozcieńczenia. Również inne roztwory należy przygotować z wyprzedzeniem, zgodnie z zaleceniami w protokole tekstowym, wprowadzić do zasilania tyros 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla oraz dostosować przepływ gazu, aby ustawić pH roztworu bardzo blisko 7,4.
Roztwór powinien mieć temperaturę pokojową. Przygotuj recyrkulacyjny system perfuzyjny L andorf, umieszczając wbudowany filtr nylonowy z porami o średnicy 11 mikronów w celu przefiltrowania perfu satu. Teraz zalej główny system obfitości około dwoma litrami natlenionych tyros.
Całkowita objętość dwóch litrów obejmuje roztwór w zbiorniku. Następnie przygotuj i zalej krótką linię profuzji, która omija zbiornik roztworu, aby utworzyć pętlę recyrkulacyjną o małej objętości dla grypy o pięciu N am. Pobranie całkowitej objętości w mniejszym systemie recyrkulacyjnym powinno wynosić około 150 mililitrów.
Aby przygotować system monitorowania ciśnienia, podłącz przetwornik ciśnienia do linii profuzji i podłącz wyjście przetwornika do wzmacniacza mostka transakcyjnego. Teraz włącz system akwizycji danych. Ustaw go tak, aby stale monitorować EKG i ciśnienie profuzji.
Następnie dostosuj podstawowe ciśnienie perfuzji do zera milimetrów słupa rtęci. Na koniec wyrównaj optyczną kamerę mapującą zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Na początek zabezpiecz królika i znieczul go pentobarbitalem wraz z bolusem 1000 jednostek heparyny.
Zakryj oczy, aby uspokoić królika. Zacznij od nacięcia w linii środkowej, aby odsłonić mostek i żebra za pomocą nożyczek z końcówką. Przeciąć mostek między mieczykowatym a meibum.
Następnie ostrożnie otwórz mostek, nie uszkadzając serca i rozłóż żebra, aby odsłonić serce. Następnie szybko usuń cały blok płuco-serce, odcinając wszystkie otaczające naczynia i tkanki. Przenieś blok płuco-serce do około 100 mililitrów lodowatego roztworu tyro.
W wyciętym bloku tkankowym zlokalizuj aortę i przetnij aortę wstępującą tuż proksymalnie do trzech gałęzi łuku aorty. Następnie kanunumeruj aortę za pomocą kaniuli o rozmiarze ośmiu przymocowanej do systemu profuzji. Przymocuj aortę do kaniuli za pomocą kawałka jedwabnego szwu USP zero.
Po zabezpieczeniu kaniuli ostrożnie wypreparuj tchawicę, płuca i tłuszcz nasierdziowy. Następnie zidentyfikuj zastawkę mitralną i ostrożnie użyj ostrych kleszczy i nożyczek, aby uszkodzić lub usunąć jedną ulotkę. W związku z tym nie może dojść do przekrwienia roztworu w lewej komorze.
Kontynuuj, zanurzając serce w komorze perfuzyjnej poziomo przednią stroną do góry. Umieść kaniulę na kawałku kardy. Zabezpiecz kaniulę za pomocą kołków w kształcie litery U włożonych przez kawałek darni i do silikonowego dna naczynia perfuzyjnego.
Zapobiegnie to ruchom serca. Podczas obrazowania można użyć małej szpilki do owadów, aby w razie potrzeby ustabilizować wierzchołek, zmierzyć ilość roztworu tyro użytego podczas kaniulacji i zastąpić go świeżym roztworem, aby utrzymać całkowity krążący roztwór na poziomie dwóch litrów. Teraz całkowicie zanurz elektrody EKG w kąpieli po obu stronach serca, ale nie w kontakcie z sercem.
Następnie sprawdź, czy to sprawia, że morfologia odprowadzenia jest normalna. W międzyczasie utrzymuj ciśnienie w aortze na poziomie od 60 do 70 milimetrów słupa rtęci, regulując przepływ perfuzji w zakresie od 25 do 35 mililitrów na minutę. Teraz wyłącz światła w pomieszczeniu i dodaj 0,3 do 0,6 mililitra roztworu podstawowego statyn BLE do ósemki PERFU, aby uzyskać końcowe stężenie od 10 do 20 mikromolowych.
Po 10 do 15 minutach skurcze serca powinny ustać. Następnie przełącz się na system profuzji o małej objętości. Jednym z kluczy do udanego obrazowania wapnia SR jest prawidłowe obciążenie barwnika o przepływie pięciu Nam.
Wymaga to małej objętości perfuzji, aby osiągnąć wysokie stężenie barwnika i warunki temperatury pokojowej. Aby uniknąć estryfikacji D w cytozolu, teraz przygotuj 500 mikrolitrów grypy O pięć roztworów ładujących N am i wymieszaj je z 500 mikrolitrami roztworu drogowego. Następnie dodaj go do ósemki PERFU.
Pozwól pobieraniu kontynuować pobieranie przez 45 minut, a następnie włącz łaźnię z obiegową wodą, aby ogrzać system do 37 stopni Celsjusza. Po godzinie pobierania przełącz się z powrotem na większą głośność Perfu eight. Następnie wymieszaj 50 mikrolitrów barwnika wrażliwego na napięcie RH 2 37 z mililitrem ciepłych opon.
Powoli wstrzyknij to do systemu przez około pięć minut i kontynuuj optyczne mapowanie serca. Aby rozpocząć, ustaw ostrość kamery mapowania optycznego na odpowiednim polu, aby zmniejszyć ruch na powierzchni ósemki PERFU. Umieść szkiełko nakrywkowe na roztworze.
Teraz dostosuj wiązkę światła LED, aby zapewnić równomierne oświetlenie serca. Dla każdego nagrania optycznego ustaw żądany protokół stymulacji. Włącz lampkę wzbudzenia i zbierz dane od jednej do czterech sekund w ciągu jednej do dwóch godzin.
Hałas spowodowany wyciekiem barwnika położy kres eksperymentowi. Następnie umyj system wodą dejonizowaną. Następnie 70% etanolu i zakończ kolejnym płukaniem wodą dejonizowaną.
Za pomocą opisanego protokołu można rozdzielić spektralną separację sygnału potencjału transbłonowego i retikulum sarkoplazmatycznego lub sygnału wapniowego SR. Zarejestrowano również ślady optyczne podczas stymulacji ciągłej. Mapy aktywacji zostały następnie skonstruowane na podstawie danych, wykreślając czas aktywacji każdego piksela.
Na wykresie izochronalnym występuje typowe opóźnienie między dwoma sygnałami od ośmiu do 10 milisekund. Możliwe było ilościowe określenie względnej zmiany rozkurczowej SR. Obciążenie wapniem i skurczowe SR amplitudy uwalniania wapnia w różnych cyklach stymulacji. Po zastosowaniu agonisty receptora beta-adrenergicznego, izoproterenolu, obserwowano patologiczne obchodzenie się z wapniem SR.
Czerwone strzałki wskazują na wyraźny wyciek wapnia z sr. W tych warunkach może wystąpić wyzwalanie potencjałów czynnościowych za pośrednictwem wapnia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak wykonać jednoczesne mapowanie optyczne potencjału transbłonowego i sygnałów wapniowych SR w nienaruszonym sercu królika Lang Endorf Perfused.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego i wolnego wapnia wewnątrz sarkoplazmatycznego siateczki w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa. Ta metoda umożliwia bezpośrednie obserwowanie i ilościowe określenie tych dynamiki w całym sercu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Fizjologia układu krążenia
- Techniki obrazowania optycznego
Tło
- Rozumienie dynamiki serca jest kluczowe dla badań funkcji serca.
- Potencjał transbłonowy i poziomy wapnia są kluczowymi wskaźnikami zdrowia serca.
- Mapowanie optyczne zapewnia nieinwazyjną metodę badania tych parametrów.
- Technika perfuzji Langendorffa umożliwia badania izolowanych serc.
Cel badania
- Opracowanie metody jednoczesnego optycznego mapowania V m i SR Ca 2+.
- Poprawa rozumienia elektrofizjologii serca.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Stosowane metody
- Wycięcie serca królika i wszczepienie cewnika do aorta dla perfuzji wstecznej.
- Zastosowanie odłącznika pobudzenia-skurcz do wyeliminowania skurczu.
- Przejście na recylkulacyjną pętlę perfuzji z wskaźnikiem wapnia o niskiej powinowactwom.
- Podgrzanie serca i dodanie barwnika czułego na napięcie do mapowania optycznego.
Główne wyniki
- Pomyślne jednoczesne pomiary dynamiki V m i SR Ca 2+.
- Wykazanie skuteczności techniki mapowania optycznego.
- Zapewniliśmy wgląd w związek między wapniem a potencjałem transbłonowym.
- Ustanowiliśmy niezawodny protokół na przyszłe badania.
Konkluzje
- Technika podwójnego mapowania optycznego jest skuteczna w badaniu dynamiki serca.
- Ta metoda może poszerzyć badania nad fizjologią serca.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badania nad chorobami serca.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables direct, simultaneous measurement of intra-sarcoplasmic reticulum calcium and transmembrane potential in intact cardiac tissue, providing mechanistic insight into excitation-contraction coupling and arrhythmogenic substrates. By resolving spatial and temporal dynamics of SR Ca2+ handling in a physiologically relevant model, it supports target validation and de-risking in cardiovascular drug discovery. The approach bridges molecular mechanisms with tissue-level phenotypes, enhancing predictive confidence in preclinical safety and efficacy assessments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying SR Ca2+ load and release dynamics under pathophysiological stress, such as beta-adrenergic stimulation.
- Operational Value: Enables functional validation of targets involved in calcium handling, reducing mechanistic ambiguity in early target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with dual-readout capability for assessing compound effects on both electrophysiology and calcium homeostasis.
- Operational Value: Supports assay standardization through simultaneous Vm and SR Ca2+ monitoring, improving reproducibility in ion channel and calcium modulator screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links molecular perturbations to tissue-level arrhythmogenic phenotypes, enabling disease-relevant system modeling for translational biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying pro-arrhythmic signals early in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical safety profiling, particularly for compounds affecting cardiac ion channels or calcium regulatory proteins.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing bidirectional relationships between Vm and SR Ca2+ under pacing and pharmacological challenge.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs that allow comparison of test compounds against control conditions in a standardized format.
- Analytics: Provides high-resolution spatiotemporal measurements of calcium transients and action potential dynamics, enabling comparative analysis across experimental groups.
- Translational Research: Connects findings to preclinical continuity by modeling arrhythmogenic substrates observed in disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiac safety pharmacology and mechanism-of-action studies across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of SR Ca2+ handling and its electrophysiological consequences.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via dual-parameter optical mapping in a controlled Langendorff-perfused system.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by detecting calcium-mediated arrhythmogenic triggers before costly late-stage failures.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on SR calcium stability and transmembrane stability.
Implementation Considerations
- Expertise in optical mapping, perfusion techniques, and fluorescent dye handling is required for successful signal acquisition.
- Instrumentation includes high-speed CMOS cameras, LED excitation systems, and perfusion setups capable of recirculating and large-volume modes.
- Cross-team standardization depends on consistent dye loading, temperature control, and pacing protocols across laboratories.
- Adaptation to other model systems (e.g., rat, human tissue) may require optimization of indicator concentration and perfusion parameters.
- Practical limitations include low signal amplitude of SR calcium indicators, necessitating careful dye loading and minimization of cytosolic interference.
