Name: Odkrywanie przyspieszenia entropii wywołanego dynamiką rozpuszczalnika w enzymach błonowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj dynamikę rozpuszczalnika w katalizie enzymatycznej błonowych cyklaz triterpenowych. Wykorzystaj symulacje dynamiki molekularnej i analizę tuneli CAVER 3.0 do inżynierii kanałów transportu wody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szwedzka Rada ds. Badań Naukowych (VR) jest bardzo wdzięczna za finansowe wsparcie tej pracy przez grant dla młodych badaczy #621-2013-5138. Centrum PDC for High Performance Computing w Królewskim Instytucie Technologicznym KTH jest uznawane za zapewniające wsparcie obliczeniowe.

1. In Silico Modelowanie komputerowe
<ol>
	<li>Pobierz strukturę PDB białka z banku danych białek (PDB). Przygotuj strukturę, usuwając nadmiarowe podjednostki, a następnie dodając brakujące atomy wodoru oraz jawny rozpuszczalnik, korzystając z eksperymentu „Cell Neutralization and pKa prediction” w programie YASARA16. W przypadku związanych z błoną cyklaz triterpenowych odpowiednie wymiary pudełka z wodą wynoszą 91x67x77 Å. Ręcznie dostosuj stan protonowania katalitycznie aktywnych aminokwasów. 
	Uwaga: W razie potrzeby analog substratu w pliku PDB można zamienić na rzeczywisty substrat, korzystając z polecenia „Edit|Swap|Atom”.</li>
	<li>Zminimalizuj strukturę za pomocą polecenia „Energy Minimization”, wykorzystując zestaw pól siłowych AMBER17. Zastosuj metodę particle mesh Ewald (PME)18, aby uwzględnić dalekosiężne oddziaływania elektrostatyczne. Ustaw wartość odcięcia dla oddziaływań van der Waalsa zgodnie ze standardowymi ustawieniami. 
	Uwaga: Polecenie „Energy Minimization” usuwa naprężenia konformacyjne poprzez krótką minimalizację metodą najszybszego spadku, a następnie przeprowadzane jest symulowane wyżarzanie (krok czasowy 2 fsec, prędkości atomów redukowane o 0,9 co 10ty krok) aż do osiągnięcia zbieżności (t.j. poprawa energii o mniej niż 0,012 kcal/mol na atom w ciągu 200 kroków).</li>
</ol>
2. Model solwatacji centrum aktywnego i dostępu wody
<ol>
	<li>Po symulowanym wyżarzaniu przeprowadź 20 nsec trajektorię dynamiki molekularnej (MD) i wygeneruj co najmniej 10 migawek za pomocą polecenia „File|Save As|Simulation Snapshot”, a następnie „Simulation On”. Przeprowadź symulacje na standardowym komputerze z zastosowaniem okresowych warunków brzegowych wewnątrz zespołu kanonicznego. Utrzymuj temperaturę na poziomie 298 K, korzystając z termostatu Berendsena.</li>
	<li>Przygotuj migawki uzyskane w punkcie 2.1, usuwając wszystkie cząsteczki wody oraz ewentualne ligandy/substraty za pomocą polecenia „Edit|Delete|Residue”. Nałóż każdą migawkę indywidualnie na oryginalną strukturę PDB za pomocą polecenia „Superpose|Object”, aby upewnić się, że wszystkie struktury znajdują się w tej samej pozycji przestrzennej. Zapisz każdą migawkę przygotowaną w ten sposób jako nowy plik PDB (korzystając z polecenia „File|Save as|PDB”). 
	Uwaga: Dla doświadczonych modelarzy: Napisz skrypt automatyzujący ten proces zgodnie z szablonem podanym w Supplementary Code File 1.</li>
	<li>Wykorzystaj przygotowane migawki (PDB) z punktu 2.2, które zostały wyrównane w przestrzeni 3D, jako dane wejściowe do oprogramowania CAVER 3.019. W przypadku analizy ograniczonej liczby migawek uruchom program CAVER na standardowym komputerze. Użyj promienia sondy wynoszącego 0.7 Å19, aby zapewnić wykrycie tuneli specyficznych dla transportu cząsteczek wody.</li>
	<li>Wizualizuj tunele wygenerowane przez CAVER 3.0 w oprogramowaniu do grafiki molekularnej. W celu ułatwienia wizualizacji tuneli użyj makra przedstawionego w Supplementary Code File 2.</li>
</ol>
3. In Silico Inżynieria enzymatyczna w celu modyfikacji wzorców i dynamiki wody
<ol>
	<li>Zidentyfikuj najwyżej ocenione tunele na podstawie nagłówka „ID” wymienionego w pliku wyjściowym „summary.txt” wygenerowanym przez oprogramowanie CAVER 3.0.</li>
	<li>Zidentyfikuj aminokwasy wyściełające najwyżej ocenione tunele (3.1), które poprzez inspekcję wizualną (z wykorzystaniem modelu uzyskanego w punkcie 2.4) wykazują krótki łańcuch boczny skierowany do wnętrza kanału. Zidentyfikuj pojedyncze substytucje aminokwasowe, które zablokują tunel poprzez zwiększenie zawady sterycznej, korzystając z polecenia „Swap Residue”. Potwierdź, że tunel jest zablokowany, przeprowadzając inspekcję wizualną, a następnie powtarzając kroki 1.2-3.1 protokołu.</li>
</ol>
4. Ekspresja zmutowanych genów
<ol>
	<li>Wprowadź mutacje w genie typu dzikiego za pomocą PCR mutacyjnego z zastosowaniem starterów niepokrywających się20.</li>
	<li>Dodaj plazmidowe DNA zawierające interesujący gen do probówek z kompetentnymi komórkami odpowiedniego szczepu klonującego i inkubuj na lodzie przez 30 min. Przeprowadź transformację szokiem termicznym przez 45 s w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C. Dodaj 500 µl świeżej pożywki bogatej (2YT, 16 g/L tryptony, 10 g/L ekstraktu z drożdży, 5 g/L NaCl) i inkubuj w 37 °C przy 200 rpm przez 45 min. Wykonaj selekcję, wysiewając przekształcone komórki na płytki agarowe z dodatkiem odpowiednich antybiotyków.</li>
	<li>Po weryfikacji sekwencji DNA zmutowanego genu, wprowadź plazmidowe DNA do szczepu ekspresyjnego, stosując szok termiczny zgodnie z powyższym opisem. Do ekspresji związanych z błoną cyklaz triterpenowych użyj szczepu BL21(DE3).</li>
	<li>Zaszczep 5 ml kultury nocnej w 37 °C szczepu ekspresyjnego w pożywce 2YT z dodatkiem odpowiednich antybiotyków.</li>
	<li>Zaszczep 2 L kolbę z przegrodami zawierającą 300 ml pożywki 2YT z dodatkiem odpowiednich antybiotyków do końcowej wartości OD 0,05-0,09 (mierzonej przy 600 nm). Po indukcji przy OD 0,6-0,8 i ekspresji białka, zamroź pellet komórkowy i przechowuj w -80 °C.
	<ol>
		<li>W przypadku cyklaz triterpenowych związanych z błoną w wektorze pD861, indukuj przy użyciu 0,5 do 2 mM ramnozy i prowadź ekspresję przez 4 h w 37 °C, aby uzyskać wysoką wydajność białka21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ekstrakcja błon za pomocą zwykłej wirówki i oczyszczanie białek
<ol>
	<li>Przygotować następujące bufory: bufor do resuspensji (100 mM fosforanu potasu, pH 7,5 z dodatkiem tabletek z inhibitorami proteaz), bufor z detergentem (1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fosforanu potasu, pH 7,5) oraz bufor reakcyjny (0,2% Triton X-100, 50 mM fosforanu potasu, pH 7,5).
	<ol>
		<li>W przypadku cyklaz skwalen-hopenowych lub innych enzymów związanych z błoną o niższym optimum pH, fosforan potasu w buforze do resuspensji należy zastąpić cytrynianem. Dla takich enzymów należy stosować następujące bufory: bufor z detergentem (1% Triton X-100, 60 mM cytrynianu, pH 6,0) oraz bufor reakcyjny (0,2% Triton-X 100, 60 mM cytrynianu, pH 6,0). 
		Uwaga: Jeśli do oczyszczania stosowany jest znacznik His-tag, należy uzupełnić bufor do resuspensji o 20 mM imidazolu (stężenie końcowe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zważyć zamrożony osad komórkowy w zlewce szklanej. Resuspender komórki w buforze do resuspensji za pomocą homogenizatora do końcowego stężenia 0,3 g komórek/ml. Zlizować resuspenderowane komórki poprzez sonikację z amplitudą 80% i impulsem 1 s włączenia i 1 s wyłączenia. Zastosować trzy powtarzające się cykle po 50 s każdy.</li>
	<li>Dodać bufor z detergentem do końcowego stężenia 0,2% (v/v) detergentu. Równoważyć poprzez mieszanie obrotowe w temperaturze 4 °C przez 1 h. Odzyskać frakcję białek błonowych, pobierając supernatant po pojedynczym etapie wirowania przy 39 000 x g przez 50 min w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: W przypadku oczyszczania za pomocą His-tagu należy dodać około 1,5 ml agarozy Ni-NTA/g komórek i inkubować przez 1 h.</li>
	<li>Przeprowadzić pierwszy etap oczyszczania za pomocą wymiany jonowej lub oczyszczania za pomocą His-tagu21. Bufory do równoważenia i elucji należy uzupełnić o 0,2% Triton X-100. Skoncentrować oczyszczone białko pięciokrotnie, używając jednostek filtracyjnych do wirowania z progiem odcięcia 10 kDa. 
	Uwaga: Wielkość miceli Triton X-100 prowadzi do wzrostu stężenia detergentu do stężenia końcowego wynoszącego około 1%.</li>
	<li>Zakończyć oczyszczanie etapem polerowania za pomocą filtracji żelowej, wykorzystując skoncentrowane białko i macierz kompatybilną z zakresem frakcjonowania dla białek globularnych 2 × 104-8 × 106. Jako bufor roboczy zastosować bufor reakcyjny. Ilość oczyszczonego białka zmierzyć przy użyciu zestawu Bradford Ultra zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
6. Kinetyka
<ol>
	<li>Przygotuj świeży 5 mM roztwór zapasu substratu w buforze reakcyjnym. Uzyskaj jednorodną emulsję poprzez sonikację przy amplitudzie 30% przez 2-5 min.</li>
	<li>Wyrównaj temperaturę w termomikserze do pożądanej temperatury reakcji. Zweryfikuj temperaturę wewnątrz szklanej fiolki zawierającej wodę za pomocą zewnętrznego termometru.</li>
	<li>W przypadku kinetyki dla pojedynczego substratu, rozcieńcz zemulgowany substrat w co najmniej pięciu szklanych fiolkach do tej samej końcowej koncentracji substratu.
	<ol>
		<li>Dla kinetyki względnej w jednym naczyniu z wieloma substratami, przygotuj co najmniej pięć identycznych szklanych fiolek, mieszając wszystkie substraty w każdej fiolce. W przypadku hydrofobowych triterpenów stosuj końcowe stężenia substratu w zakresie 10-200 µM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preinkubuj szklane fiolki w termomikserze przez 10 min. Rozpocznij reakcję poprzez dodanie enzymu. Odpowiednia całkowita objętość reakcji wynosi 1 ml. Stosuj prędkość mieszania co najmniej 1,200 rpm.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcje w różnych punktach czasowych, dodając 500 µl octanu etylu z dodatkiem 100 µM decanolu jako standardu wewnętrznego do całkowania.</li>
</ol>
7. Ekstrakcja i analiza termodynamiczna
<ol>
	<li>Ekstrahuj mieszaniny reakcyjne poprzez mieszanie w wortexie i energiczne wstrząsanie szklanych fiolek ręcznie przez 1 min. Odwiruj szklane fiolki przy 9,600 x g w wirówce stołowej przez 10 min w RT. Przenieś górną warstwę (fazę organiczną) do pustej probówki. Dodaj kolejne 500 µl rozpuszczalnika do ekstrakcji do probówek reakcyjnych i powtórz procedurę ekstrakcji.</li>
	<li>Osusz wyekstrahowane mieszaniny reakcyjne za pomocą Na2SO4. Mieszaj w wortexie przez 5 s i pozostaw probówki na 10 min. Wykonaj końcowy etap wirowania przy 9,600 x g przez 1 min w RT przy użyciu wirówki stołowej. Przenieś wyekstrahowane próbki do fiolek do chromatografii gazowej (GC).</li>
	<li>Powtórz kroki opisane w punktach 6.1-7.2 dla każdego interesującego wariantu enzymu, stosując co najmniej cztery różne początkowe stężenia substratu (dla kinetyki pojedynczego substratu) oraz cztery różne temperatury (zarówno dla kinetyki pojedynczego substratu, jak i kinetyki konkurencyjnej).</li>
	<li>Przeprowadź analizę GC zgodnie z wcześniejszym opisem3. Do analizy hydrofobowych produktów pięciopierścieniowych użyj kolumny niepolarnej. Ustaw początkową temperaturę pieca na 120 °C i zastosuj gradient temperatury 5 °C/min, w zależności od produktów i kolumny.</li>
	<li>Zintegruj powierzchnie pików produktów i przelicz powierzchnie pików produktów na odpowiadające im stężenia produktów, wykorzystując powierzchnię standardu integracyjnego (odpowiadającego 100 µM). Przedstaw zależność stężenia każdego produktu ([P]) od czasu reakcji (t). Przeprowadź regresję liniową punktów danych odpowiadających konwersji poniżej 10%. Początkowa szybkość reakcji (V0) jest określana przez nachylenie dopasowanej linii zgodnie z równaniem: 
	<img alt="Równanie stanu równowagi statycznej, V₀=∂[P]/∂t, wzór do analizy naukowej." src="/files/ftp_upload/53168/53168equation1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
	Uwaga: W przypadku względnej kinetyki one-pot z wieloma substratami, V0 jest szybkością początkową dla konkretnego substratu pod wpływem innych substratów.</li>
	<li>Dla kinetyki pojedynczego substratu przedstaw zależność V0/[E] od odpowiadających im stężeń substratu. Pozorna wartość kcat/KM jest określana przez nachylenie liniowej części wykresu zgodnie z równaniem: 
	<img alt="Równanie Michaelisa-Mentena, kinetyczna aktywność enzymu, wzór na szybkość, badanie kinetyki biologicznej." src="/files/ftp_upload/53168/53168equation2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2"> 
	[S] to stężenie substratu, a [E] stężenie enzymu użytego w transformacji. kcat/KM odpowiada stosunkowi stałej katalitycznej do stałej Michaelisa. Powtórz analizę dla każdej temperatury i każdego wariantu enzymu.</li>
	<li>Dla kinetyki pojedynczego substratu przeprowadź analizę termodynamiczną zgodnie z teorią stanu przejściowego22 
	<img alt="Wzór kinetyki chemicznej, równanie katalizy enzymatycznej, analiza parametrów termodynamicznych." src="/files/ftp_upload/53168/53168equation3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3"> 
	kb to stała Boltzmanna, h stała Plancka, T temperatura w kelwinach, a R stała gazowa. Przeprowadź analizę regresji liniowej wykresu ln((kcat/KM)/((kb*T)/h))) w funkcji 1/T. Entalpia aktywacji (ΔH‡) jest określana jako (-nachylenie)*R, a entropia aktywacji (ΔS‡) jako (punkt przecięcia)*R. 
	Uwaga: Analogicznie, analizę przy nasycającym stężeniu substratu można przeprowadzić, stosując kcat jako stałą szybkości w równaniu 3.</li>
	<li>Dla względnej kinetyki one-pot z wieloma substratami wyznacz względne pozorne wartości 
	kcat/KM z23: 
	(kcat/KM)A/(kcat/KM)B = V0,A/V0,B*[B]/[A] (4) 
	gdzie V0,A odnosi się do szybkości początkowej dla substratu A w konkurencji z substratem B.</li>
	<li>Dla względnej kinetyki one-pot z wieloma substratami wyznacz względne termodynamiczne parametry aktywacji dla B w porównaniu do A jako referencji za pomocą regresji nieliniowej: 
	<img alt="Równanie kinetyki enzymatycznej, obliczanie ΔG‡, stosunek ln(kcat/KM), wzór, proces biochemiczny." src="/files/ftp_upload/53168/53168equation5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 5"></li>
	<li>Oblicz bezwzględne parametry aktywacji dla substratu B z entalpii i entropii aktywacji związku referencyjnego A: 
	<img alt="Równania termodynamiczne, reakcje chemiczne, zmiany entalpii i entropii, analiza naukowa." src="/files/ftp_upload/53168/53168equation6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 6"></li>
</ol>

<ol><li>Ball, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+as+an+active+constituent+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Water as an active constituent in cell biology.</a> Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).</li>
<li>Snyder, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+hydrophobic+effect+in+the+biomolecular+recognition+of+arylsulfonamides+by+carbonic+anhydrase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).</li>
<li>Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+is+Key+to+the+Formation+of+Pentacyclic+Terpenoids+by+Enzyme-Catalyzed+Polycyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).</li>
<li>Persson, F., Halle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Access+to+the+Protein+Interior%3A+Simulation+versus+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).</li>
<li>Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Active-Site+Solvent+in+the+Thermodynamics+of+Factor+Xa+Ligand+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).</li>
<li>Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+Displacing+Water+Molecules+from+Protein+Binding+Sites%3A+Consequences+for+Ligand+Optimization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).</li>
<li>Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+water+transfer+energy+to+protein-ligand+association+and+dissociation+barriers%3A+Watermap+analysis+of+a+series+of+p38%C3%8E%C2%B1+MAP+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3A+Struct.%2C+Funct.%2C+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38Î± MAP kinase inhibitors.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).</li>
<li>Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+for+molecular+recognition+exploiting+hydrophobic+enclosure+in+protein-ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).</li>
<li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-Mediated+Recognition+of+Simple+Alkyl+Chains+by+Heart-Type+Fatty-Acid-Binding+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).</li>
<li>Pavlova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+dehalogenase+access+tunnels+as+a+strategy+for+degrading+an+anthropogenic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).</li>
<li>Breiten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+Networks+Contribute+to+Enthalpy%2FEntropy+Compensation+in+Protein-Ligand+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).</li>
<li>Oldfield, E., Lin, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terpene+biosynthesis%3A+Modularity+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Terpene biosynthesis: Modularity rules.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 51 (5), 1124-1137 (2012).</li>
<li>Henzler-Wildman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchy+of+timescales+in+protein+dynamics+is+linked+to+enzyme+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis.</a> Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).</li>
<li>Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+activity+regulation+by+conformational+entropy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein activity regulation by conformational entropy.</a> Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).</li>
<li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+origin+of+the+catalytic+power+of+enzymes+and+the+role+of+preorganized+active+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites.</a> J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).</li>
<li>Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+optimal+use+of+empirical+energy+functions%3A+Force-field+parameterization+in+crystal+space%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3A+Struct.%2C+Funct.%2C+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).</li>
<li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point-charge+force+field+for+molecular+mechanics+simulations+of+proteins+based+on+condensed-phase+quantum+mechanical+calculations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations.</a> J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).</li>
<li>Essmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+smooth+particle+mesh+Ewald+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">A smooth particle mesh Ewald method.</a> J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).</li>
<li>Chovancova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAVER+3.0%3A+a+tool+for+the+analysis+of+transport+pathways+in+dynamic+protein+structures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures.</a> PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708(2012).</li>
<li>Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+and+site-saturation+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.</a> Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).</li>
<li>Kürten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+functional+human+oxidosqualene+cyclase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Express.+Purif%22%5BJournal%5D)">Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli.</a> Protein Express. Purif. , (2015).</li>
<li>Eyring, H., Stearn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+the+theory+of+absolute+reaction+rates+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">The application of the theory of absolute reaction rates to proteins.</a> Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).</li>
<li>Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein. , W.H. Freeman. (1999).</li>
<li>Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+a+squalene+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of a squalene cyclase.</a> Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%2C+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+enzymes+work%3A+analysis+by+modern+rate+theory+and+computer+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations.</a> Science. 303 (5655), 186-195 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytycznymi etapami w celu uzyskania wysokiej jakości eksperymentalnych danych termodynamicznych dla wariantów enzymów błonowych i tuneli typu dzikiego są: 1) wygenerowanie modelu komputerowego; 2) jednorodnie oczyszczone białka; 3) emulgowane substraty; 4) kontrola temperatury podczas kinetyki; 5) ekstrakcja mieszanin reakcyjnych przy użyciu wzorca wewnętrznego.
Generowanie modelu komputerowego jest znacznie ułatwione dzięki zastosowaniu oprogramowania z przyjaznym dla użytkownika interfejsem, które obsługuje różne platformy. W związku z tym protokół ten opiera się na pakiecie modelowania YASARA16 , aby nasza strategia była dostępna nawet dla osób niebędących ekspertami w dziedzinie modelowania. Najlepiej byłoby, gdyby model komputerowy do identyfikacji tunelu wodnego opierał się na strukturze krystalicznej enzymu będącego przedmiotem zainteresowania24. W tym celu bardzo korzystne jest bogactwo struktur krystalicznych dostępnych w banku danych o białkach. Z naszego doświadczenia wynika, że kluczowym aspektem w skutecznym przygotowaniu szablonów do identyfikacji tuneli jest utrzymanie wód krystalograficznych. Równie ważne jest użycie solwatowanego zestawu enzymatycznego podczas wykonywania symulacji dynamiki molekularnej, które można uruchomić na zwykłym komputerze. Cyklaza triterpenowa z Alicyclobacillus acidocaldarius jest stabilna w wodzie podczas symulacji MD3. Jednak przechowywanie detergentów krystalograficznych i/lub stosowanie naśladowców błon komórkowych byłoby być może wymagane w przypadku potencjalnie niestabilnych enzymów, aby umożliwić rozszerzone symulacje MD. Przewiduje się, że zminimalizowana struktura krystaliczna bardzo trudnych celów może dostarczyć ważnych informacji mechanistycznych przy użyciu protokołu, chociaż nie uchwyci to dynamicznych aspektów organizacji tunelu.
CAVER19 w trybie podstawowym, z pojedynczym lub ograniczoną liczbą migawek jako danymi wejściowymi, może być używany przez laików na standardowym laptopie. Opierając się na naszym doświadczeniu3, tunele o promieniu wąskiego gardła (tj. promieniu w najwęższym punkcie) mniejszym niż 1 A mogą być bardzo istotne dla wody, zwłaszcza jeśli krystalograficzne cząsteczki wody znajdują się w przewidywanym tunelu (rysunek 1, w środku po lewej). Z drugiej strony, większy promień wąskiego gardła może oznaczać tunel do transportu substratu do i z miejsca aktywnego10. Skrypt w pliku kodu uzupełniającego 2 może być używany przez osoby niebędące ekspertami do wizualizacji przewidywanych tuneli. Przyszłe eksperymenty pokażą, czy modele homologii będą miały wystarczająco wysoką rozdzielczość, aby umożliwić atomistyczne badanie sieci i dynamiki wody. Istotne byłoby również rzucenie światła na to, w jaki sposób przeprowadzanie symulacji dynamiki molekularnej, z ligandem obecnym w miejscu aktywnym i bez niego, wpływa na proces identyfikacji tunelu.
Kinetyka białek błonowych może stanowić ogromne wyzwanie25. Protokół ten opiera się na prostym protokole ekstrakcji membranowej w celu uzyskania enzymu błonowego bez użycia drogiego sprzętu, takiego jak ultrawirówka. Zastosowanie filtracji żelowej jako końcowego etapu polerowania usuwa potencjalne resztkowe cząstki membrany i pozwala na zdefiniowanie odpowiedniego środowiska detergentu25.
Kluczowym aspektem w osiąganiu powtarzalnych wyników kinetycznych z protokołu jest emulgowanie roztworu podstawowego substratu za pomocą ultradźwięków. Proste wirowanie substratów hydrofobowych rozcieńczonych w buforze reakcyjnym daje niejednorodne mieszaniny substratowo-detergentowe. Pipetowanie niezemulgowanych roztworów substratów prowadzi do nieodtwarzalnych stężeń (potwierdzonych ilościową GC), co uniemożliwia dokładne określenie dawek początkowych. Natomiast pipetowanie odpowiednio zemulgowanych roztworów podstawowych powinno skutkować analizą regresji liniowej szybkości początkowej z R2 w zakresie 0,98-0,99. Innym ważnym aspektem podłoży hydrofobowych jest pozorna rozpuszczalność substratu i dostępność w mieszaninach substratowo-detergentowych. W rzeczywistości nie było możliwe nasycenie cyklazy triterpenowej referencyjnym substratem skwalenem. Z tego powodu przedstawiono tutaj pozorne wartości kcat/kM , które mogą zawierać wkład zarówno wiązania, jak i chemii. Wykazano jednak, że chemia ogranicza szybkość dla kcat / KM dla kaskady policyklizacji prowadzonej przez cyklazy triterpenowe3.
Bardzo ważne jest sprawdzenie rzeczywistej temperatury wewnątrz szklanej fiolki reakcyjnej za pomocą zewnętrznego termometru. Mimo to pasowania liniowe mogą być gorsze w przypadku wariantów z niezbędnymi stałymi pozornymi wartościami kcat/kM w różnych temperaturach. Jest to podkreślone dla wariantu S168F (rysunek 2A) z entalpią aktywacji bliską zeru (rysunek 2B i 2C). Bardzo małe zależne od temperatury zmiany pozornego kcat/KM mogą powodować niepewność obserwowanej entropii aktywacji ΔS‡ (tj. punktu przecięcia na wykresach liniowych na rysunku 2B). Zasadniczo na obserwowaną entropię aktywacji może mieć również wpływ różna obfitość aktywnych enzymów dla różnych wariantów, które nie zostałyby wykryte przez pomiar stężenia białka. Oczekuje się, że błędy eksperymentalne zostaną zmniejszone przy mieszaniu kilku substratów w jednej doniczce. Dzieje się tak, ponieważ wszystkie różne substraty oddziałują z tą samą ilością enzymu w tych okolicznościach (równanie 4). Użycie rozpuszczalnika ekstrakcyjnego wzbogaconego wewnętrznym wzorcem jest ważne w celu uwzględnienia różnic podczas ekstrakcji i/lub wstrzykiwania GC.
Teoria stanu przejściowego jest z powodzeniem stosowana w enzymologii26. Te ważne ramy teoretyczne zostały pierwotnie opracowane dla jednocząsteczkowych reakcji w fazie gazowej. Wykazano jednak, że enzymy działają głównie poprzez obniżenie klasycznej bariery energetycznejaktywacji 26. Współczynnik transmisji, przy założeniu, że jest tu równy jeden, może wpływać na zmierzoną entalpię aktywacji i/lub entropię. Udział tunelowania i innych nieklasycznych efektów, takich jak ponowne przejście stanu przejściowego, może w przybliżeniu 1000-krotnie przyczynić się do katalizy26 , co odpowiada około 4 kcal/mol energii. Można zauważyć, że entropia aktywacji wykazywana przez enzym typu dzikiego (16 kcal/mol w 328 K, rysunek 2C) jest znacznie większa niż takie nieklasyczne efekty spowodowane niejednorodnym współczynnikiem transmisji. Wpływ współczynnika transmisji powinien się zmniejszać przy porównaniu parametrów termodynamicznych aktywacji dla wariantów typu dzikiego i tunelowego z wykorzystaniem protokołu.
Swobodna energia aktywacji Gibbsa (ΔG‡) składa się zarówno z członu entalpicznego (ΔH‡), jak i entropicznego (-T*ΔS‡). Reorganizacja rozpuszczalnika w enzymach podczas katalizy może wpływać na oba parametry. Oczekuje się, że obecny protokół ułatwi badanie tych zjawisk poprzez zgromadzenie zestawu odpowiednich i przyjaznych dla użytkownika narzędzi obliczeniowych in silico z niezbędnymi biofizycznymi ramami eksperymentalnymi. Przewiduje się, że metoda ta będzie przydatna do badania wielu procesów enzymatycznych, w tym katalizy przez enzymy związane z błoną.

Woda stanowi kamień węgielny chemii życia1. Wzorce wodne i solwatacja miejsc aktywnych enzymu wpływają zarówno na entalpię, jak i entropię wiązania liganda1,2 ikatalizy3 w bardzo złożony sposób, wykraczając poza efekt hydrofobowy2,3. NMR4, kalorymetria2 i modelowanie molekularne solwatowanych białek zostały wykorzystane, aby rzucić światło na rolę wyraźnych cząsteczek wody w dostarczaniu siły napędowej dla asocjacji ligandów5-8, swoistości i aktywności2,9,10. W niniejszym artykule przedstawiono unikalną metodologię eksperymentalnej oceny termodynamicznego wpływu przemieszczenia rozpuszczalnika na katalizę enzymatyczną (rysunek 1). Nasza połączona strategia opiera się na wykorzystaniu symulacji komputerowych w połączeniu z inżynierią enzymatyczną i analizą termodynamiczną (rysunek 1). Pozwala to rzucić dodatkowe światło na wpływ dynamiki rozpuszczalnika na katalizę, która jest obecnie słabo poznana.
Stabilizujące oddziaływania entalpiczne, dostarczane przez wiązania wodorowe za pośrednictwem wody w miejscach aktywnych solwatowanego enzymu, mogą być kompensowane przez kary entropiczne1. Te koszty entropii są związane ze spadkiem stopni swobody wykazywanych przez cząsteczki wody zamknięte w jamach białkowych, w porównaniu z wodą w objętości5. Uwolnienie uporządkowanych cząsteczek wody może zatem zapewnić entropiczną siłę napędową dla asocjacji liganda1 i katalizy3. Kluczowym aspektem dynamiki rozpuszczalnika jest przemieszczanie się cząsteczek wody między wnętrzem białek a zewnętrznym rozpuszczalnikiem4. Towarzyszące im zmiany energii aktywacji, entalpii i entropii11 nie są w pełni zrozumiałe na poziomie molekularnym. Blokując poszczególne tunele odpowiedzialne za transport wody w enzymach, można ocenić znaczenie dynamiki rozpuszczalnika i jej udział w energii aktywacji (ryc. 1). Ponadto, przeprowadzając jednogarnkowe eksperymenty kinetyczne w różnych temperaturach, względne parametry aktywacji termodynamicznej kilku substratów można uzyskać ze zmniejszonej liczby eksperymentów (rysunek 1, po prawej). Nasza interdyscyplinarna metoda została zwalidowana pod kątem złożonych, związanych z błoną enzymów cyklazy triterpenowej, które generują terpeny wielopierścieniowe o dużym znaczeniu dla życia12. Protokół pozwala na odzyskanie dużych ilości białka błonowego (10-20 mg/L) za pomocą standardowej wirówki.
Chociaż enzymy ewoluowały w wodzie, rola rozpuszczalnika w promowaniu katalizy jest zwykle zaniedbywana. Oprócz dynamiki białek13,14, które kształtują wstępnie zorganizowane miejsca aktywne z elektrostatyczną komplementarnością do stanu przejściowego15, dynamika wody może mieć duże znaczenie dla wydajnej katalizy enzymatycznej. Poprzez wykucie kilku interdyscyplinarnych technik, naszym celem jest ułatwienie wysoce złożonych badań nad dynamiką wody i termodynamiką. Zwiększenie dostępności tych narzędzi dla społeczności naukowej doprowadzi do opracowania nowych strategii w zakresie inżynierii enzymatycznej i projektowania białek pod kątem zmienionych działań i specyfiki.

<table><tbody><tr><td>YASARA</td><td>YASARA Biosciences</td><td>http://www.yasara.org/</td> <td>Program do modelowania i symulacji molekularnej&nbsp;</td></tr><tr><td>JASKINIA&nbsp;</td><td>CaverSoft</td><td>http://caver.cz/</td> <td>Narzędzie do analizy tuneli w białkach, bezpłatna licencja do użytku akademickiego</td></tr><tr><td>Bradford Ultra</td><td>Expedeon</td><td>BFU1L, BFU05L</td><td>Oznaczanie ilościowe białka w roztworach zawierających do 1% detergentu</td></tr><tr><td>Homogenizator Potter-Elvehjem</td><td>VWR</td><td>432-0205, 432-0217</td><td>Homogenizacja zamrożonych granulek</td></tr><tr><td>komórkowych Inhibitor proteazy w tabletkach</td><td>koktajlowych Roche</td><td>4693159001</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td>Filtry odśrodkowe do stężenia białek, MWCO 10 kDa</td></tr><tr><td>Thermomixer&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Thermomixer do inkubacji próbek</td></tr></tbody></table>

odkrywanie przyspieszenia entropii wywołanego dynamiką rozpuszczalnika w enzymach błonowych

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Kataliza enzymatyczna ewoluowała w środowisku wodnym. Wpływ dynamiki rozpuszczalników na katalizę jest jednak obecnie słabo poznany i zwykle zaniedbywany. Badania dynamiki wody w enzymach i związanych z nią konsekwencji termodynamicznych są bardzo złożone i obejmowały symulacje komputerowe, eksperymenty z magnetycznym rezonansem jądrowym (NMR) i kalorymetrię. Tunele wodne, które łączą miejsce aktywne z otaczającym rozpuszczalnikiem, mają kluczowe znaczenie dla przemieszczania się i dynamiki rozpuszczalnika. Niniejszy protokół pozwala na inżynierię tych motywów dla transportu wodnego, co wpływa na specyfikę, aktywność i termodynamikę. Zapewniając ramy biofizyczne oparte na teorii i eksperymentach, przedstawiona tu metoda może być wykorzystywana przez badaczy bez wcześniejszego doświadczenia w modelowaniu komputerowym lub chemii biofizycznej. Metoda ta przyczyni się do pogłębienia naszej wiedzy na temat katalizy enzymatycznej na poziomie molekularnym poprzez pomiar zmian entalpicznych i entropicznych związanych z katalizą przez warianty enzymów z zablokowanymi tunelami wodnymi. Protokół może być stosowany do badania enzymów związanych z błoną i innych złożonych systemów. Pozwoli nam to lepiej zrozumieć znaczenie reorganizacji rozpuszczalnika w katalizie, a także zapewni nowe strategie katalityczne w projektowaniu i inżynierii białek.

Znaczenie dynamiki wody w katalizie enzymatycznej policyklizacji zostało wykazane poprzez analizę in silico i późniejszą wizualizację wykrytych tuneli (przy użyciu skryptu w uzupełniającym pliku kodu nr 2). Zgodnie z sekcją 3 protokołu stwierdzono, że S168 jest aminokwasowym „punktem zapalnym” (hot spot) wyściełającym jeden z tuneli w enzymie cyklazie triterpenowej z Alicyclobacillus acidocaldarius (Rycyna 1, środek po lewej). Wprowadzenie mutacji S168F in silico powoduje zablokowanie tunelu, co potwierdzono w drodze inspekcji wizualnej (Rycyna 1, dół po lewej).
Szybkość reakcji tworzenia produktów wielopierścieniowych przez enzym cyklazę triterpenową jest wysoce zależna od temperatury (Rysunek 2A). Zgodnie z protokołem (sekcja 4-7) stwierdzono, że pozorna wartość kcat/KM enzymu typu dzikiego dla tworzenia produktów pięciopierścieniowych wzrasta pięćdziesiąciokrotnie przy podwyższeniu temperatury o 25 °C (Rysunek 2A). Blokowanie poszczególnych tuneli poprzez wprowadzenie pojedynczej mutacji punktowej ma istotny wpływ na eksperymentalnie określone bezwzględne wartości pozornej kcat/KM , a także na ich zależność od temperatury (Rysunek 2A).
Na podstawie eksperymentalnie wyznaczonych parametrów kinetycznych, zgodnie z równaniem 3 oraz sekcją 6-7 protokołu dla kinetyki z jednym substratem, wykreślono liniowe wykresy termodynamiczne (Rysunek 2B). Bardzo duże zmiany entropii i entalpii aktywacji obserwowane dla wariantów z zablokowanymi tunelami sugerują kluczową rolę dynamiki wody w promowaniu kaskady policyklizacji (Rysunek 2C, obliczenia na podstawie Rysunka 2B). Co więcej, warianty ze zmienionymi tunelami wodnymi wykazują zmienioną energię swobodną aktywacji Gibbsa (ΔG‡=ΔH‡-T*ΔS‡, Rysunek 2B-C). Na przykład, przy 303 K wariant tunelowy S168F wykazuje energię swobodną aktywacji Gibbsa wynoszącą 14 kcal/mol w porównaniu do 16 kcal/mol dla enzymu typu dzikiego.
Zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 7, równanie 4 umożliwia obliczenie pozornych wartości kcat/KM dla dodatkowych substratów na podstawie kinetycznych eksperymentów w jednym naczyniu (Rysunek 3A). Ponadto, poprzez przeprowadzenie testu konkurencyjnego w różnych temperaturach, można sporządzić liniowy wykres termodynamiczny (równanie 5, Rysunek 3B). Analogicznie do kinetyki pojedynczego substratu, względna entalpia i entropia aktywacji dla dodatkowych substratów w porównaniu z związkiem referencyjnym są łatwo dostępne z punktu przecięcia i nachylenia dopasowań liniowych do danych eksperymentalnych. Bezwzględne wartości termodynamicznych parametrów aktywacji można ocenić poprzez dodawanie arytmetyczne, wykorzystując dane termodynamiczne przypisane do związku referencyjnego (równanie 6). Wyniki uzyskane za pomocą niniejszego protokołu wyraźnie pokazują, że warianty enzymów błonowych z zablokowanymi tunelami wodnymi wykazują zasadniczo różne termodynamiczne parametry aktywacji dla substratów o różnych rozmiarach (Rysunek 3C).
<img alt="Schemat modelowania enzymu in silico, solwatacji, ekspresji genów, ekstrakcji błonowej i analizy kinetycznej." src="/files/ftp_upload/53168/53168fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Podsumowanie protokołu: modelowanie komputerowe in silico w połączeniu z eksperymentalnym projektowaniem białek i analizą termodynamiczną pozwala na lepsze zrozumienie wpływu dynamiki rozpuszczalnika na katalizę enzymatyczną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Dane kinetyki enzymatycznej: pozorna wartość k_cat/K_M w zależności od temperatury (A, C); wykres Arrheniusa (B). Tabela, wykres." src="/files/ftp_upload/53168/53168fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Rycina 2. Termodynamiczne parametry aktywacji typu dzikiego oraz wariantów tunelowych wyznaczone z kinetyki z jednym substratem. (A) Pozorne wartości kcat/KM uzyskane z danych eksperymentalnych oraz przy użyciu równań 1 i 2. (B) Analiza termodynamiczna z wykorzystaniem teorii stanu przejściowego i dopasowania liniowego danych eksperymentalnych do równania 3. (C) Termodynamiczne parametry aktywacji obliczone z wykresów w punkcie (B). Przedstawiono uprzednio zwinięty substrat skwalen z wiązaniami utworzonymi/zerwanymi zaznaczonymi liniami przerywanymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela kinetyki enzymatycznej, wykres Arrheniusa, parametry aktywacji; analiza danych wariantów enzymów." src="/files/ftp_upload/53168/53168fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Termodynamiczne parametry aktywacji typu dzikiego oraz wariantów tunelowych dla różnych substratów. (A) Względne wartości kcat/KM uzyskane z kinetyki jednoimprezowej (one-pot) przy użyciu równania 4. (B) Wykresy termodynamiczne danych kinetycznych w różnych temperaturach przy użyciu równania 5. (C) Bezwzględne termodynamiczne parametry aktywacji obliczone zgodnie z równaniem 6 i przy wykorzystaniu substratu skwalenu z Rysunku 2 jako referencji. Wiązania tworzone/rozrywane w substratach przedstawiono jako linie przerywane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Kanały transportu cząsteczek wody w enzymach wpływają na solwatację i katalizę miejsca aktywnego. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół inżynierii tych dodatkowych motywów katalitycznych w oparciu o modelowanie komputerowe i eksperymenty in silico. Pozwoli to lepiej zrozumieć wpływ dynamiki rozpuszczalnika na katalizę enzymatyczną.

Odkrywanie przyspieszenia entropii wywołanego dynamiką rozpuszczalnika w enzymach błonowych

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

Ogólnym celem tego interdyscyplinarnego protokołu jest pogłębienie podstawowego zrozumienia wpływu dynamiki rozpuszczalnika na katalizę enzymatyczną. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biokatalizy, takie jak to, w jaki sposób reorganizacja rozpuszczalnika napędza dynamikę i katalizę enzymów.Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona inżynierię tuneli, czyli motywów transportu wody, co wpływa na specyficzność, aktywność i termodynamikę. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ interdyscyplinarne kroki są trudne do opanowania, gdyż łączą one kilka poddyscyplin nauki. Na początek pobierz strukturę PDB interesującego białka z Protein Databank.Przygotuj strukturę, usuwając nadmiarowe podjednostki, a następnie dodając brakujące atomy wodoru oraz jawny rozpuszczalnik, wykorzystując eksperyment neutralizacji komórki i przewidywania pKa w programie YASARA. W przypadku związanych z błoną cyklaz triterpenowych odpowiednie wymiary pudełka z wodą wynoszą 91 x 67 x 77 Angstroms. Stan protonowania aminokwasów katalitycznie aktywnych dostosuj ręcznie.Zminimalizuj strukturę, korzystając z polecenia minimalizacji energii przy użyciu zestawu pól siłowych AMBER. Zastosuj metodę particle mesh ewald, aby uwzględnić dalekozasięgowe oddziaływania elektrostatyczne. Ustaw wartość odcięcia dla oddziaływań van der Waalsa zgodnie ze standardowymi ustawieniami.Po przeprowadzeniu wyżarzania symulowanego oraz dynamiki molekularnej należy przygotować migawki z symulacji, usuwając wszystkie cząsteczki wody i ewentualne substraty ligandów za pomocą polecenia edit, delete, residue. Każdą migawkę należy indywidualnie nałożyć na oryginalną strukturę PDB za pomocą polecenia superpose object, aby upewnić się, że wszystkie struktury znajdują się w tej samej pozycji przestrzennej. Każdą migawkę przygotowaną w ten sposób należy zapisać jako nowy plik PDB, korzystając z polecenia file, save as, PDB.Wykorzystaj przygotowane migawki jako dane wejściowe dla oprogramowania CAVER 3.0. Zwizualizuj tunele wygenerowane przez program CAVER 3.0 w programie do grafiki molekularnej, używając makra opisanego w protokole tekstowym. Zidentyfikuj tunele o najwyższym rankingu, zgodnie z identyfikatorem nagłówka „listed” w pliku tekstowym z podsumowaniem wyników, wygenerowanym przez oprogramowanie CAVER 3.0.Wykorzystując uzyskany model, zidentyfikuj poprzez inspekcję wizualną aminokwasy wyścielające najwyżej ocenione tunele, które posiadają mały łańcuch boczny skierowany w stronę wnętrza kanału. Zidentyfikuj pojedyncze podstawienia aminokwasowe, które zablokują tunel poprzez zwiększoną zawadę steryczną, korzystając z polecenia swap residue. Zweryfikuj, czy tunel został zablokowany, najpierw poprzez inspekcję wizualną, a następnie powtarzając dotychczasowy protokół.Tutaj wprowadzony tryptofan zaznaczono kolorem purpurowym, a dla porównania przedstawiono zamienioną serynę. Przygotować bufor resuspencyjny fosforanowo-potasowy, bufor z detergentem oraz bufor reakcyjny zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W przypadku cyklaz skwalenowo-hopenowych lub innych enzymów związanych z błoną o niższym pH optymalnym, należy użyć buforu resuspencyjnego zawierającego cytrynian.Zważ zamrożony osad komórkowy w zlewce szklanej. Resuspenderuj komórki w buforze do resuspensji, używając homogenizatora, do końcowego stężenia 0,3 gram-cells/milliliter. Następnie poddaj zresuspenderowane komórki lizie poprzez sonikację z amplitudą 80% oraz impulsem trwającym jedną sekundę włączania i jedną sekundę wyłączania.Zastosuj trzy cykle powtórzeń po 50 sekund każdy. Dodaj bufor z detergentem do końcowego stężenia 0,2% detergentu. Równoważ, mieszając metodą obrotową (end-over-end), w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę.Odzyskaj frakcję białek błonowych, zachowując naddatek po pojedynczym etapie wirowania przy 39 000 gs przez 50 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj świeży, pięciomilimolowy roztwór zapasowy substratu w buforze reakcyjnym. Uzyskaj jednorodną emulsję poprzez sonikację przy amplitudzie 30% przez dwie do pięciu minut.Następnie doprowadź ThermoMixer do stanu równowagi w pożądanej temperaturze reakcji. Zweryfikuj temperaturę wewnątrz szklanej fiolki zawierającej wodę za pomocą zewnętrznego termometru. W przypadku kinetyki dla pojedynczego substratu, rozcieńcz zemulgowany substrat w co najmniej pięciu szklanych fiolkach do tej samej końcowej stężenia substratu.Podgrzej szklane fiolki w ThermoMixerze przez 10 minut. Rozpocznij reakcję poprzez dodanie enzymu. Odpowiednia całkowita objętość reakcji wynosi 1 ml.Użyj prędkości mieszania wynoszącej co najmniej 1200 RPM. Zatrzymaj reakcje w różnych punktach czasowych, dodając 500 µL octanu etylu, wzbogaconego o 100 µM decanolu jako standardu wewnętrznego do integracji. Wyekstrahuj mieszaniny reakcyjne, mieszając je na wortexie oraz intensywnie potrząsając ręcznie probówkami szklanymi przez jedną minutę.Następnie odwiruj szklane fiolki w wirówce naktórkowej z prędkością 9 600 gs przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną warstwę do pustej probówki. Dodaj kolejne 500 µL rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do probówek z reakcją i powtórz procedurę ekstrakcji.Osusz wyekstrahowane mieszaniny poreakcyjne za pomocą siarczanu sodu. Mieszaj na wortexie przez pięć sekund, a następnie pozostaw próbki w spokoju na 10 minut. Przeprowadź końcowy etap wirowania przy 9 600 gs przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, używając wirówki stołowej.Następnie przenieś wyekstrahowane próbki do fiolek do chromatografii gazowej (GC). Powtórz procedurę dla każdego interesującego wariantu enzymu, stosując co najmniej cztery różne stężenia początkowe substratu dla kinetyki z jednym substratem oraz cztery różne temperatury zarówno dla kinetyki z jednym substratem, jak i kinetyki konkurencyjnej. Po przeprowadzeniu analizy GC, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zintegruj pola powierzchni pików produktów i przelicz pola powierzchni pików produktów na odpowiadające im stężenia produktów, wykorzystując pole powierzchni standardu integracyjnego.Nanieś na wykres stężenie każdego produktu w funkcji czasu trwania reakcji. Przeprowadź regresję liniową punktów danych odpowiadających konwersji poniżej 10%. Początkowa prędkość reakcji jest określona przez nachylenie dopasowanej linii.W przypadku kinetyki względnej w jednym naczyniu (one-pot) z wieloma substratami, wyznacz względne wartości pozoru K-cat/Km, korzystając z równania zamieszczonego w protokole tekstowym, monitorując reakcję cyklizacji w czasie. Przedstawiono wpływ reorganizacji rozpuszczalnika na zależność temperaturową wartości pozornych K-cat/Km. Poniżej znajdują się reprezentatywne wyniki analizy termodynamicznej z zastosowaniem teorii stanu przejściowego oraz dopasowania liniowego danych eksperymentalnych do równania teorii stanu przejściowego dla kinetyki z jednym substratem.Wpływ dynamiki rozpuszczalnika na termodynamiczne parametry aktywacji, uzyskane z eksperymentalnej analizy termodynamicznej, jest znaczący. Warianty enzymów z upośledzonymi kanałami wodnymi wykazują fundamentalnie inną swoistość substratową, spowodowaną złożonymi zmianami w relatywnych entropiach i entalpiach aktywacji, co wykazano w niniejszej pracy. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie biokatalizy do zgłębiania roli wody w sterowaniu dynamiką i katalizą enzymatyczną, co obecnie jest słabo poznane.

unraveling-entropic-rate-acceleration-induced-solvent-dynamics

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje procedurę eksperymentalną służącą do wyznaczenia energii swobodnej Gibbsa fałdowania białek błonowych za pomocą fluorescencji tryptofanu.

Termodynamika fałdowania białek błonowych pomierzona za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej

Równowaga sedymentacji (SE) może być wykorzystana do badania interakcji białko-białko w środowisku fizjologicznym. Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie tej techniki do określenia wpływu pH na stabilność homo-pentameru utworzonego przez małe białko hydrofobowe (SH) kodowane przez ludzkiego syncytialnego wirusa oddechowego (hRSV).

Równowaga sedymentacji małego białka błonowego tworzącego oligomer: wpływ protonacji histydyny na stabilność pentamieryczną

Tutaj prezentujemy dwa ultraszybkie protokoły do rekonstytucji białek błonowych w fuzogenne proteoliposomy oraz fuzji takich proteoliposomów z docelowymi dwuwarstwami lipidowymi w celu bezdetergentowego dostarczania tych białek błonowych do dwuwarstwy pofuzyjnej. Połączenie tych podejść umożliwia szybki i łatwy w obsłudze montaż złożonych, wieloskładnikowych systemów membranowych.

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Tutaj prezentujemy protokół do badania molekularnego mechanizmu translokacji protonów przez błony lipidowe pojedynczych liposomów, używając cytochromu bo3 jako przykładu. Łącząc elektrochemię i mikroskopię fluorescencyjną, zmiany pH w świetle pojedynczych pęcherzyków, zawierających jeden lub wiele enzymów, mogą być wykrywane i analizowane indywidualnie.

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Obecny protokół opisuje metody badania struktury i dynamiki dwóch modelowych białek, które odgrywają ważną rolę w zdrowiu człowieka. Technika ta łączy laboratoryjną charakterystykę biofizyczną ze spektroskopią echa spinowego neutronów, aby uzyskać dostęp do dynamiki w skalach czasu i długości istotnych dla ruchów międzydomenowych białek.

Badanie dynamiki białek za pomocą spektroskopii neutronowego echa spinowego

Ten artykuł opisuje protokoły przygotowania próbek, redukcji danych i analizy danych w badaniach neutronowego echa spinowego (NSE) błon lipidowych. Rozsądne znakowanie lipidów deuterem umożliwia dostęp do różnych dynamik błon w mezoskopowych skalach długości i czasu, w których zachodzą ważne procesy biologiczne.

Spektroskopia neutronowego echa spinowego jako unikalna sonda do badania dynamiki błony lipidowej i interakcji błona-białko

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Różnorodność lipidów błony pod względem struktury i składu jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do procesów komórkowych i może być markerem choroby. Symulacje dynamiki molekularnej pozwalają nam badać błony i ich interakcje z biomolekułami w rozdzielczości atomowej. W tym miejscu udostępniamy protokół do budowania, uruchamiania i analizowania złożonych systemów membranowych.

Realistyczne modelowanie błon z wykorzystaniem złożonych mieszanin lipidowych w badaniach symulacyjnych

Poznaj dynamikę rozpuszczalnika w katalizie enzymatycznej błonowych cyklaz triterpenowych. Wykorzystaj symulacje dynamiki molekularnej i analizę tuneli CAVER 3.0 do inżynierii kanałów transportu wody.

Odkrywanie przyspieszenia entropii wywołanego dynamiką rozpuszczalnika w enzymach błonowych

Przeglądaj więcej filmów