Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc
26 lutego 2019
Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów dotyczące molekularnych mechanizmów przerzutów. Główną zaletą tej techniki jest to, że rekrutację komórek nowotworowych w odległym narządzie można określić ilościowo. Zacznij od użycia nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek, aby usunąć fluorescencyjne komórki raka płuc Lewisa lub LLC z ich pojemnika hodowlanego zgodnie ze standardowymi protokołami.
Przenieś powstały roztwór komórkowy do 15-mililitrowej stożkowej rurki przed odwirowaniem i odwiruj przepłukanie granulek dwa razy w pięciu mililitrach PBS na pranie. Po drugim przepłukaniu przefiltruj komórki przez sitko do komórek porowych o wielkości 40 mikrometrów i rozcieńcz zawiesinę do stężenia jeden razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Następnie załaduj komórki do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 29 i wstrzyknij 100 mikrolitrów komórek do żyły ogonowej każdego ośmio- do 10-tygodniowego samca myszy C57-Black-6.
W odpowiednim punkcie końcowym doświadczenia należy użyć nożyczek, aby usunąć skórę z brzusznej powierzchni każdej myszy i przeciąć żebra i przeponę, aby odsłonić klatkę piersiową. Użyj igły do infuzji ze skrzydełkami i rurki o rozmiarze 25G, aby przepłukać 15 mililitrów PBS przez prawą komorę i usunąć serce i grasicę. Chwytając tchawicę kleszczami, podciągnij się, preparując tkanki łączne wokół tchawicy, aby pobrać płuca.
Następnie umyj płuca w PBS i odłącz jeden płat w celu wizualizacji komórek fluorescencyjnych in situ pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aby strawić tkankę płucną, najpierw pokrój płat ogonowy w kostkę nożyczkami i umieść kawałki płuc w 10-mililitrowej strzykawce. Zamknąć strzykawkę tłokiem i zassać do niej pięć mililitrów roztworu wytrawiającego, wsuwając i wysuwając tłok z trzonu strzykawki, aż tkanka płucna zostanie rozprowadzona w całym roztworze.
Dozuj gnojowicę płucną do 50-mililitrowej probówki i traw tkankę na wytrząsarce przeciwstawnej przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 150 obr./min. Pod koniec inkubacji należy rozcierać pozostałą tkankę, aż do całkowitego rozproszenia komórek płuc, a następnie umieścić probówkę z powrotem w wytrząsarce na dodatkowe 30 minut. Następnie przefiltruj komórki przez sitko porowe o średnicy 40 mikrometrów i zbierz komórki przez odwirowanie.
Aby przeanalizować izolowane komórki płuc za pomocą cytometrii przepływowej, ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek na jedną minutę w temperaturze pokojowej i zbierz komórki przez odwirowanie. Następnie odwirować osad dwa razy w pięciu mililitrach świeżego PBS uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej na pranie. Po drugim odwirowaniu ponownie zawieś osad w jednym mililitrze świeżego PBS plus BSA i przefiltruj komórki przez nowe sitko porowe o średnicy 40 mikrometrów w celu ilościowego określenia komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej.
W płucach pojawia się wiele komórek GFP-LLC dwie godziny po wstrzyknięciu, przy czym zdecydowana większość komórek znika z płuc w ciągu 24 godzin. Należy pamiętać, że wszelkie plamki fluorescencyjne wykryte w czerwonym filtrze powinny zostać wykluczone ze zliczania komórek. Aby potwierdzić liczbę GFP-LLC w płucach, jeden z płatów można wykorzystać do analizy cytometrii przepływowej, jak pokazano.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że procedura zamrożonego skrawka jest dokładniejszą metodą obserwacji dokładnej lokalizacji komórek nowotworowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca opisuje metodę ilościowego oznaczania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w modelu zwierzęcym przerzutów nowotworowych. Technika ta umożliwia kwantyfikację rekrutacji komórek nowotworowych w odległym narządzie, dostarczając wiedzy na temat molekularnych mechanizmów przerzutowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Zrozumienie przerzutowania nowotworów jest kluczowe dla badań nad rakiem.
- Ilościowe określenie akumulacji komórek nowotworowych może dostarczyć ważnych informacji biologicznych.
- W badaniach nad progresją nowotworów powszechnie stosuje się modele zwierzęce.
- Komórki ekspresyjne białek fluorescencyjnych ułatwiają śledzenie i kwantyfikację.
Cel badania
- Opracowanie metody ilościowego oznaczania akumulacji komórek nowotworowych w płucach.
- Zbadanie rekrutacji komórek nowotworowych w modelu przerzutowym.
- Pogłębienie zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw przerzutowania.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek.
- Wirowanie i przemywanie osadów komórkowych w PBS.
- Filtrowanie komórek przez sito komórkowe o rozmiarze porów 40 µm.
- Wstrzykiwanie rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do żyły ogonowej myszy.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczną kwantyfikację akumulacji komórek nowotworowych.
- Wykazano możliwość śledzenia komórek nowotworowych in vivo.
- Uzyskano wgląd w dynamikę rekrutacji komórek nowotworowych.
- Wniesiono wkład w zrozumienie procesów metastatycznych.
Wnioski
- Ta metoda stanowi wartościowe narzędzie do badania biologii nowotworów.
- Zwiększa ona możliwość badania przerzutowania w modelach zwierzęcych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej technice w celu poszukiwania celów terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza ta umożliwia ilościową ocenę rekrutacji komórek nowotworowych do odległych narządów, co wspomaga ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków ukierunkowanych na przerzuty. Poprzez pominięcie etapów inwazji guza pierwotnego, metoda ta skupia się na oddziaływaniach ze stromą oraz zdarzeniach ekstrawasacji, które są kluczowe dla przedklinicznej walidacji celu terapeutycznego. Metoda ta zapewnia powtarzalny i skalowalny odczyt służący do oceny związków przeciwprzerzutowych in vivo.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących wpływu zrębu na przerzutowanie do odległych narządów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określenie akumulacji komórek nowotworowych w płucach po iniekcji.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez pomiar wpływu związków na dynamikę rekrutacji komórek nowotworowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Generuje zestandaryzowane, ilościowe wyniki za pomocą cytometrii przepływowej na potrzeby kampanii przesiewowych związków.
- Powtarzalność: Wykorzystuje określone stężenia komórek i objętości iniekcji, aby zapewnić spójne modelowanie przerzutów.
- Skalowalność: Kompatybilna z przetwarzaniem w płytkach wielodołkowych i analizą wysokotreściową (high-content analysis) w celu minimalizacji ryzyka związanego z celem terapeutycznym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje mikroprzewroty w płucach w celu zbadania mechanizmów kolonizacji specyficznych dla organów.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki odkryć z przedkliniczną walidacją środków przeciwwdrodowych.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Dostarcza informacji do kryteriów go/no-go na podstawie redukcji liczby znakowanych komórek nowotworowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Pozycje w kontinuum odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu po optymalizację związku wiodącego, umożliwiające ilościową ocenę związków modulujących przerzuty.
- Biologia odkrywcza: Wspiera analizę mechanistyczną oddziaływań między guzami a zrąbkiem w niszach przerzutowych.
- Przesiew: Zapewnia ilościowe odczyty oparte na fluorescencji w celu walidacji trafień w testach przerzutowania.
- Analityka: Generuje policzalne dane dotyczące komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej do analizy statystycznej i zależności dawka-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Jest zgodne ze strategiami biomarkerów poprzez śledzenie dysseminacji znakowanych komórek in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla międzyprojektowych badań nad mechanizmami przerzutowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w szlakach przerzutowania poprzez mierzalną rekrutację specyficzną dla organów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dostarczanie komórek nowotworowych i obróbkę tkanek w celu zapewnienia powtarzalnych porównań między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka w przypadku terapii celowanych w przerzuty.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o skorygowane ryzyko i przedkliniczne dane dotyczące hamowania przerzutów.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w technice wstrzykiwań do ogonowej żyły myszy oraz w metodach dysocjacji tkanek.
- Zależne od aparatury do cytometrii przepływowej oraz kontroli kompensacji fluorescencji.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów przygotowania komórek we wszystkich zespołach badawczych.
- Wiąże się z optymalizacją dawki komórek w celu uniknięcia zakłócających sygnałów wynikających z nadmiernej akumulacji w płucach.
- Ograniczone do ilościowego określania akumulacji w płucach; nie obejmuje inwazji pierwotnego guza ani późniejszego wzrostu przerzutów.
