Name: Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 28 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania komórek nowotworowych w płucach w modelu przerzutów u myszy C57-Black-6. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów molekularnych metastazy in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie procedury wykonywane na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Kobiecego Uniwersytetu Medycznego w Tokio.
1.Iniekcja do żyły ogonowej komórek raka płuc Lewisa (LLC)
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki LLC w DMEM uzupełnionym 10% FCS, w wilgotnym inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Komórki powinny zawierać fluorescencyjny system ekspresji białek (np. GFP).</li>
	<li>Usunąć komórki z naczynia hodowlanego za pomocą nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Zebrać komórki w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 3 minuty. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml PBS przez pipetowanie i odwirować probówkę (400 x g, 3 min). Następnie usunąć supernatant.
	<ol>
		<li>Powtórz ten krok prania jeszcze raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po drugim płukaniu przepuść komórki przez sitko (wielkość porów 40 μm) i ponownie zawieś w PBS, aby uzyskać końcową gęstość komórek 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,1 ml zawiesiny komórkowej (1 x 10 5 komórek, igła 29G) każdej myszy C57BL/6 (samce w wieku 8-10 tygodni) przez żyłę ogonową.</li>
</ol>
2. Izolacja płuc i liczenie komórek pod stereomikroskopem fluorescencyjnym
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez wdychanie CO2 .</li>
	<li>Usuń skórę z brzusznej powierzchni klatki piersiowej nożyczkami. Następnie odetnij żebra i przeponę, aby odsłonić klatkę piersiową. Przepłukać PBS (100 cmH2O, łącznie 15 ml) przez prawą komorę za pomocą skrzydełkowej igły do infuzji 25G i rurki.</li>
	<li>Wytnij serce i grasicę. Chwyć tchawicę kleszczami i podciągnij się, preparując nożyczkami tkanki łączne wokół tchawicy. Wypreparuj płuca i umyj je w PBS.</li>
	<li>Oderwij każdy płat i obserwuj go pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
3. Trawienie płuc
<ol>
	<li>Rozpuść 10 mg kolagenazy, 10 mg dypazy i 10 μg DNazy w 10 ml DMEM bez surowicy. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm, aby przygotować roztwór do trawienia enzymatycznego.</li>
	<li>Izolowany płat ogonowy pokrój w kostkę nożyczkami. Umieścić fragmenty płuc w strzykawce o pojemności 10 ml, a następnie tłok.</li>
	<li>Zassać roztwór wytrawiający (5 ml) do strzykawki, pociągając za tłok. Przesuwać tłok w górę i w dół, aż płuco zanurzy się w roztworze. Następnie umieść bufor płucny i wytrawiający w probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Potrząsać probówką przez 15 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce posuwisto-zwrotnej (150 obr./min). Podczas tej inkubacji płuca mogą zostać postrzępione.</li>
	<li>Pipetować w górę i w dół, aż komórki płuc zostaną całkowicie rozproszone. Potrząsać probówką przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce posuwisto-zwrotnej (150 obr./min).</li>
	<li>Przepuść komórki płuc przez sitko o wielkości 40 μm. Wiruj komórki w temperaturze 400 x g przez 3 minuty.</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa komórek płuc
<ol>
	<li>Rozpuścić 100 mg BSA w 10 ml PBS i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm, aby przygotować PBS-1% BSA.</li>
	<li>Usunąć supernatant z próbki otrzymanej w kroku 3.6 za pomocą pipety i dodać 2 ml roztworu do lizy czerwonych krwinek. Następnie wiruj komórki w temperaturze 400 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 5 ml PBS-1% BSA przez pipetowanie i odwirować probówkę (400 x g, 3 min). Odrzucić supernatant.
	<ol>
		<li>Powtórz ten krok prania jeszcze raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawieś komórki w 1 ml PBS-1% BSA i przepuść przez nowe sitko do komórek 40 μm.</li>
	<li>Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego, aby policzyć komórki nowotworowe (przy użyciu konfiguracji filtra FL1 dla GFP-LLC).</li>
</ol>

<ol><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Kaplan, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR1-positive+haematopoietic+bone+marrow+progenitors+initiate+the+pre-metastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche.</a> Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).</li>
<li>Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-mediated+upregulation+of+chemoattractants+and+recruitment+of+myeloid+cells+predetermines+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis.</a> Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).</li>
<li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S100A8-serum+amyloid+A3-TLR4+paracrine+cascade+establishes+a+pre-metastatic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+Clara+cell-mediated+homeostatic+inflammation+is+involved+in+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis.</a> Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).</li>
<li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+amyloid+A3+binds+MD-2+to+activate+p38+and+NF-%CE%BAB+pathways+in+a+MyD88-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).</li>
<li>Erler, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+lysyl+oxidase+is+a+critical+mediator+of+bone+marrow+cell+recruitment+to+form+the+premetastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche.</a> Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+vascular+destabilization+in+the+premetastatic+phase+facilitates+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis.</a> Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).</li>
<li>Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-metastatic+niche%3A+finding+common+ground%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The pre-metastatic niche: finding common ground.</a> Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).</li>
<li>Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+circulating+tumor+cells+in+breast+cancer%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast%22%5BJournal%5D)">The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review.</a> The Breast. 23, 552-560 (2014).</li>
<li>Wolf, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+CCR2+signaling+induced+by+colon+carcinoma+cells+enables+extravasation+via+the+JAK2-Stat5+and+p38MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway.</a> Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).</li>
<li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+tumours+modulate+innate+immune+signalling+to+create+pre-metastatic+vascular+hyperpermeability+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci.</a> Nature Communications. 4, 1853(2013).</li>
<li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eritoran+inhibits+S100A8-mediated+TLR4%2FMD-2+activation+and+tumor+growth+by+changing+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment.</a> Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).</li>
<li>Ieguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM12-cleaved+ephrin-A1+contributes+to+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis.</a> Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Możliwe jest wstępne leczenie myszy przeciwciałami, lekami, dietą wysokotłuszczową lub pożywką kondycjonowaną przez guz przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych. Najtrudniejszym krokiem w tym teście jest iniekcja do żyły ogonowej. Niekompletne wstrzyknięcie skutkuje niejednoznacznymi danymi. Żyła ogonowa w C57BL/6 jest szczególnie trudna do zidentyfikowania, co skutkuje nieudanymi iniekcjami. Umieszczenie myszy na poduszce grzewczej (37 °C) pomaga rozszerzyć żyłę ogonową, dzięki czemu wstrzyknięcie staje się łatwiejsze...

Przerzuty nowotworowe odpowiadają za wysoką śmiertelność w chorobach związanych z rakiem. Z punktu widzenia badań na poziomie molekularnym, przerzuty można podzielić na wiele etapów: inicjację guza w miejscu guza pierwotnego, wzrost guza pierwotnego i inwazję na otaczające tkanki, wynaczynienie, krążenie przez naczynia krwionośne, wynaczynienie w odległych narządach i ponowny wzrost guza. Każdy krok obejmuje różne zestawy cząsteczek/sygnałów1.
Dotychczasowe badania dotyczyły wydarzeń zachodzących w odległych narządach, zanim komórki nowotworowe zaczną krążyć we krwi, co jest również znane jako faza pre-przerzutowa2,3,4,5,6. Nasze badania na modelu mysim wykazały, że faza przed przerzutami ułatwia przerzuty do płuc poprzez tworzenie długotrwałych i nisko nasilonych reakcji zapalnych w płucach. Faza przed przerzutami charakteryzuje się nadmierną przepuszczalnością mikrokrążenia, rekrutacją komórek pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC) oraz regulacją w górę cząsteczek cytokinowych / chemokinowych, w tym S100A8 i SAA33,4. Doniesiono, że oksydaza lizylowa modyfikuje macierz zewnątrzkomórkową w płucach w celu rekrutacji BMDCs7. Inny raport ujawnił znaczenie Angpt2, MMP3 i MMP10 w fazie przed przerzutami8. Innymi słowy, skomplikowane interakcje między guzami pierwotnymi, szpikiem kostnym i odległymi narządami muszą być zrozumiane i odpowiednio modulowane (na przykład za pomocą leków, które celują w białka zaangażowane w te interakcje), aby zapobiec przyszłym przerzutom9. Aby uregulować fazę przedprzerzutową, należy ją najpierw uwidocznić i ocenić pod kątem interwencji diagnostycznych lub terapeutycznych. W tym miejscu przedstawiamy test rekrutacji komórek nowotworowych płuc, który umożliwia badanie fazy przedprzerzutowej w płucach.
Komórki nowotworowe bezpośrednio wstrzyknięte do naczynia krwionośnego myszy są podobne do krążących komórek nowotworowych u pacjentów z rakiem, chociaż mogą istnieć różnice między hodowanymi komórkami a krążącymi komórkami nowotworowymi. Krążące komórki nowotworowe same ulegają pewnym charakterystycznym zmianom, gdy wchodzą do krążenia z guza pierwotnego. Niemniej jednak hodowane komórki mogą tworzyć guzy u myszy z niedoborem odporności, gdy zostaną wstrzyknięte do żyły ogonowej. Dodatkowo, w systemie modelu mysiego, można zastosować komórki nowotworowe znakowane fluorescencją, które umożliwiają śledzenie tych komórek w organizmie. Zachowanie krążących komórek nowotworowych ma kluczowe znaczenie, ponieważ określają one ostateczne konsekwencje u pacjentów z rakiem10. Krew nie jest dobrym miejscem do przetrwania komórek nowotworowych2. Muszą uciec przed atakiem układu odpornościowego gospodarza i potrzebują sygnałów antyapoptotycznych, aby zapobiec apoptozie z powodu braku wsparcia fizycznego. Komórki nowotworowe o większej zdolności inicjacji guza w miejscach przerzutów generują więcej guzków nowotworowych. Jeśli komórki nowotworowe wykazują specyficzny tropizm narządowy, należy zaobserwować przerzuty w tych konkretnych narządach. W tym teście nie uwzględniono początkowych etapów kaskady przerzutowej (wzrost i inwazja guza pierwotnego), dlatego skupiono się na interakcji między krążącymi komórkami nowotworowymi a komórkami zrębu (komórkami śródbłonka, komórkami nabłonkowymi i komórkami krwi). W konwencjonalnych testach iniekcji komórek nowotworowych naukowcy muszą poczekać, aż guzki nowotworowe urosną do namacalnych rozmiarów, aby wykryć przerzuty. W takim przypadku nie można określić ilościowo dokładnej liczby komórek nowotworowych w naczyniu krwionośnym. Dodatkowo proces ten obejmuje fazę odrastania guza, co wskazuje, że inne czynniki w komórkach nowotworowych mogą wpływać na wynik.
Liczenie oznaczonych komórek nowotworowych pod mikroskopem stereoskopowym fluorescencji jest prostym procesem. Mikroskop stereoskopowy zapewnia szerokie pole widzenia, dzięki czemu można zeskanować całe płuco. Cytometria przepływowa jest również przydatnym narzędziem, które natychmiast podaje dokładną liczbę komórek nowotworowych w tkance. Możliwe jest również liczenie komórek fluorescencyjnych w tkance pod mikroskopem konfokalnym, które wyświetla najdokładniejsze obrazy przerzutowych komórek nowotworowych, ale jest czasochłonne i może dawać stronnicze wyniki, jeśli liczony jest tylko wybrany obszar. Ostatecznym celem tego testu jest zaobserwowanie, jak łatwo komórki nowotworowe gromadzą się w płucach. Jak wspomniano wcześniej3,4, jeśli płuca są w fazie przedprzerzutowej z powodu sygnalizacji zapalnej z guza pierwotnego, wstrzyknięte komórki nowotworowe są podatne na gromadzenie się w płucach, co oznacza większe szanse na przerzuty do płuc. Inne schorzenia (reumatoidalne zapalenie stawów, astma itp.) oraz ich leczenie środkami przeciwzapalnymi (takimi jak anty-TNFα) mogą osłabić przerzuty do płuc. W związku z tym wnioskujemy, że ten test jest potężnym narzędziem do oceny możliwości przerzutów do płuc.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>bez wapnia, bez magnezu</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td>śladowa ilość</td></tr><tr><td>buforu do lizy RBC</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>BD</td><td>352340</td><td>siatka 40 mikrometrów</td></tr><tr><td>Zestaw do etykietowania fluorescencyjnego</td><td>Sigma</td><td>MIN26-KIT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; M Filtr strzykawkowy</td><td>Sartorius</td><td>17597K</td><td></td></tr><tr><td>OCT związek</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>4% roztwór buforowy fosforanu paraformaldehydu</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr></tbody></table>

test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Aby zbadać mechanizmy molekularne rządzące przerzutami nowotworowymi, zaproponowano różne testy z wykorzystaniem myszy jako zwierzęcia modelowego. Tutaj pokazujemy prosty test do oceny wynaczynienia komórek nowotworowych lub mikroprzerzutów. W tym teście komórki nowotworowe zostały wstrzyknięte przez żyłę ogonową, a po krótkim czasie płuca zostały wypreparowane i strawione w celu zliczenia nagromadzonych znakowanych komórek nowotworowych. Test ten pomija początkowy etap inwazji guza pierwotnego do naczynia krwionośnego i ułatwia badanie zdarzeń w odległym narządzie, w którym dochodzi do przerzutów guza. Liczba komórek wstrzykiwanych do naczynia krwionośnego może być zoptymalizowana w celu zaobserwowania ograniczonej liczby przerzutów. Doniesiono, że komórki zrębu w odległym narządzie przyczyniają się do przerzutów. W związku z tym test ten może być użytecznym narzędziem do badania potencjalnych leków terapeutycznych lub urządzeń do zapobiegania przerzutom nowotworowym.

Płuca wykazują obecność wielu komórek GFP-LLC 2 h po wtryskiwaniu (Rysunek 1A). Należy zauważyć, że punkty fluorescencyjne wykryte również w filtrze czerwonym powinny zostać wykluczone z obliczeń liczby komórek. Przeważająca większość komórek LLC znika z płuc 24 h po wtryskiwaniu (Rysunek 1C).
Aby potwierdzić liczbę komórek GFP-LLC w płucach, jeden z płatów można wykorz...

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów dotyczące molekularnych mechanizmów przerzutowania. Główną zaletą tej techniki jest możliwość ilościowego określenia rekrutacji komórek nowotworowych w odległym narządzie. Należy rozpocząć od użycia nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek w celu usunięcia komórek raka płuc Lewisa (LLC) wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego z naczynia hodowlanego, zgodnie ze standardowymi protokołami.Przenieś otrzymaną zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki stożkowej przed wirowaniem, a następnie wypłucz osady poprzez dwukrotne wirowanie w 5 ml PBS podczas każdego płukania. Po drugim płukaniu przefiltruj komórki przez sitko komórkowe o rozmiarze porów 40 µm i rozcieńcz zawiesinę do stężenia 1 × 10⁶ komórek/ml. Następnie pobierz komórki do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 29G i wstrzyknij 100 µl komórek do żyły ogonowej każdego samca myszy szczepu C57-Black-6 w wieku od 8 do 10 tygodni.W odpowiednim punkcie końcowym eksperymentu, za pomocą nożyczek usunąć skórę z powierzchni brzusznej każdej myszy, a następnie przeciąć żebra i przeponę, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Używając motylkowej igły 25G i drenu, przepłukać prawą komorę serca 15 mililitrami PBS, a następnie usunąć serce i grasicę. Chwytając tchawicę pęsetą, pociągnąć ją w górę, oddzielając tkanki łączną wokół tchawicy, aby pobrać płuca.Następnie należy przemyć płuca w PBS i odciąć jeden płat w celu wizualizacji komórek fluorescencyjnych in situ pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aby poddać tkankę płucną trawieniu, najpierw należy posiekać płat caudalny nożyczkami i umieścić fragmenty płuc w strzykawce o pojemności 10 ml. Należy zamknąć strzykawkę tłokiem, a następnie zassać do niej 5 ml roztworu trawiącego, przesuwając tłok w przód i w tył w cylindrze strzykawki, aż tkanka płucna zostanie rozproszona w całym roztworze.Przenieś zawiesinę płucną do probówki o pojemności 50 ml i traw tkankę na wstrząsarce recyprokalnej przez 15 minut w temperaturze 37 °C i przy 150 rpm. Po zakończeniu inkubacji utrzyturuj pozostałą tkankę do całkowitego rozproszenia komórek płuc, a następnie umieść probówkę ponownie na wstrząsarce na kolejne 30 minut. Następnie przefiltruj komórki przez sito o rozmiarze oczek 40 µm i odzyskaj je poprzez wirowanie.Aby przeanalizować wyizolowane komórki płuc za pomocą cytometrii przepływowej, resuspender osad w dwóch mililitrach buforu do lizy erytrocytów przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie zebrać komórki poprzez wirowanie. Następnie wirować osad dwa razy w pięciu mililitrach świeżego PBS uzupełnionego o 1% bovine serum albumin na każde przemycie. Po drugim wirowaniu resuspender osad w jednym mililitrze świeżego PBS z BSA i przefiltrować komórki przez nowe sito o rozmiarze porów 40-micrometer w celu ilościowego oznaczenia komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej.W płucach obecnych jest wiele komórek GFP-LLC dwie godziny po iniekcji, przy czym zdecydowana większość komórek znika z płuc w ciągu 24 godzin. Należy pamiętać, że wszelkie plamki fluorescencyjne wykryte przy użyciu filtra czerwonego powinny zostać wykluczone z obliczeń liczby komórek. W celu potwierdzenia liczby komórek GFP-LLC w płucach, jeden z płatów można wykorzystać do analizy cytometrycznej, zgodnie z przedstawionym sposobem.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że metoda zamrożonych skrawków jest dokładniejszym sposobem obserwacji precyzyjnej lokalizacji komórek nowotworowych.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie przeprowadzamy test migracji komórek macierzystych guza mózgu, aby przeanalizować wpływ interesującego leku na migrację żywych komórek macierzystych guza mózgu za pomocą płytki migracyjnej chemotaksji. Obrazowanie żywych komórek ułatwia wizualizację i ilościowe określenie migracji komórek podczas testu.

Test migracji komórek macierzystych guza mózgu (BTSC) do badań nad leczeniem farmakologicznym: technika obrazowania żywych komórek in vitro w celu analizy wpływu leczenia farmakologicznego na migrację BTSC

Opisujemy protokół monitorowania ruchliwości radialnej nieprzylegających komórek odpornościowych in vitro za pomocą kolektora sedymentacyjnego/suwaka komórkowego. Migracja komórek jest śledzona na monowarstwach komórek nowotworowych lub na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Badanie za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej pozwala na obserwację ruchliwości komórek i funkcjonalności cytotoksycznej.

Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Tutaj opisujemy prostą i tanią metodę, która pozwala na ilościowe określenie komórek nowotworowych adhezji do kriosekcji węzłów chłonnych (LN). Komórki nowotworowe przylegające do LN są łatwo identyfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej i potwierdzane metodą opartą na fluorescencji, dając wskaźnik adhezji, który ujawnia powinowactwo wiązania komórek nowotworowych do miąższu LN.

Kwantyfikacja adhezji komórek nowotworowych w kriosekcjach węzłów chłonnych

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Hodowla CTC pozwala na głębszą funkcjonalną charakterystykę raka, poprzez badanie specyficznej ekspresji markerów oraz ocenę oporności na leki i zdolności do kolonizacji wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla CTC może być obiecującym narzędziem klinicznym dla medycyny spersonalizowanej w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.

Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Poznaj metodę ilościowego oznaczania komórek nowotworowych w płucach w modelu przerzutów u myszy C57-Black-6. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów molekularnych metastazy in vivo.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Przeglądaj więcej filmów