Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc
26 lutego 2019
Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.
Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów dotyczące molekularnych mechanizmów przerzutowania. Główną zaletą tej techniki jest możliwość ilościowego określenia rekrutacji komórek nowotworowych w odległym narządzie. Należy rozpocząć od użycia nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek w celu usunięcia komórek raka płuc Lewisa (LLC) wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego z naczynia hodowlanego, zgodnie ze standardowymi protokołami.
Przenieś otrzymaną zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki stożkowej przed wirowaniem, a następnie wypłucz osady poprzez dwukrotne wirowanie w 5 ml PBS podczas każdego płukania. Po drugim płukaniu przefiltruj komórki przez sitko komórkowe o rozmiarze porów 40 µm i rozcieńcz zawiesinę do stężenia 1 × 10⁶ komórek/ml. Następnie pobierz komórki do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 29G i wstrzyknij 100 µl komórek do żyły ogonowej każdego samca myszy szczepu C57-Black-6 w wieku od 8 do 10 tygodni.
W odpowiednim punkcie końcowym eksperymentu, za pomocą nożyczek usunąć skórę z powierzchni brzusznej każdej myszy, a następnie przeciąć żebra i przeponę, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Używając motylkowej igły 25G i drenu, przepłukać prawą komorę serca 15 mililitrami PBS, a następnie usunąć serce i grasicę. Chwytając tchawicę pęsetą, pociągnąć ją w górę, oddzielając tkanki łączną wokół tchawicy, aby pobrać płuca.
Następnie należy przemyć płuca w PBS i odciąć jeden płat w celu wizualizacji komórek fluorescencyjnych in situ pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aby poddać tkankę płucną trawieniu, najpierw należy posiekać płat caudalny nożyczkami i umieścić fragmenty płuc w strzykawce o pojemności 10 ml. Należy zamknąć strzykawkę tłokiem, a następnie zassać do niej 5 ml roztworu trawiącego, przesuwając tłok w przód i w tył w cylindrze strzykawki, aż tkanka płucna zostanie rozproszona w całym roztworze.
Przenieś zawiesinę płucną do probówki o pojemności 50 ml i traw tkankę na wstrząsarce recyprokalnej przez 15 minut w temperaturze 37 °C i przy 150 rpm. Po zakończeniu inkubacji utrzyturuj pozostałą tkankę do całkowitego rozproszenia komórek płuc, a następnie umieść probówkę ponownie na wstrząsarce na kolejne 30 minut. Następnie przefiltruj komórki przez sito o rozmiarze oczek 40 µm i odzyskaj je poprzez wirowanie.
Aby przeanalizować wyizolowane komórki płuc za pomocą cytometrii przepływowej, resuspender osad w dwóch mililitrach buforu do lizy erytrocytów przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie zebrać komórki poprzez wirowanie. Następnie wirować osad dwa razy w pięciu mililitrach świeżego PBS uzupełnionego o 1% bovine serum albumin na każde przemycie. Po drugim wirowaniu resuspender osad w jednym mililitrze świeżego PBS z BSA i przefiltrować komórki przez nowe sito o rozmiarze porów 40-micrometer w celu ilościowego oznaczenia komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej.
W płucach obecnych jest wiele komórek GFP-LLC dwie godziny po iniekcji, przy czym zdecydowana większość komórek znika z płuc w ciągu 24 godzin. Należy pamiętać, że wszelkie plamki fluorescencyjne wykryte przy użyciu filtra czerwonego powinny zostać wykluczone z obliczeń liczby komórek. W celu potwierdzenia liczby komórek GFP-LLC w płucach, jeden z płatów można wykorzystać do analizy cytometrycznej, zgodnie z przedstawionym sposobem.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że metoda zamrożonych skrawków jest dokładniejszym sposobem obserwacji precyzyjnej lokalizacji komórek nowotworowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca opisuje metodę ilościowego oznaczania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w modelu zwierzęcym przerzutów nowotworowych. Technika ta umożliwia kwantyfikację rekrutacji komórek nowotworowych w odległym narządzie, dostarczając wiedzy na temat molekularnych mechanizmów przerzutowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Zrozumienie przerzutowania nowotworów jest kluczowe dla badań nad rakiem.
- Ilościowe określenie akumulacji komórek nowotworowych może dostarczyć ważnych informacji biologicznych.
- W badaniach nad progresją nowotworów powszechnie stosuje się modele zwierzęce.
- Komórki ekspresyjne białek fluorescencyjnych ułatwiają śledzenie i kwantyfikację.
Cel badania
- Opracowanie metody ilościowego oznaczania akumulacji komórek nowotworowych w płucach.
- Zbadanie rekrutacji komórek nowotworowych w modelu przerzutowym.
- Pogłębienie zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw przerzutowania.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek.
- Wirowanie i przemywanie osadów komórkowych w PBS.
- Filtrowanie komórek przez sito komórkowe o rozmiarze porów 40 µm.
- Wstrzykiwanie rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do żyły ogonowej myszy.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczną kwantyfikację akumulacji komórek nowotworowych.
- Wykazano możliwość śledzenia komórek nowotworowych in vivo.
- Uzyskano wgląd w dynamikę rekrutacji komórek nowotworowych.
- Wniesiono wkład w zrozumienie procesów metastatycznych.
Wnioski
- Ta metoda stanowi wartościowe narzędzie do badania biologii nowotworów.
- Zwiększa ona możliwość badania przerzutowania w modelach zwierzęcych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej technice w celu poszukiwania celów terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza ta umożliwia ilościową ocenę rekrutacji komórek nowotworowych do odległych narządów, co wspomaga ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków ukierunkowanych na przerzuty. Poprzez pominięcie etapów inwazji guza pierwotnego, metoda ta skupia się na oddziaływaniach ze stromą oraz zdarzeniach ekstrawasacji, które są kluczowe dla przedklinicznej walidacji celu terapeutycznego. Metoda ta zapewnia powtarzalny i skalowalny odczyt służący do oceny związków przeciwprzerzutowych in vivo.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących wpływu zrębu na przerzutowanie do odległych narządów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określenie akumulacji komórek nowotworowych w płucach po iniekcji.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez pomiar wpływu związków na dynamikę rekrutacji komórek nowotworowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Generuje zestandaryzowane, ilościowe wyniki za pomocą cytometrii przepływowej na potrzeby kampanii przesiewowych związków.
- Powtarzalność: Wykorzystuje określone stężenia komórek i objętości iniekcji, aby zapewnić spójne modelowanie przerzutów.
- Skalowalność: Kompatybilna z przetwarzaniem w płytkach wielodołkowych i analizą wysokotreściową (high-content analysis) w celu minimalizacji ryzyka związanego z celem terapeutycznym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje mikroprzewroty w płucach w celu zbadania mechanizmów kolonizacji specyficznych dla organów.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki odkryć z przedkliniczną walidacją środków przeciwwdrodowych.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Dostarcza informacji do kryteriów go/no-go na podstawie redukcji liczby znakowanych komórek nowotworowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Pozycje w kontinuum odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu po optymalizację związku wiodącego, umożliwiające ilościową ocenę związków modulujących przerzuty.
- Biologia odkrywcza: Wspiera analizę mechanistyczną oddziaływań między guzami a zrąbkiem w niszach przerzutowych.
- Przesiew: Zapewnia ilościowe odczyty oparte na fluorescencji w celu walidacji trafień w testach przerzutowania.
- Analityka: Generuje policzalne dane dotyczące komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej do analizy statystycznej i zależności dawka-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Jest zgodne ze strategiami biomarkerów poprzez śledzenie dysseminacji znakowanych komórek in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla międzyprojektowych badań nad mechanizmami przerzutowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w szlakach przerzutowania poprzez mierzalną rekrutację specyficzną dla organów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dostarczanie komórek nowotworowych i obróbkę tkanek w celu zapewnienia powtarzalnych porównań między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka w przypadku terapii celowanych w przerzuty.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o skorygowane ryzyko i przedkliniczne dane dotyczące hamowania przerzutów.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w technice wstrzykiwań do ogonowej żyły myszy oraz w metodach dysocjacji tkanek.
- Zależne od aparatury do cytometrii przepływowej oraz kontroli kompensacji fluorescencji.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów przygotowania komórek we wszystkich zespołach badawczych.
- Wiąże się z optymalizacją dawki komórek w celu uniknięcia zakłócających sygnałów wynikających z nadmiernej akumulacji w płucach.
- Ograniczone do ilościowego określania akumulacji w płucach; nie obejmuje inwazji pierwotnego guza ani późniejszego wzrostu przerzutów.
