Name: Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Odkryj metodę generowania bezintegracyjnych hiPSC z keratynocytów pochodzących z włosów przy użyciu wektorów episomalnych. Ta technika pozwala na bezpieczne uzyskiwanie komórek macierzystych bez ryzyka integracji transgenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Harene Ranjithakumaran i Stacey Jackson za wsparcie techniczne. Prace te były częściowo wspierane przez granty z Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (R.C.B. Wong, A. Pébay), Uniwersytetu w Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) i Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Stypendium Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (A. Pébay, FT140100047), Stypendium Fundacji Cranbourne (R.C.B. Wong); finansowanie z National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) oraz wsparcie w zakresie infrastruktury operacyjnej ze strony rządu stanu Wiktoria.

Pobieranie próbek ludzkich włosów od osób indywidualnych wymaga etycznego zatwierdzenia przez komisję etyki badań na ludziach w instytucjach goszczących i powinno być przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucji.
1. Izolacja keratynocytów z wyrwanych włosów
<ol>
	<li>Rozmrozić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (tj. Matrigel) na lodzie O/N.</li>
	<li>Za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek pipet dodać 200 μl roztworu ECM do 12 ml schłodzonego podłoża DMEM/F12. Pokryć 12-dołkową płytkę 1 ml rozcieńczonego roztworu ECM w każdym dołku. Inkubować powlekaną płytkę O/N w temperaturze 37 °C. Przed użyciem umyć powlekaną płytkę wstępnie podgrzanym podłożem DMEM/F12.</li>
	<li>Zbierz pierwotne ludzkie włosy z głowy osoby, umieszczając palce blisko nasady włosów i wyrywając włosy jednym szybkim i płynnym ruchem. Sprawdź, czy każdy pobrany włos zawiera nienaruszony mieszek włosowy i określ fazę wzrostu włosa pod mikroskopem preparacyjnym (ryc. 1).
	<ol>
		<li>Zbierz 5-10 włosów anagenowych od każdej osoby, aby wydobyć keratynocyty. Wyrywane włosy należy przetwarzać tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić pomyślne wyprowadzenie keratynocytów. 
		Uwaga: Rysunek 1 ilustruje morfologię włosów w różnych fazach cyklu wzrostu. Włosy anagenowe są w fazie wzrostu, z widoczną zewnętrzną warstwą nabłonka otaczającą długość włosa, znaną jako ORS. Z drugiej strony, włosy telogenowe reprezentują włosy w fazie spoczynku i nie mają widocznego ORS, ale mają wyraźną kulkę komórek pokrywającą korzeń włosa, znaną jako wybrzuszenie telogenowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść próbki włosów na szalce Petriego zawierającej 10 ml mieszanki antybiotyków do mycia przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą wysterylizowanych nożyczek i kleszczyków odetnij nadmiar łodygi włosa, pozostawiając fragment włosa z nienaruszonym mieszkiem włosowym i około 0,5 - 1 cm łodygi włosa.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś 1 fragment włosa do każdego dołka płytki pokrytej ECM za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml dodaj około 3 krople medium (~100 - 200 μl) Knockout Serum Replacement (KSR) (~100 - 200 μl) do próbek włosów. 
	Uwaga: Utrzymuj fragmenty włosów w bliskim kontakcie z powierzchnią płytki, aby umożliwić przyczepienie się i późniejszy przerost keratynocytów. Dodanie nadmiernej ilości podłoża na tym etapie może spowodować unoszenie się fragmentów włosów i zmniejszenie szans na udane przyczepienie włosów.</li>
	<li>Próbki włosów należy inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% stężeniemCO2 i pozwolić mieszkom włosowym na przyłączenie O/N. Następnego dnia delikatnie dodaj kolejne 3 krople pożywki KSR (~100 - 200 μl), aby próbki włosów były wilgotne.</li>
	<li>Codziennie obserwuj próbki włosów, aby potwierdzić, że mieszki włosowe pomyślnie się przyczepiły. Zazwyczaj przyczepienie mieszków włosowych jest widoczne w ciągu 1-3 dni. Grube włosy są zwykle łatwiejsze do przyczepienia w porównaniu z cienkimi włosami, ponieważ cienkie włosy mają większą tendencję do unoszenia się, co utrudnia proces mocowania.
	<ol>
		<li>Gdy włosy przylgną do powlekanej płytki, dodaj 500 μl podłoża KSR do dołka. Zachowaj szczególną ostrożność podczas dodawania podłoża, ponieważ próbki włosów mogły nie przylegać mocno. Od tego momentu zmieniaj media co 2 dni. 
		Uwaga: Wyrostki keratynocytów powinny być widoczne z obszaru ORS fragmentu włosa po 3-7 dniach (ryc. 2A-B). Pozwól keratynocytom rosnąć do 14 dni przed pasażowaniem komórek, jak opisano w następnym rozdziale.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Utrzymanie i pasażowanie keratynocytów
<ol>
	<li>Wstępnie pokryj płytkę 6-dołkową za pomocą zestawu Coating Matrix Kit. Dodać 680 μl pożywki rozcieńczającej z zestawu do każdego dołka, a następnie 6,8 μl roztworu matrycy powlekającej. Potrząśnij płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu Coating Matrix na płytce.</li>
	<li>Pozostawić powlekaną płytkę do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór matrycy powlekającej przed posiewem keratynocytów.</li>
	<li>Dysocjować keratynocyty do zawiesiny jednokomórkowej z 500 μl 0,25% trypsyny na studzienkę przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Dezaktywować trypinę za pomocą 500 μl pożywki zawierającej surowicę (np. pożywki dla płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) i zebrać do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Usuń fragment włosów za pomocą wysterylizowanych kleszczy.</li>
	<li>Określ liczbę pobranych komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 3 minuty przy 200 x g. Umyć komórki PBS i powtórzyć wirowanie. Odessać PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym pożywce keratynocytowej.</li>
	<li>Płytki 4 × 104 keratynocytów do jednego dołka płytki pokrytej ECM w obecności pożywki keratynocytów. Przechowywać keratynocyty w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 (ryc. 2C). Zmieniaj pożywkę codziennie i pasażuj komórki, gdy hodowla jest zlewająca się w ~ 80%, co może zająć około 2-7 dni w zależności od liczby pasaży i szybkości proliferacji keratynocytów. Otrzymane keratynocyty należy rozmnożyć w celu wytworzenia wystarczającej ilości zamrożonych zapasów przy użyciu standardowych metod kriokonserwacjipowolnego zamrażania 16. 
	Uwaga: Opisane warunki hodowli wspierają ekspansję jednorodnej populacji keratynocytów o typowej morfologii bruku (ryc. 2C). Czasami w hodowli można zaobserwować kilka zróżnicowanych keratynocytów, o dużej i płaskiej morfologii, które utraciły potencjał replikacyjny. Charakterystykę keratynocytów można przeprowadzić poprzez barwienie immunologiczne przy użyciu przeciwciał przeciwko cytokeratynie 14, jak opisano wcześniej 17. Ustalone linie komórkowe keratynocytów powinny być również badane na obecność mykoplazmy po 1-3 pasażach przy użyciu dostępnego na rynku zestawu.</li>
</ol>
3. Generowanie hiPSC z keratynocytów za pomocą wektorów episomalnych
<ol>
	<li>Wstępnie pokryć 6-dołkową płytkę 0,1% żelatyną (2 ml/basenik). Pozostawić żelatynę do pokrycia przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do eksperymentu z przeprogramowaniem należy użyć keratynocytów nie później niż w pasażu 6. Dysocjować keratynocyty do zawiesiny jednokomórkowej z 1 ml 0,25% trypsyny na studzienkę przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Dezaktywować trypsynę za pomocą 1 ml pożywki zawierającej surowicę (np. pożywki FBS) i zebrać w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 3 minuty przy 200 x g i ponownie zawiesić komórki w pożywce keratynocytowej. Płytka 1 × 10 5-1,5 × 105 keratynocytów na studzienkę w żelatynizowanej płytce O / N.</li>
	<li>Następnego dnia (Dzień 0) sprawdź płytkę, aby upewnić się, że komórki są zlewające się w 50-60%. 
	Uwaga: Jeśli keratynocyty są mniej niż ~50% zlewające się, mogą nie rosnąć dobrze po transfekcji.</li>
	<li>W dniu 0 należy przeprowadzić transfekcję episomalnych wektorów przeprogramowujących na keratynocytach, stosując stosunek 8 μl odczynnika do transfekcji na 2 μg całkowitego plazmidowego DNA.
	<ol>
		<li>Pobrać 0,5 μg dla każdego z 4 plazmidów (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3/4-shP53F, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL) i rozcieńczyć w 100 μl zredukowanej pożywki surowicy (np. OPTI-MEM). 
		Uwaga: Plazmid pCXLE-eGFP służy do monitorowania wydajności transfekcji w keratynocytach i nie jest wymagany do pomyślnego przeprogramowania.</li>
		<li>Dodać 8 μl odczynnika do transfekcji do rozcieńczonego DNA. Wymieszaj, przesuwając rurkę. Pozostawić mieszaninę reakcyjną DNA do niezakłóconego spoczynku w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Zastąp pożywkę keratynocytów świeżą pożywką.</li>
		<li>Delikatnie dodać mieszaninę reakcyjną DNA do hodowli keratynocytów i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 godziny 
		Uwaga: Nie zaleca się wykonywania przedłużonej transfekcji O/N w keratynocytach, ponieważ wykazują one niską przeżywalność po transfekcji.</li>
		<li>Po 4 godzinach od transfekcji zastąp pożywkę keratynocytów świeżą pożywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 1 (1 dzień po transfekcji) zmień pożywkę keratynocytów i sprawdź skuteczność transfekcji, szacując procent komórek eGFP dodatnich pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zazwyczaj przy użyciu tego protokołu obserwuje się > 60-70% skuteczności transfekcji dla keratynocytów pierwotnych.</li>
	<li>W dniu 2 powtórz transfekcję zgodnie z opisem w kroku 3.5. Dwie kolejne transfekcje zazwyczaj osiągają > 90% skuteczności transfekcji. Posiew keratynocytów zwykle osiąga konfluencję pod koniec drugiej transfekcji.
	<ol>
		<li>Przygotuj 10-centymetrowe naczynie z karmnikiem dla mysich fibroblastów zarodkowych (MEF) dla każdej reakcji przeprogramowania. Przygotuj mitotycznie inaktywowane podajniki MEF, jak opisano wcześniej 18.</li>
		<li>Wstępnie pokryj 10 cm naczynie 5 ml 0,1% żelatyny przez co najmniej 20 minut. Tabliczka 4 × 106 mitotycznie inaktywowany MEF na 10 cm naczynie w pożywce FBS. Pozostawić komórki do osadzenia się i przyłączyć O/N do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 3 zbierz keratynocyty z 0,25% trypsyny, jak opisano w krokach 3.2 i 3.3. Ponownie zawiesić keratynocyty w pożywce KSR i umieścić 90% keratynocytów z 1 dołka na płytce 6-dołkowej do 10-centymetrowego naczynia podajnika MEF z pożywką KSR.</li>
	<li>Począwszy od 4 dnia, należy codziennie wymieniać podłoże KSR.
	<ol>
		<li>Alternatywnie po 18 dniu należy wymieniać pożywkę hodowlaną co drugi dzień. 
		Uwaga: Nieprzeprogramowane keratynocyty przestaną się namnażać, podczas gdy kolonie hiPSC o określonej granicy, które przypominają ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC), pojawią się od 14 do 21 dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolować kolonie hiPSC przez ręczną sekcję od 21 dnia. Unikaj kolonii hiPSC, które są blisko siebie skupione i wybieraj tylko te kolonie, które są wyraźnie oddzielone od innych. 
	Uwaga: kolonie hiPSC można zbierać wcześniej, ale kolonia o określonych granicach może nie być oczywista we wcześniejszych punktach czasowych, biorąc pod uwagę mały rozmiar kolonii. Wydajność przeprogramowania może się różnić w zależności od keratynocytów pacjenta, a także wpływają na nią inne czynniki, takie jak liczba pasaży lub szybkość proliferacji keratynocytów.
	<ol>
		<li>Do ręcznego wypreparowania kolonii hiPSC użyj igły 26G, aby wyciąć kolonie hiPSC pod mikroskopem preparacyjnym. Pokrój kolonię hiPSC na małe kawałki o długości około 300 - 600 μm. Przenieś kawałki z jednej kolonii hiPSC na nową płytkę podającą MEF (2,5 × 104 MEF/cm2), aby ustalić linię klonalną hiPSC. Początkowo należy wyhodować każdą linię klonu hiPSC w jednym dołku na 12-dołkowej płytce lub szalce do hodowli narządów, a następnie rozszerzyć do formatu płytki 6-dołkowej.</li>
		<li>Utrzymuj ustalone linie klonalne hiPSC w pożywce KSR na zasilaczach MEF. Gdy hodowla osiągnie 70 - 80% zbieżność z koloniami hiPSC o średnicy ~1,5 mm, należy przejść hiPSC za pomocą standardowych metod pasażowania enzymatycznego (Accutase, Dispase lub Collagenaza IV) zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scharakteryzować ustalone linie hiPSC, aby potwierdzić pluripotencję i ich zdolność do różnicowania się w komórki reprezentatywne dla trzech listków rozrodczych in vitro i/lub in vivo13,19. Ponadto rutynowo testuj ustalone linie hiPSC dla mykoplazmy przy użyciu dostępnych na rynku zestawów, aby upewnić się, że są wolne od patogenów. Rutynowe monitorowanie stabilności genomowej linii hiPSC za pomocą kariotypowania lub analizy zmienności liczby kopii (CNV) opartej na macierzy.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, U141-U141 (2008).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31, 458-466 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from urine.</a> J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Lineage-Specific+Differentiation+Protocols.Springer+Protocols+Handbooks%22">Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks</a>. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).</li>
<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445, 834-842 (2007).</li>
<li>Limat, A., Noser, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+single+keratinocytes+from+the+outer+root+sheath+of+human+scalp+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles.</a> J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).</li>
<li>Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+keratinocytes+by+simple+transfection+of+episomal+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors.</a> Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).</li>
<li>Higgins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+hair+follicle+dermal+papilla+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells.</a> J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).</li>
<li>Muchkaeva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Hair+Follice+Dermal+Papilla+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+naturae%22%5BJournal%5D)">Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells.</a> Acta naturae. 6, 45-53 (2014).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen. , (2013).</li>
<li>Sporl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+membrane+cholesterol+reveals+new+insights+into+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).</li>
<li>Conner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22(2001).</li>
<li>Pebay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+sphingosine-1-phosphate+and+platelet-derived+growth+factor+in+the+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).</li>
<li>Myung, P., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+bulge+in+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dissecting the bulge in hair regeneration.</a> J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hair+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The hair cycle.</a> J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives%3A+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).</li>
<li>McKernan, R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+point+of+large-scale+collections+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).</li>
<li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, U1145-U1112 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+rate+of+somatic+cells+affects+reprogramming+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency.</a> J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+passage+human+fibroblasts+induced+to+pluripotency+are+capable+of+directed+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation.</a> Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).</li>
<li>Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+genetic+variation+in+somatic+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Extensive genetic variation in somatic human tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).</li>
<li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Wytwarzanie specyficznych dla pacjenta hiPSC oferuje unikalne podejście do badania patogenezy chorych typów komórek in vitro, a także stanowi platformę do badań przesiewowych leków w celu identyfikacji nowych cząsteczek, które mogą uratować fenotypy choroby. To podejście do modelowania chorób z wykorzystaniem hiPSC przyniosło obiecujące wyniki w przypadku różnych chorób, w tym zespołu wydłużonego odstępu QT, choroby Huntingtona, choroby Parkinsona i stwardnienia zanikowego bocznego 22. Podjęto już kil...

Odkrycie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) zrewolucjonizowało dziedzinę medycyny regeneracyjnej, dostarczając realną metodę generowania komórek macierzystych specyficznych dla pacjenta 1-3. HiPSC zostały pomyślnie wygenerowane z różnych typów komórek somatycznych, w tym fibroblastów 4,5, komórek krwiotwórczych 6,7, komórek nabłonka nerek z moczu 8 i keratynocytów 9,10. Do tej pory fibroblasty skóry i komórki krwiotwórcze stanowią najczęściej wykorzystywane źródła komórek do wytwarzania iPSC specyficznych dla pacjenta. Prawdopodobnie wynika to z faktu, że biopsje skóry i pobieranie krwi są rutynowymi procedurami medycznymi, a w wielu krajach powstały duże biobanki próbek krwi lub skóry pacjentów.
W przeciwieństwie do komórek krwi i fibroblastów skóry, które wymagają inwazyjnych metod ekstrakcji, keratynocyty stanowią łatwo dostępny typ komórek do generowania hiPSC. Keratynocyty to bogate w keratynę komórki nabłonkowe, które tworzą zewnętrzną barierę naskórkową skóry, a także znajdują się w paznokciach i włosach 11. W szczególności keratynocyty można znaleźć na zewnętrznej osłonce korzenia (ORS) mieszków włosowych, zewnętrznej warstwie komórkowej, która pokrywała łodygę włosa wraz z komórkami wewnętrznej osłonki korzenia (IRS) (12, ryc. 1). Ponieważ pobieranie włosów jest prostą procedurą, która nie wymaga pomocy personelu medycznego, daje pacjentom możliwość pobrania i wysłania własnych próbek włosów do laboratoriów, co znacznie ułatwiłoby pobieranie próbek od pacjentów do wytworzenia hiPSC. Keratynocyty naskórka mają również wyższą wydajność przeprogramowywania i szybszą kinetykę przeprogramowania w porównaniu z fibroblastami, co zwiększa korzyści płynące z używania keratynocytów jako komórek wyjściowych do wytwarzania hiPSC 9,13. Ponadto hiPSC mogą być również generowane przy użyciu innych populacji komórek w mieszku włosowym, w tym komórek brodawek skórnych znajdujących się u podstawy mieszka włosowego 14,15.
Poprzednie doniesienia o generowaniu iPSC za pomocą komórek pochodzących z włosów często wykorzystują retrowirusowe lub lentiwirusowe metody przeprogramowania 9,14,15. Jednak te metody wirusowe wprowadzają niepożądaną integrację genomową obcych transgenów podczas przeprogramowywania. Dla porównania, zastosowanie wektorów episomalnych stanowi wykonalną, niewirusową metodę przeprogramowania w celu wygenerowania iPSC bez integracji 4. Wcześniej opracowaliśmy prostą, opłacalną i niewirusową metodę skutecznego przeprogramowania keratynocytów w hiPSC przy użyciu wektorów episomalnych 13. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania hiPSC pochodzących z keratynocytów, w tym wyprowadzanie keratynocytów z wyrwanych włosów, ekspansję i utrzymanie keratynocytów, a następnie przeprogramowanie w celu wytworzenia hiPSC.

<table><tbody><tr><td>Mieszanka antybiotyków:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ng / ml Przeciwgrzybicza amfoterycyna B</td><td>Sigma</td><td>A2942-20ml</td><td>Mieszanka antybiotyków składa się z PBS.</td></tr><tr><td>1X Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Wymiana surowicy nokautującej (KSR) średnia:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Pożywka KSR jest filtrowana za pomocą Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) przed użyciem. bFGF jest dodawany świeży do podłoża przed użyciem.</td></tr><tr><td>20% zamiennik surowicy nokautującej (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 z glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>1 razy; MEM endogenny aminokwas</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0,5 razy; Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0,1 mM &beta;-merkaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; bFGF (10 ng/ml, dodane świeże)</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka keratynocytu:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; EpiLife z 60&nbsp; &mikro; M Calcium</td><td>Invitrogen</td><td>M-EPI-500-CA</td><td></td></tr><tr><td>1 razy; Ludzki suplement na wzrost keratynocytów (HKGS)</td><td>Invitrogen</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS) średnia:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Pożywka FBS jest filtrowana za pomocą Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) przed użyciem.</td></tr><tr><td>10% płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>0,5x Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354234</td><td>Zapas Aliquot Matrigel i przechowywanie w -80&deg; C zgodnie z instrukcją producenta s instrukcje. Stężenie zapasów Matrigel różni się nieznacznie w zależności od partii (~9 mg / ml). Zalecamy stosowanie 200&micro; l matryca do powlekania płytki 12-dołkowej (~150&micro; g/dobrze).&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw matryc do powlekania&nbsp;</td><td>Plazmidy Invitrogen</td><td>R-011-K</td><td></td></tr><tr><td>:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Należy pamiętać, że pCXLE-eGFP jest używany tylko do monitorowania wydajności transfekcji i nie jest wymagany do przeprogramowywania.</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-eGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E231B</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna (ze skóry wieprzowej)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Uzupełnić 0,1% żelatyny w wodzie destylowanej. Autoklaw przed użyciem.</td></tr><tr><td>Zredukowana pożywka surowicy: OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Podajnik mysich fibroblastów zarodkowych (MEF)</td><td>MEF może być inaktywowany przez leczenie mitomycyną C lub napromienianie, jak opisano wcześniej 16.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła 26G</td><td>Terumo</td><td>NN2613R</td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa (poddana działaniu kultur tkankowych)</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>płytka 12-dołkowa (poddana działaniu kultur tkankowych)</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>10 cm szalka (poddana działaniu kultur tkankowych)</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>Stosować w dawce 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>Stosować w dawce 1 mg/ml</td></tr><tr><td>przeciwciało TRA-160</td><td>Milipore</td><td>MAB4360</td><td>Stosować w dawce 5 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>OCT4 przeciwciało</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>Stosować przy 5 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>przeciwciało NANOG</td><td>R& D Systems</td><td>AF1997</td><td>Zastosowanie przy 10 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Zestaw detekcyjny MycoAlert</td><td>Lonza</td><td>LT07-418</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Ostatnie postępy w przeprogramowywaniu pozwalają nam przekształcać komórki somatyczne w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC). Modelowanie choroby za pomocą specyficznych dla pacjenta hiPSC pozwala na badanie mechanizmu leżącego u podstaw patogenezy, zapewniając również platformę do rozwoju badań przesiewowych leków in vitro i terapii genowej w celu poprawy opcji leczenia. Obiecujący potencjał hiPSC w medycynie regeneracyjnej jest również widoczny w rosnącej liczbie publikacji (7000 >) na temat iPSC w ostatnich latach. Do wytwarzania hiPSC z powodzeniem wykorzystuje się różne typy komórek z różnych linii, w tym fibroblasty skóry, komórki krwiotwórcze i keratynocyty naskórka. Podczas gdy biopsje skóry i pobieranie krwi są rutynowo wykonywane w wielu laboratoriach jako źródło komórek somatycznych do wytwarzania hiPSC, pobieranie i późniejsze wyprowadzanie keratynocytów włosów jest rzadziej stosowane. Keratynocyty pochodzące z włosów stanowią nieinwazyjne podejście do pozyskiwania próbek komórek od pacjentów. Tutaj przedstawiamy prostą, nieinwazyjną metodę uzyskiwania keratynocytów z wyrwanych włosów. Udostępniamy również instrukcje dotyczące konserwacji keratynocytów i późniejszego przeprogramowania w celu wygenerowania bezintegracyjnego hiPSC przy użyciu wektorów episomalnych.

Włos przechodzi przez 3 różne fazy cyklu wzrostu: anagen (fazę wzrostu), katagen (fazę regresji) oraz telogen (fazę spoczynku) 20,21. Mieszku włosa w fazie anagenu towarzyszy wiele warstw nabłonka; warstwy te obejmują ORS, IRS oraz trzon włosa (Rysunek 1). Włos w fazie anagenu ulega ostatecznie przejściu w fazę katagenu, która charakteryzuje się apoptozą ORS i zakończeniem różnicowania trzonu włosa. Na koniec włos w fazie katagenu przechodzi w fazę telogenu, w której apoptoza ustaje, a mieszek...

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem keratynocytów pochodzących z włosów. Jest to osiągane poprzez wstępne wyizolowanie włosów od dawcy. Drugim krokiem jest wysianie włosów w celu umożliwienia wyprowadzenia keratynocytów.Następnie keratynocyty są utrzymywane i namnażane in vitro. Ostatnim etapem jest przeprogramowanie keratynocytów w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu episomalnej metody przeprogramowania. Ostatecznie ludzkie komórki iPS można wyizolować i scharakteryzować za pomocą immunohistochemii, aby wykazać ekspresję markerów pluripotencji.Ogólną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda retrowirusowa lub lentiwirusowa, jest to, że dzięki zastosowaniu czynnika episomalnego unikamy niepożądanego wbudowania transgenu do genomu w generowanych komórkach macierzystych. Rozpocznij od rozmrożenia fiolki z roztworem macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie przez noc. Następnego dnia rano, używając schłodzonych końcówek do pipet, dodaj 200 µL roztworu do 12 ml schłodzonego medium DM F 12.Do każdego dołka płytki 12-dołkowej należy dodać jeden mililitr rozcieńczonego roztworu macierzy pozakomórkowej, a następnie inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w celu pokrycia dołków macierzą. Następnie należy pobrać pierwotne ludzkie włosy z głowy dawcy, przykładając palce blisko cebulki włosa i wyrywając go jednym szybkim i płynnym ruchem.Należy sprawdzić i potwierdzić, czy każdy pobrany włos zawiera nienaruszony mieszek włosowy. Umieść mieszek pod mikroskopem stereoskopowym i określ fazę wzrostu każdego włosa. Pobierz od każdej osoby od pięciu do 10 włosów antygenowych w celu ekstrakcji keratynowego lodu.Faza antygenowa, w przeciwieństwie do fazy T, składa się z wielu warstw nabłonka. Przenieść próbki włosa do szalki Petriego zawierającej 10 ml mieszaniny antybiotyków na pięć minut, a następnie przemyć je w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie chwycić włos sterylną pęsetą i za pomocą sterylnych nożyczek odciąć nadmiar trzonu włosa, pozostawiając fragment włosa z nienaruszonym mieszkiem włosowym i około 0,5 do 1 cm trzonu włosa.Ostrożnie przenieś po jednym fragmencie włosa do każdej dołki płytki powlekanej macierzą zewnątrzkomórkową. Używając sterylnej pęsety, dodaj kroplami około 100 do 200 µL pożywki zastępczej surowicy do każdej dołki zawierającej próbki włosów.Następnie należy umieścić płytkę w inkubatorze i pozostawić mieszki do przytwierdzenia na noc w temperaturze 37°C i 5% CO2. Następnego dnia należy ostrożnie dodać kroplami kolejne 100 do 200 µL medium z zamiennikiem surowicy, aby utrzymać próbki włosów w stanie wilgotnym. Próbki włosów należy sprawdzać codziennie, aby potwierdzić, że mieszki włosowe pomyślnie przytwierdziły się do płytki.Po przytwierdzeniu komórek, delikatnie dodaj do dołka dodatkowe 500 µL pożywki. Wymieniaj pożywkę co dwa dni. Pokryj płytkę sześciodołkową kolagenem.W pierwszym przypadku zastosuj obróbkę wstępną, np. za pomocą zestawu do powlekania matrycy, dodając 680 µL medium do rozcieńczania z zestawu do każdej studni, a następnie 6,8 µL roztworu matrycy powlekającej. Delikatnie wstrząśnij płytką, aby zapewnić równomierne powlekanie. Pozostaw powleczoną płytkę do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed wysianiem keratynocytów.Usunąć roztwór powlekający, zdysocjować keratynocyty w hodowli do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez dodanie 500 µL 0,25% trypsyny do każdego dołka i inkubować płytki od dwóch do pięciu minut w temperaturze 37 °C. Po uwolnieniu się komórek z płytki, dezaktywować trypsynę za pomocą 500 µL pożywki z surowicą i zebrać komórki do sterylnej probówki o pojemności 15 mL. Usunąć fragment włosa za pomocą wysterylizowanej pęsety, odwirować komórki w celu uzyskania osadu, a następnie resus.Z zawiesić je w świeżej pożywce do wzrostu keratynocytów i wysiać 40 000 keratynocytów do jednego dołka płytki pokrytej kolagenem w obecności pożywki dla keratynocytów. Wymieniać pożywkę codziennie i pasażować komórki, gdy kultura osiągnie około 80% konfluencji. Pokryć płytkę 6-dołkową żelatyną, dodając dwa mililitry 0,1% roztworu żelatyny do każdego dołka; pozostawić żelatynę na co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie zdysocjować keratynocyty w pasażu szóstym lub niższym do zawiesiny pojedynczych komórek, dodając jeden mililitr 0,25% trypsyny na dołek i inkubując komórki przez dwie do pięciu minut.W temperaturze 37°C należy inaktywować trypsynę za pomocą 1 ml pożywki z surowicą i zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml. Komórki należy odwirować i resuspender w pożywce dla keratynocytów. Następnie należy wysiać od 100 000 do 150 000 keratynocytów na dołek w żelatynizowanej płytce 6-dołkowej i inkubować je przez noc; następnego dnia, w dniu zero, należy sprawdzić płytkę, aby upewnić się, że konfluencja komórek wynosi od 50 do 60%.Przeprowadź transfekcję wektorów reprogramujących episomalnych w keratynocytach, stosując stosunek 8 µL odczynnika do transfekcji na 2 µg całkowitego plazmidowego DNA, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnego dnia, w dniu pierwszym, wymień pożywkę dla keratynocytów i sprawdź wydajność transfekcji, szacując procent komórek wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego pod mikroskopem fluorescencyjnym. W dniu drugim oczekuje się wydajności transfekcji na poziomie 60 do 70%.Powtórz transfekcję, aby zwiększyć jej wydajność do poziomu powyżej 90%. Następnie pokryj naczynie 10 cm pięcioma mililitrami 0,1% żelatyny na co najmniej 20 minut. Wysiej 4 miliony mitotycznie inaktywowanych komórek karmicieli na naczynie 10 cm w pożywce z FBS, zgodnie z opisem w Conrad Al, i pozostaw komórki do osiadania i przylegania przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide w dniu trzecim. Zbierz przetransfekowane keratynocyty w sposób przedstawiony wcześniej i resuspenduj je w pożywce KSR na płytkę.90% keratynocytów z jednej z studzienek przenieść do naczynia o średnicy 10 centymetrów przygotowanego z komórkami wspomagającymi (feeder cells) i przykryć je KSR. Medium Izoluj kolonie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez manualną dyssekcję od 21. dnia. Unikaj kolonii, które są blisko skupione, i wybieraj tylko te kolonie, które są wyraźnie oddzielone od pozostałych.W przypadku ręcznej dyssekcji należy użyć igły 26G, aby pod mikroskopem stereoskopowym pociąć kolonie na małe fragmenty o długości około 300 do 600 µm. Fragmenty z jednej kolonii przenosi się na nową płytkę z warstwą zasilającą MEF w celu ustanowienia linii klonalnej ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Gdy hodowla osiągnie 70 do 80% konfluencji z koloniami ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych o średnicy około 1,5 mm, należy przeprowadzić pasażowanie komórek przy użyciu standardowych metod enzymatycznych, takich jak Accutane, sase lub kolagenaza.Cztery, zgodnie z instrukcją producenta. Przy zastosowaniu tego protokołu odrosty mogą być widoczne już trzy dni po przytwierdzeniu włosa i będą nadal proliferować. Przedstawione tutaj keratynocyty zostały przeniesione na nową płytkę; komórki te można utrzymywać przez wiele pasaży.Na tym obrazie przedstawiono typową kolonię ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z keratynocytów. Po 32 dniach przeprogramowania w centrum kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych może dojść do pewnego stopnia różnicowania. Po ręcznym wyselekcjonowaniu pochodne komórki zazwyczaj wykazują wysoki stosunek jądra do cytoplazmy oraz wyraźną granicę kolonii.Wykazują one również ekspresję szeregu markerów pluripotencji, takich jak OCT4, NANOG i TRA-1-60. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat tego, jak wyizolować keratynocyty z włosa i przeprogramować je w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

generation-integration-free-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Poniższy protokół zawiera instrukcje dotyczące adaptacji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) do hodowli bez warstwy komórek żerujących (feeder-free) z wykorzystaniem kompletnego medium KnockOut Serum Replacement Feeder-Free (KSR-FF). Po zakończeniu adaptacji przedstawiono również instrukcje dotyczące ich dalszego utrzymania.

Adaptacja bez użycia komórek karmicieli, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek iPS z wykorzystaniem bezkomórkowego medium Complete KnockOut Serum Replacement

Niniejszy protokół opisuje szczegółową procedurę krioterapii ludzkich komórek iPS w medium do krioterapii KnockOut SR oraz odzyskiwania tych komórek w kompletnym medium KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) lub medium KnockOut SR z wykorzystaniem komórek zasilających (feeder-based).

Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu bezfeederowego pożywki Complete KnockOut Serum Replacement

Niniejszy artykuł przedstawia wiarygodny protokół izolacji i hodowli komórek macierzystych grzebienia neuronalnego z ludzkich mieszków włosowych.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych grzebienia neuronalnego z ludzkich mieszków włosowych

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Prezentujemy tutaj protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na każdą pochodną somitu (miotom, sklerotom, dermatom i syndetom) w chemicznie zdefiniowanych warunkach, który ma zastosowanie w przyszłym modelowaniu chorób i terapiach komórkowych w chirurgii ortopedycznej.

Wytwarzanie in vitro pochodnych somitów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Protokół ten określa metodę wytwarzania organoidów skóry zawierających mieszki włosowe pochodzące z ludzko indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, wykorzystując płaski, fizjologicznie istotny system hodowli powietrzno-cieczowy, aby odwzorować architekturę i funkcję skóry.

Generowanie ludzko indukowanych pluripotentnych pluripotentnych organoidów skórnych z komórek macierzystych z użyciem systemu hodowli powietrze-ciecz

Odkryj metodę generowania bezintegracyjnych hiPSC z keratynocytów pochodzących z włosów przy użyciu wektorów episomalnych. Ta technika pozwala na bezpieczne uzyskiwanie komórek macierzystych bez ryzyka integracji transgenów.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Przeglądaj więcej filmów