Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów. Osiąga się to poprzez najpierw odizolowanie włosów od dawcy. Drugim krokiem jest płytki włosków, aby ułatwić wzrost keratynocytów.

Następnie keratynocyty są utrzymywane i rozwijane in vitro. Ostatnim krokiem jest przeprogramowanie keratynocytów w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu metody przeprogramowania episomalnego. Ostatecznie ludzkie komórki IPS można wyizolować i scharakteryzować za pomocą immunohistochemii, aby pokazać ekspresję markerów pluripotencjalnych.

Ogólna przewaga tej metody nad istniejącymi metodami, takimi jak metoda retrowirusowa lub lentiwirusowa, polega na tym, że stosując czynnik episomalny unikamy niepożądanego transgenu. Integracja z genomem w komórkach macierzystych, które są generowane Rozpocznij od rozmrożenia fiolki z roztworem macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie Przez noc. Następnego ranka użyj wstępnie schłodzonych końcówek pipet, aby dodać 200 mikrolitrów roztworu do 12 mililitrów schłodzonego podłoża DM F 12.

Dodaj jeden mililitr rozcieńczonego roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej do każdego dołka 12. Dobrze rozszczepić i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby pokryć studzienki matrycą. Następnie zbierz pierwotne ludzkie włosy z głowy dawcy, umieszczając palce blisko nasady włosów i wyrywając włosy jednym szybkim i płynnym ruchem.

Sprawdź, czy każdy pobrany włos zawiera nienaruszony mieszek włosowy. Umieść mieszek włosowy pod mikroskopem preparacyjnym i określ fazę wzrostu każdego włosa. Zbierz od pięciu do 10 włosów antygenu od każdego osobnika, aby wydobyć keratynowy lód.

Faza antygenowa, w przeciwieństwie do fazy T, zawiera wiele warstw nabłonka. Umieść próbki włosów na szalce Petriego zawierającej 10 mililitrów mieszanki antybiotyków na pięć minut, a następnie umyj je w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie chwyć włosy sterylnymi kleszczami i użyj sterylnych nożyczek, aby odciąć nadmiar łodygi włosa, pozostawiając fragment włosa z nienaruszonym mieszkiem włosowym i około 0,5 do jednego centymetra łodygi włosa.

Ostrożnie przenieś jeden fragment włosa do każdego dołka płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową. Za pomocą sterylnych kleszczy głaszczę około 100 do 200 mikrolitrów zamiennika surowicy. Podłoże kroplami do każdej studzienki zawierającej próbki włosów.

Następnie umieść płytkę w inkubatorze i pozwól mieszkom włosowym przyczepić się przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla następnego dnia. Delikatnie dodaj kolejne 100 do 200 mikrolitrów zamiennika serum, średnio kroplami, aby próbki włosów były wilgotne. Codziennie sprawdzaj próbki włosów, aby potwierdzić, że mieszki włosowe pomyślnie przyczepiły się do płytki.

Po przymocowaniu delikatnie dodaj do dołka dodatkowe 500 mikrolitrów pożywki. Zmieniaj nośniki co dwa dni. Preco to sześciościenna płytka z kolagenem.

Wpisz jeden, stosując obróbkę wstępną, taką jak zestaw matrycy powlekającej przy 680 mikrolitrach pożywki rozcieńczającej z zestawu do każdej studzienki, a następnie 6,8 mikrolitra roztworu matrycy powlekającej. Delikatnie potrząśnij płytką, aby zapewnić jednolitą powłokę. Pozostawić powlekaną płytkę do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed posiewem keratynocytów.

Usuń roztwór powlekający, zdysocjuj keratynocyty w hodowli na zawiesinę pojedynczej komórki, dodając 500 mikrolitrów 0,25% tripsyny na studzienkę i inkubuj płytki przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki uwolnią się z płytki, dezaktywuj trypsynę za pomocą 500 mikrolitrów surowicy zawierającej pożywkę i zbierz komórki w sterylnej probówce o pojemności 15 mililitrów. Usuń fragment włosów za pomocą wysterylizowanych kleszczy, opluj komórki, a następnie zreaktywuj.

Zawieś je na świeżej płytce pożywki wzrostowej keratynocytów 40 000 keratynocytów w jednym dołku płytki pokrytej kolagenem w obecności pożywki keratynocytowej. Zmieniaj pożywkę codziennie i przechodź przez komórki, gdy kultura jest około 80% zlewnego V zakoduj sześciościenną płytkę z żelatyną, dodając dwa mililitry 0,1% roztworu żelatyny do każdej, dobrze pozwól żelatynie pokryć się przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie zdysocjuj keratynocyty, które przechodzą sześć lub niżej, do zawiesiny pojedynczej komórki, dodając jeden mililitr 0,25% tryny na studzienkę i inkubując komórki przez dwie do pięciu minut.

W temperaturze 37 stopni Celsjusza dezaktywuj trypsynę jednym mililitrem pożywki zawierającej surowicę i zbierz komórki w 15-mililitrowej probówce. Osadzać komórki i ponownie je zawiesić w pożywce keratynocytowej. Następnie umieść 100 000 do 150 000 keratynocytów na dołku w żelatynizowanej płytce sześciodołkowej i inkubuj je przez noc następnego dnia, dnia zero, sprawdź płytkę, aby upewnić się, że komórki są w 50 do 60% zlewne.

Przeprowadzić transfekcję episomalnych wektorów przeprogramowywania na keratynocytach przy użyciu stosunku ośmiu mikrolitrów odczynnika do transfekcji na dwa mikrogramy całkowitego DNA osocza, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Następnego dnia, pierwszego dnia, zmień pożywkę keratynocytów i sprawdź skuteczność transfekcji, szacując procent komórek dodatnich białka zielonej fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wydajność transfekcji od 60 do 70% spodziewana jest w drugim dniu.

Powtórz transfekcję, aby zwiększyć wydajność transfekcji do ponad 90%Następnie wstępnie zakoduj 10-centymetrową naczynie pięcioma mililitrami 0,1% żelatyny przez co najmniej 20 minut. Umieść 4 miliony mitotycznie inaktywowanych komórek zasilających na 10-centymetrowej czaszy w pożywce FBS, jak opisano w Conrad Al, i pozwól komórkom osiąść i przyczepić się przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla trzeciego dnia. Zbierz transfekowane keratynocyty, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawieś je na pożywce KSR.

90% keratynocytów z jednej ze studzienek do 10-centymetrowego naczynia przygotowanego z komórek zasilających i przykryć je KSR. Podłoże: Izolować ludzkie indukowane pluripotencjalne kolonie komórek macierzystych poprzez ręczną sekcję od 21 dnia. Unikaj kolonii, które są blisko siebie skupione i wybieraj tylko kolonie, które są wyraźnie oddzielone od innych.

Do ręcznego rozwarstwienia użyj igły o rozmiarze 26, aby pociąć kolonie na małe kawałki o długości około 300 do 600 mikrometrów pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieś kawałki z jednej kolonii na nową płytkę podającą MEF, aby ustalić linię klonalną ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Gdy hodowla osiągnie od 70 do 80% płynności z indukowanymi przez człowieka pluripotencjalnymi koloniami komórek macierzystych o średnicy około 1,5 milimetra, komórki używają standardowych enzymatycznych metod pakowania, takich jak Accutane, sase lub kolagenaza.

Cztery, zgodnie z instrukcją producenta. Postępując zgodnie z tym protokołem, wyrostki można zaobserwować już trzy dni po przyczepieniu włosów i będą się one nadal rozmnażać. Pokazane tutaj keratynocyty zostały przeniesione na nową płytkę i komórki te mogą być utrzymywane przez wiele pasaży.

Zdjęcie przedstawia typową kolonię pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych indukowanych przez keratynocytów. Po 32 dniach przeprogramowania może wystąpić pewne różnicowanie w centrum indukowanej przez człowieka kolonii pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po ręcznym pobraniu uzyskane komórki zazwyczaj wykazują wysoki stosunek jądra do cytoplazmy i określoną granicę kolonii.

Wyrażają również szereg markerów pluripotencjalnych, takich jak OCT four nag i TRA one 60. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyekstrahować keratynocyty z włosów i przeprogramować je na rzekome komórki macierzyste indukowane przez człowieka.