Dostarczanie białek, peptydów lub nieprzepuszczalnych dla komórek małych cząsteczek do żywych komórek przez inkubację z odczynnikiem endosomolitycznym dfTAT

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest dostarczenie makrocząsteczek do żywych komórek za pomocą dimeru, fluorescencyjnego tat lub df tat, odczynnika, który może bardzo skutecznie przenikać do komórek bez ich uszkadzania. Osiąga się to poprzez uprzednie wytworzenie i oczyszczenie środka dostarczającego. Dfta jako drugi krok.

Dfta inkubuje się z komórkami przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności interesującego ładunku makrocząsteczkowego, df tat indukuje wychwyt ładunku wewnątrz pęcherzyków endocytarnych. Pęcherzyki dojrzewają do wczesnych endosomów, ostatecznie osiągając późny etap endosomu, w którym DF tat jest w stanie uwolnić ładunek do przestrzeni cytozolowej komórek. Następnie komórki są obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu oceny wydajności dostarczania detty i ładunku będącego przedmiotem zainteresowania.

Wyniki pokazują, że DF TT może wnikać do komórek z wysoką wydajnością i bez obserwowalnej cytotoksyczności: DF tat może dostarczać makrocząsteczki o różnych rozmiarach do przestrzeni cytozolowej komórek, co można zaobserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami dostarczania w postaci stałej jest to, że nasz agent dostarczający ma wysoką wydajność dostarczania bez zauważalnego negatywnego wpływu na fizjologię komórkową. Ponadto jest łatwy w użyciu, ponieważ wymaga jedynie prostego etapu wspólnej inkubacji.

Aby rozpocząć, synteza FTA pęcznieje 500 miligramów amidu R, żywicy MBHA i dimetyloformamidu lub DMF w standardowym 50-mililitrowym naczyniu SPPS przez jedną godzinę, przeprowadzając reakcję w temperaturze pokojowej przy użyciu tylko takiej ilości azotu, aby wywołać pęcherzyki. Zsyntetyzuj FTA na żywicy amidowej MBHA na lodowisku przy użyciu 1,2 milimola każdego aminokwasu chronionego FM wymienionego w protokole tekstowym dla każdej reakcji sprzęgania aminokwasów. Dodać również punkt 44 gramy HBTU i punkt 51 mililitrów DIEA rozpuszczonej w DMF, przeprowadzać każdą reakcję sprzęgania aminokwasów przez cztery godziny po czterogodzinnym sprzężeniu.

Umyj żywicę DMF i wykonaj krok ochrony FD zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Powtarzaj, aż zostanie zsyntetyzowany liniowy łańcuch peptydowy FTA. Następnie należy przeprowadzić grupę ochronną MTT, inkubując żywicę z 20 mililitrami roztworu składającego się z 1% kwasu trifluorooctowego lub TFA i 2% tri izopropylu cyego lub TIS w DCM przez pięć minut.

Ponieważ usunięcie grupy ochronnej MTT skutkowałoby pojawieniem się żółtego koloru. Powtarzaj to, aż nie zaobserwujesz żółtych kolorów, myjąc żywicę DCM i DMF pomiędzy nimi. Dodaj dodatkowy roztwór z 1% TFA w DCM do żywicy, aby upewnić się, że MTT nie zostanie usunięty, a roztwór pozostanie klarowny.

Następnie rozpuść T-M-R-H-B-T-u i DIEA w DMF i dodaj tę mieszaninę do żywicy. Przeprowadzić reakcję przez noc przy użyciu suchego azotu, aby zapewnić mieszanie po ochronie fm d i koniugacji aminokwasów. Umyj żywicę DCM i pozostaw do wyschnięcia, aby całkowicie rozszczepić peptyd z żywicy.

Dodaj roztwór zawierający 92,5% TFA, 2,5% wody, 2,5% TIS i 2,5% etanu di tiolu do żywicy peptydylowej przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, aby uzyskać globalną głęboką ochronę i rozszczepienie żywicy. Wytrącić surowe produkty peptydowe za pomocą zimnego bezwodnego eteru etylowego, spuszczając przygotowany roztwór do 40 mililitrów eteru eylowego. Wiruj w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 4 000 G przez 20 do 25 minut.

Powtórzyć ten krok, aby umożliwić przemycie osadu zimnym bezwodnym eterem etylowym reus. Zawiesić osady w wodzie i liofilizować, a następnie ponownie zawiesić produkty otrzymane w 0,1% wodnej próbie TFA ACEDONIT. Przeprowadzić wysokosprawną chromatografię cieczową lub analizę HPLC za pomocą analitycznej kolumny C 18.

Aby przeanalizować każdy peptyd, użyj natężenia przepływu jednego mililitra na minutę i detekcji przy 214 nanometrach i 550 nanometrach. Następnie wykonać półpreparatywną HPLC na kolumnie C 18 w celu oczyszczenia peptydów. Użyj natężenia przepływu czterech mililitrów na minutę i detekcji przy 214 nanometrach i 550 nanometrach dla wszystkich przebiegów.

Użyj gradientów liniowych przed przeprowadzeniem reakcji utleniania. Potwierdź poprawną tożsamość peptydów przez MALDI zgodnie z protokołem producenta. Rozpuścić FTA w napowietrzonym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem.

Upewnij się, że pH wynosi od 7,0 do 7,5. Po dodaniu peptydu zmutuj reakcję przez noc, aby mogła reagować aż do zakończenia. Oczyścić produkt za pomocą HPLC z odwróconymi fazami i przeanalizować za pomocą spektrometrii mas jak poprzednio, liofilizować czysty DF tat i zawiesić resus w 200 mikrolitrach wody w celu zmierzenia stężenia.

Najpierw Resus zawiesić podwielokrotność oczyszczonego DF tat w 149 mikrolitrach 50-milimolowego roztworu TCEP, pozwalając próbce reagować przez około 20 minut. Na tym etapie tat DF jest redukowany do swojego odpowiednika monomeru F tat w celu wyeliminowania hartowania absorbancji, które występuje z powodu bliskiego sąsiedztwa czwartego piętra TMR i DF tat. Dodaj wszystkie roztwory do kwarcu CVE i zmierz absorbancję przy 556 nanometrach.

Korzystając z prawa piwa. Określić stężenie roztworu. Odpowiada to stężeniu fta.

Podziel stężenie FTA przez dwa, aby uzyskać stężenie dfta. Hoduj komórki w odpowiednim podłożu do 80 do 90% płynności w wilgotnej atmosferze o temperaturze 37 stopni Celsjusza zawierającej 5% CO2, umyj komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS i raz NRL 15. Inkubować komórki z pięcioma mikromolowymi df tat z ładunkiem lub bez, takim jak wzmocnione białko zielonej fluorescencji i utrzymywać w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę, aby wywołać wyciek endosomalny po inkubacji.

Przemyć komórki trzykrotnie heparyną w pożywce L 15, aby usunąć DF związany z błoną plazmatyczną komórek. Jako obraz ostatniego etapu, komórki za pomocą obrazu mikroskopu fluorescencyjnego DF tat używają czerwonego białka fluorescencyjnego lub filtra RFP w celu oceny różnicy między F TAT i D ftt. Komórki heela są inkubowane z każdym peptydem w celu określenia różnicy w ich lokalizacji komórkowej.

Jak pokazano tutaj, FTA jest zlokalizowana w rozkładzie punktowym. Ta dystrybucja jest zgodna z peptydem pozostającym uwięzionym w endosomach. Natomiast sygnał fluorescencyjny dfta wykazuje jednorodny rozkład w cytozolu i jądrze.

Cytozolowy rozkład DF tat obserwuje się w wielu różnych liniach komórkowych. 20-krotne obrazy pokazują, że bardzo wysoki odsetek w naczyniu wykazuje cytozolowy rozkład DF tat bez toksyczności komórkowej, co widać po barwieniu jądrowym bez niebieskiego cyt w celu określenia, czy przeciek endosomalny za pośrednictwem dfta dostarcza duże białka do cytozolu komórek. EGFP wykorzystano do wykrycia dostarczania prawidłowo pofałdowanego białka.

EGFP wykazywał cytozolowy i jądrowy rozkład zielonej fluorescencji, podobny do tego, który obserwuje się w przypadku DF tat w ponad 90% komórek bez obserwowalnej toksyczności Podczas próby tej procedury należy pamiętać, że komórki nie powinny być nadmiernie zlewne. Dodatkowo komórki należy dokładnie umyć, aby usunąć FPS przed dodaniem kranu df.