Name: Dostarczanie białek, peptydów lub nieprzepuszczalnych dla komórek małych cząsteczek do żywych komórek przez inkubację z odczynnikiem endosomolitycznym dfTAT (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę dostarczania białek i nieprzepuszczalnych cząsteczek do żywych komórek ssaczych przy użyciu odczynnika endosomolitycznego dfTAT. Technika ta umożliwia wysokowydajną dostawę ładunku bez uszkadzania komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten artykuł został wsparty przez Award numer R01GM087227 od National Institute of General Medical Sciences, Norman Ackerman Advanced Research Program, oraz fundacji Roberta A. Welcha (Grant A-1769).

1. SPPS: CK(TMR)TATG (fTAT) Synteza
Uwaga: dfTAT jest wytwarzany w dwóch etapach: synteza monomeru fTAT przez syntezę peptydu w fazie stałej, a następnie dimeryzacja wiązań dwusiarczkowych do utworzenia dfTAT.
<ol>
	<li>Pęcznieć 500 mg żywicy amidowej MBHA w dimetyloformamidzie (DMF) w standardowym naczyniu SPPS o pojemności 50 ml przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wykonaj deprotekcję Fmoc poprzez inkubację żywicy chronionej Fmoc w 20% roztworze piperydyny (20% piperydyny w DMF, 10 ml (0,30 mmol). Etapy odbezpieczania należy przeprowadzić dwukrotnie (1 x 5 min i 1 x 15 min) z etapem płukania przy użyciu DMF (etap mycia obejmuje wielokrotne płukanie żywicy o łącznej objętości około 150 ml DMF i usunięcie rozpuszczalnika przez filtrację próżniową) pomiędzy reakcjami.</li>
	<li>Zsyntetyzuj CK(TMR)RKKRRQRRRG (fTAT) na lodowisku z żywicy amidowej MBHA. Stosuj następujące aminokwasy chronione przez Fmoc: Fmoc-Lys(Mtt)-OH (tylko na N-końcu), Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH i Fmoc-Cys(Trt)-OH. Przeprowadzić reakcję przy użyciuN2 (20 PSI) w celu zamieszania reakcji. Wykonaj wszystkie reakcje w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Przeprowadzaj każdą reakcję sprzęgania aminokwasów przez 4 godziny. Do każdego sprzężenia należy użyć aminokwasu chronionego Fmoc (1,2 mmol), N,N,N′,N′ -Tetrametylo-O-(1 H-benzotriazol-1-ylo)heksafluorofosforan uronu (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol) i diizopropyloetyloamina (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) rozpuszczonych w DMF. Po 4-godzinnym sprzęgle umyj żywicę DMF i wykonaj krok deochrony Fmoc zgodnie z opisem w kroku 1.2.</li>
		<li>Powtarzaj, aż zostanie zsyntetyzowany liniowy łańcuch peptydowy fTAT (Liniowy łańcuch peptydowy: CKRKKRRQRRRRG no TMR).</li>
		<li>Następnie dokładnie umyj żywicę za pomocą najpierw DMF, a następnie dichlorometanu (DCM). Przepłukać żywicę wielokrotnie łączną objętością około 150 ml DMF lub DCM i usunąć rozpuszczalnik przez filtrację próżniową.</li>
		<li>Użyj MALDI-TOF, aby potwierdzić, że otrzymany peptyd ma prawidłową masę cząsteczkową.
		<ol>
			<li>Sporządzić mieszaninę matrycy, dodając 1 mg matrycy do roztworu składającego się z 50 μl 0,01% TFA w roztworze wodnym i 50 μl acetonitrylu.</li>
			<li>Aby potwierdzić liniową masę łańcucha peptydowego, użyj kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego. Uruchomić analityczną HPLC surowego peptydu i zebrać 50 μl z wierzchołka czystego piku.</li>
			<li>Aby przygotować próbkę do płytki na płytce MALDI: Dodać 8 μl peptydu do 2 μl roztworu matrycy i umieścić na płytce MALDI do wyschnięcia na powietrzu lub na płytce grzewczej o temperaturze 37 °C. 
			Uwaga: Arginina jest znana jako aminokwas trudny do sprzężenia w SPPS. Udane sprzężenie ustala się poprzez wykonanie testu Kaisera14 (np. testu ninhydryny). Test ten pozwala na wykrycie wolnych amin, które mogą pozostać niesprzężone na żywicy. W przypadku wykrycia niebieskiego koloru (wskazującego na obecność wolnych amin), kroki sprzęgania są powtarzane.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla CK(-NH-TMR)TATG (fTAT) rozszczepić grupę ochronną Mtt w grupie -aminowej Lys na CK(-NH-Mtt)TATG roztworem złożonym z 1% kwasu trifluorooctowego (TFA) i 2% triizopropylosilanu (TIS) w DCM.
	<ol>
		<li>Ponieważ usunięcie grupy ochronnej MTT spowodowałoby pojawienie się żółtego koloru, należy inkubować żywicę z 20 ml powyższego roztworu przez 5 minut, powtarzać tę czynność, aż nie będzie obserwowany żółty kolor. Pomiędzy nimi umyj żywicę za pomocą DCM i DMF. Dodatkowo, ponieważ TIS jest zmiataczem, który oczyszcza MTT, w obecności MTT w roztworze nie pojawia się żaden żółty kolor.</li>
		<li>Dodaj dodatkowy roztwór z 1% TFA w DCM (bez TIS) do żywicy, aby upewnić się, że MTT nie zostanie już usunięty, a roztwór pozostanie klarowny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuścić trzy składniki: karboksytetrametylodaminę (TMR), HBTU i DIEA (równoważność 4, 3,9 i 10 w odniesieniu do ilości żywicy (w mg)) w DMF i dodać tę mieszaninę do żywicy i przeprowadzić reakcję O/N przy użyciu suchegoN2 w celu zapewnienia mieszania.</li>
	<li>Po deprotekcji Fmoc i koniugacji aminokwasów, umyj żywicę DCM i pozostaw do wyschnięcia. Aby uzyskać całkowite rozszczepienie peptydu z żywicy, dodaj roztwór zawierający 92,5% TFA, 2,5%H2O, 2,5%, TIS i 2,5% etanedithiolu (EDT) (całkowita objętość = 4 ml) do żywicy peptydylo-restynowej przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, aby uzyskać globalną deprotekcję i rozszczepienie z żywicy.
	<ol>
		<li>Surowe produkty peptydowe należy wytrącić za pomocą zimnego bezwodnego eteru etylowego (Et2O), spuszczając roztwór z etapu 1.6 do 40 ml Et2O, odwirować go w temperaturze 4 °C i 4 000 x g przez 20 - 25 minut. Powtórzyć ten krok, aby umożliwić przepłukanie osadu zimnym bezwodnym Et2O.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osady w wodzie (5 ml lub do całkowitego rozpuszczenia osadu) i liofilizować. Następnie ponownie zawiesić otrzymane produkty w 0,1% wodnym roztworze TFA/acetonitrylu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić analizę HPLC za pomocą analitycznej kolumny C18 (5 μm, 4 x 150 mm) w celu analizy każdego peptydu. Stosować natężenie przepływu 1 ml/min i detekcję przy 214 nm i 550 nm.</li>
	<li>Wykonać półpreparatywną HPLC na kolumnie C18 10 x 250 mm w celu oczyszczenia peptydów. Stosować natężenie przepływu 4 ml/min i detekcję przy 214 nm i 550 nm. Dla wszystkich przebiegów należy stosować gradienty liniowe 0,1% wodnego roztworu TFA (rozpuszczalnik A) i 90% acetonitrylu, 9,9% wody i 0,1% TFA (rozpuszczalnik B).</li>
	<li>Potwierdź poprawną tożsamość peptydów przez MALDI-TOF zgodnie z protokołem producenta: fTAT, oczekiwana masa: 2 041,17, obserwowana masa: 2040,66. DEAC-K9, oczekiwana masa: 1 412,97, obserwowana masa: 1 415,59. Użyj matrycy kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego do MALDI-TOF.</li>
</ol>
2. Reakcja utleniania: Generacja dfTAT
<ol>
	<li>Napowietrzać sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) o pH 7,4 przez 1 godzinę (co najmniej 5 ml dla poniższej reakcji).</li>
	<li>Rozpuścić fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10-4 mmol) w napowietrzonym PBS o pH 7,4 (5 ml). Upewnij się, że pH wynosi od 7,0 do 7,5 po dodaniu peptydu. Jeśli nie, dodać wodorotlenek sodu (1 M, małymi krokami 1 - 5 μl), aby przywrócić pH do 7,4.</li>
	<li>Uwaga: Tlen rozpuszczony w PBS działa w celu utlenienia grup tiolowych na fTAT i utworzenia wiązania dwusiarczkowego.</li>
	<li>Nutować reakcję O/N, aby umożliwić jej reakcję aż do zakończenia (100% wydajność na podstawie analizy HPLC). Oczyścić produkt za pomocą HPLC z odwróconymi fazami i przeanalizować za pomocą spektrometrii mas (MALDI-TOF), jak w kroku 1.9. Oczekiwana masa: 4 080,34, obserwowana masa: 4 084,21.</li>
	<li>Liofilizować czysty dfTAT (0,71 x10-4 mmol) i ponownie zawiesić w 200 μl wody (stężenie czystego dfTAT = 356,3 μM).</li>
</ol>
3. Pomiar stężenia dfTAT
<ol>
	<li>Zawiesić podwielokrotność oczyszczonego dfTAT (zazwyczaj 1 μl w zależności od ilości oczyszczonego peptydu) w 149 μl 50 mM roztworu TCEP.</li>
	<li>Uwaga: Na tym etapie dfTAT jest redukowany do swojego monomerowego odpowiednika fTAT w celu wyeliminowania wygaszania absorbancji, które występuje z powodu bliskiego sąsiedztwa fluoroforu TMR w dfTAT (współczynnik ekstynkcji ε TMR w dfTAT jest zmniejszony w porównaniu z ε TMR w zredukowanym fTAT).</li>
	<li>Pozostawić próbkę do reakcji przez około 20 minut (do potwierdzenia powstania fTAT można użyć analitycznej HPLC).</li>
	<li>Dodać cały roztwór do kuwety kwarcowej i zmierzyć absorbancję przy 556 nm.</li>
	<li>Korzystając z prawa Beera ( A = εcl : ε = 91 500 M-1 cm-1) do obliczenia stężenia fTAT, określ stężenie dfTAT i podziel [fTAT] przez dwa.</li>
</ol>
4. Eksperymenty z dostarczaniem komórkowym
<ol>
	<li>Zasiej komórki (HeLa, HDF itp.) w naczyniu o zbiegu 80 - 90% (np. szalka 8-dołkowa lub 24-dołkowa). Hoduj komórki w odpowiednim podłożu (np. DMEM uzupełnionym 10% FBS i Pen/Strep) do 80 - 90% konfluencji w wilgotnej atmosferze o temperaturze 37 °C zawierającej 5% CO2 .</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie (3X) PBS (dodając 200 μl PBS, a następnie trzykrotnie usuwając).</li>
	<li>Uzyskać stężenie robocze dfTAT 5 μM, rozcieńczając zapas dfTAT (w wodzie) w pożywce nrL-15 (dla naczynia 8-dołkowego całkowita objętość powinna wynosić 200 μl). Stężenie 5 μM dfTAT prowadzi do efektywnego dostarczania (wysoki poziom dostarczania cytozolowego w ponad 90% komórek obecnych w naczyniu) w większości testowanych do tej pory typów komórek (ryc. 3). Jednak niższe lub wyższe stężenia mogą być bardziej odpowiednie dla typów komórek o wysokiej lub niskiej skłonności do penetracji. 
	UWAGA O POŻYWCE: nrL-15 jest używany do dostarczania dfTAT, ponieważ nie zawiera cysteiny, która mogłaby zmniejszyć wiązanie dwusiarczkowe w dfTAT. Jednak nasze dane wskazują, że zarówno zwykła L-15 (z cysteiną), jak i DMEM mogą być stosowane jako media dostarczające. L-15 zawiera aminokwas redukujący cysteinę, ale cysteina prawdopodobnie utlenia się w pożywce, tworząc cystynę (DMEM jest sformułowany z cystyną). dfTAT pozostaje zatem nienaruszony w tych pożywkach, a podawanie działa z taką samą wydajnością, jak w przypadku nrL15.</li>
	<li>Inkubować komórki za pomocą dfTAT (5 μM) z ładunkiem lub bez ładunku (np. EGFP (10 μM)) i utrzymywać w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (czas inkubacji można skrócić, ale dfTAT zwykle wymaga około 30 do 45 minut do wywołania wycieku endosomalnego).</li>
	<li>Przemyć komórki heparyną (1 mg/ml) w L-15 (zalecane są 3 przemycia) w celu usunięcia dfTAT związanego z błoną plazmatyczną komórek.</li>
	<li>Inkubuj komórki z nieprzepuszczalnym dla komórek barwnikiem jądrowym, np. Sytox Blue, Sytox Green (2 μM w nrL-15), aby określić, czy błona plazmatyczna komórek jest naruszona (martwe komórki zostaną wybarwione, podczas gdy żywe komórki nie) zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Obrazuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (100-krotne zanurzenie w oleju lub 20-krotny obiektyw). Obraz dfTAT przy użyciu filtra RFP (Ex = 560 ± 20 nm/Em = 630 ± 35 nm). 
	Uwaga: Pomyślne dostarczenie prowadzi do rozproszonej fluorescencji dfTAT w całej komórce (ocena dostarczania białka lub peptydu będącego przedmiotem zainteresowania będzie zależeć od zastosowania). Barwienie jąderek przez fTAT (zredukowany produkt dfTAT po wniknięciu cytozolu) może być wykorzystane jako wskazanie, że wykryta fluorescencja jest wewnątrzkomórkowa. fTAT ulegnie degradacji w ciągu kilku godzin. W tym momencie fluorescencja fragmentów degradacji pojawi się jako punktowa. Nie należy tego mylić z rozkładem punktowym, który jest również widoczny, jeśli dfTAT pozostaje nieskutecznie uwięziony w endosomach (może się to zdarzyć, jeśli dfTAT jest obecny w zbyt niskim stężeniu).</li>
</ol>
5. Kontrolowanie stężenia dostarczonego MOI
<ol>
	<li>Zidentyfikuj stężenie "optymalnego dostarczania" wymagane do osiągnięcia skutecznego cytozolowego uwalniania dfTAT w używanym typie komórki. Wykonaj mikroskopię fluorescencyjną na komórkach inkubowanych z rosnącym stężeniem dfTAT. Optymalne stężenie dfTAT definiuje się jako minimalne stężenie, które prowadzi do klarownej cytozolowej "rozproszonej" fluorescencji TMR w około 100% komórek w hodowli.</li>
	<li>Zmieniaj stężenie MOI stosowane w protokole wspólnej inkubacji, utrzymując stężenie dfTAT na stałym poziomie (np. przy użyciu optymalnego stężenia dostarczania dfTAT). Zmiana czasu inkubacji na mniej niż 1 godzinę może być również opcją zmiany ilości dostarczanego MOI.</li>
</ol>

<ol><li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li>
<li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li>
<li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li>
<li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%3A+Technol%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li>
<li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li>
<li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li>
<li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4%2C+SOX2%2C+KLF4+and+c-MYC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li>
<li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li>
<li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li>
<li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides%3A+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chem%22%5BJournal%5D)">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li>
<li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li>
<li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+biophys+acta%22%5BJournal%5D)">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li>
<li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Komórki używane do dostarczania dfTAT nie powinny być nadmiernie zlewające (>90% konfluencji), ponieważ może to wpłynąć na wydajność dostarczania. Komórki powinny być również zdrowe: martwe komórki w hodowli mogą uwalniać apoptotyczne fragmenty, z którymi dfTAT może wchodzić w interakcje (np. DNA ze zdegradowanych jąder). To z kolei może wpływać na wydajność dostarczania i jakość obrazowania. Komórki należy dokładnie umyć, aby usunąć FBS przed dodaniem dfTAT. BSA obecne w FBS może wiązać się z dfTAT, co może obn...

Dostarczanie białek, peptydów lub małych cząsteczek nieprzepuszczalnych dla komórek do żywych komórek jest często pożądane w wielu zastosowaniach biologicznych lub biotechnologicznych (obrazowanie komórkowe, testy funkcjonalne, przeprogramowanie komórek, itp.)1-4. Opisano już wiele metod podawania, w tym mikroiniekcję, elektroporację lub stosowanie środków niosących (np. peptydów penetrujących komórki, takich jak TAT, lipidy)5-7. Każda technika ma zazwyczaj określone zalety i wady, które mogą sprawić, że te podejścia będą odpowiednie dla niektórych zastosowań, ale nie dla innych. Typowe problemy obejmują niską wydajność dostarczania i/lub brak kontroli nad ilością dostarczanego materiału8,9, toksyczność lub szkodliwy wpływ fizjologiczny10,11, brak kontroli czasowej, dostarczanie w kilku komórkach, ale nie w całej populacji (np. mikroiniekcja)12 oraz złożone schematy koniugacji chemicznej lub formulacji11.
Ostatnio opracowaliśmy nowatorską strategię dostarczania, która pozwala obejść te ograniczenia. Strategia ta opiera się na peptydzie o nazwie dfTAT (dimer fluorescencyjny TAT)13. dfTAT wywodzi się z dobrze znanego peptydu penetrującego komórki (CPP) TAT. dfTAT zawiera dwie dwusiarczkowe kopie TAT znakowane fluoroforem tetrametylorodaminą. Pomimo podobieństw, TAT i dfTAT różnią się znacznie pod względem aktywności. TAT jest zwykle internalizowany do komórek przez endocytozę. Ten CPP pozostaje jednak w większości uwięziony w endosomach (zwykle prowadzi to do punktowego rozkładu peptydu wewnątrz komórek podczas badania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej). Podobnie jak TAT, dfTAT jest skutecznie endocytozowany przez komórki. Jednak dfTAT nie pozostaje uwięziony w endosomach. Zamiast tego pośredniczy w wycieku endosomalnym w sposób, który jest niezwykle skuteczny. Aktywność endosomolityczna dfTAT może być następnie wykorzystana do dostarczania makrocząsteczek za pomocą prostego testu inkubacyjnego.
Obecne rozumienie procesu dostarczania jest następujące. dfTAT indukuje makropinocytozę. W rezultacie komórki inkubowane za pomocą dfTAT pobierają rozpuszczalne białka, peptydy lub małe cząsteczki (cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania, MOI) obecne w pożywkach przez endocytozę w fazie płynnej (patrz ryc. 1). Interakcje między dfTAT i MOI nie są konieczne, o ile obie jednostki komunikują się razem w szlaku endocytarnym. Gdy dfTAT osiąga pewien próg w świetle organelli endocytarnych, wyraża swoją endosomalną aktywność wyciekową (szczegóły molekularne pozostają do pełnego scharakteryzowania). Zawartość światła nieszczelnych organelli, a tym samym MOI, jest następnie uwalniana do komórek. Takie podejście jest zatem bardzo wygodne, ponieważ nie są wymagane żadne schematy koniugacji ani formułowania z MOI. Co więcej, ponieważ dfTAT nie modyfikuje bezpośrednio MOI, nie powinien również zakłócać funkcji MOI po osiągnięciu dostarczania wewnątrzkomórkowego. Ponadto stężenie zużytego dfTAT jest niezależne od stężenia MOI w pożywkach. Na przykład stężenie dfTAT może być utrzymywane na stałym poziomie między różnymi eksperymentami, aby zagwarantować powtarzalną skuteczność w przypadku wycieku endosomalnego. W przeciwieństwie do tego, stężenie MOI w pożywkach może być stopniowo zmieniane, aby osiągnąć pożądane poziomy MOI dostarczanego w cytozolu.
Wysoka skuteczność przecieku endosomalnego osiągnięta za pomocą dfTAT jest niezwykle nieszkodliwa dla wielu komórek testowanych do tej pory. Jest to niespodzianka, ponieważ organelle endocytarne są ważnym składnikiem komórek i można by się spodziewać, że dramatycznemu wyciekowi, w którym pośredniczy dfTAT, będą towarzyszyć szkodliwe odpowiedzi komórkowe. Jednak leczone komórki namnażają się w tym samym tempie co komórki nieleczone i nie wykazują żadnych znaczących zmian w swoim transkryptomie. Co więcej, poród można powtórzyć w ciągu kilku minut z powtarzalną wydajnością dostarczania, co wskazuje, że komórki mogą tolerować lub regenerować się po procesie dostarczania bez utraty zdolności do endocytozy lub wycieku endosomalnego. Subtelne reakcje komórkowe mogą mieć miejsce podczas dostarczania dfTAT, a molekularne szczegóły tego, jakie mogą być te reakcje, pozostają do zbadania. Jednak dzięki połączeniu wysokiej wydajności, wygody protokołów i braku toksyczności, to podejście do dostarczania powinno okazać się natychmiast przydatne w wielu zastosowaniach opartych na komórkach. Przedstawione w niniejszym dokumencie protokoły mają na celu udostępnienie tej technologii środowisku naukowemu.

<table><tbody><tr><td>Heparyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&ndash;) cysteina</td><td>Hyclon</td><td></td><td>Na specjalne zamówienie</td></tr><tr><td>Aminokwasy chronione Fmoc</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>Próbki zostaną dostarczone na życzenie (kontakt: pellois@tamu.edu)</td></tr> <tr>Szafa <td></td><td></td><td></td><td>bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>model IXB1</td><td>wyposażony w stopień grzewczy utrzymywany na poziomie 37 stopni; C oraz z podświetlaną kamerą Rolera-MGI Plus z urządzeniem EMCCD (Qimaging) z podświetlanym światłem elektronowym.&nbsp;</td></tr><tr><td>37 &stopnie; C nawilżany, 5% inkubator</td><td></td><td></td><td></td>CO2</tr><tr><td>Syntezator peptydów lub naczynie do przygotowania ręcznej syntezy</td><td></td><td></td><td></td> peptydów</tr></tbody></table>

dostarczanie białek, peptydów lub nieprzepuszczalnych dla komórek małych cząsteczek do żywych komórek przez inkubację z odczynnikiem endosomolitycznym dftat

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Strategie dostarczania makromolekularnego zazwyczaj wykorzystują szlak endocytarny jako drogę wejścia do komórki. Jednak uwięzienie endosomalne poważnie ogranicza efektywność, z jaką makrocząsteczki przenikają do cytozolowej przestrzeni komórek. Ostatnio obeszliśmy ten problem, identyfikując odczynnik dfTAT, dimer wiązania dwusiarczkowego peptydu TAT znakowany fluoroforem tetrametylorodaminą. Uzyskaliśmy znakowany fluorescencyjnie dimer prototypowego peptydu penetrującego komórki (CPP) TAT, DFTAT, który wnika do żywych komórek i dociera do przestrzeni cytozolowej komórek ze szczególnie wysoką wydajnością. Cytozolowe dostarczanie dfTAT osiąga się w wielu liniach komórkowych, w tym w komórkach pierwotnych. Co więcej, dostarczanie nie wpływa zauważalnie na żywotność komórek, proliferację ani ekspresję genów. dfTAT może dostarczać małe cząsteczki, peptydy, przeciwciała, biologicznie aktywne enzymy i czynnik transkrypcyjny. W tym raporcie opisujemy protokoły związane z syntezą dfTAT i dostarczaniem komórkowym. W manuskrypcie opisano, w jaki sposób można kontrolować ilość białka dostarczanego do przestrzeni cytozolowej komórek poprzez różnicowanie ilości białka podawanego zewnątrzkomórkowo. Na koniec omówiono obecne ograniczenia tej nowej technologii i kroki związane z walidacją dostarczania. Opisane protokoły powinny być niezwykle przydatne w testach komórkowych, a także w manipulacji ex vivo i przeprogramowywaniu komórek.

Aby ocenić różnicę między fTAT a dfTAT, komórki HeLa inkubowano przez 1 hr z każdym z peptydów w celu określenia różnic w ich lokalizacji komórkowej. Internaliyzyczną obu CPP oceniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Rysunek 2 pokazuje, że fTAT (20 µM) lokalizuje się w rozkładzie punktowym. Rozkład ten jest zgodny z uwięzieniem peptydów wewnątrz endosomów. W przeciwieństwie do tego, sygnał fluorescencyjny dfTAT (5 µM) wykazuje jednorodny rozkład w całej cytozoli i jądrze komórkowym. Rysune...

Opisujemy, jak dostarczać białka i nieprzepuszczalne dla komórek małe cząsteczki do hodowanych komórek ssaków za pomocą prostego protokołu koinkubacji z odczynnikiem, który powoduje nieszczelność organelli endocytarnych.

Dostarczanie białek, peptydów lub nieprzepuszczalnych dla komórek małych cząsteczek do żywych komórek przez inkubację z odczynnikiem endosomolitycznym dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest dostarczenie makrocząsteczek do żywych komórek przy użyciu dimeru fluorescencyjnego tat lub df tat – odczynnika, który potrafi bardzo wydajnie przenikać do komórek, nie uszkadzając ich. Osiąga się to poprzez najpierw wytworzenie i oczyszczenie czynnika dostarczającego, a w drugim kroku df tat.Dfta inkubuje się z komórkami przez jedną godzinę w temperaturze 37°C w obecności interesującego nas ładunku makromolekularnego; df tat indukuje wchłanianie ładunku do pęcherzyków endocytarnych. Pęcherzyki dojrzewają do wczesnych endosomów, osiągając ostatecznie etap późnego endosomu, w którym DF tat jest w stanie uwolnić ładunek do przestrzeni cytozolicznej komórek. Następnie komórki obrazuje się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu oceny wydajności dostarczania detta oraz interesującego nas ładunku.Wyniki wykazują, że DF TT może wnikać do komórek z wysoką wydajnością i bez zauważalnej cytotoksyczności; DF tat może dostarczać makrocząsteczki o różnych rozmiarach do przestrzeni cytozolicznej komórek, co można zaobserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami dostarczania w for

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Transdukcja białek umożliwia bezpośrednie dostarczanie biologicznie czynnych białek do komórek. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, takich jak transfekcja DNA czy transdukcja wirusowa, ten nieinwazyjny paradygmat pozwala na wysoce efektywną manipulację komórkową w sposób miareczkowalny, unikając toksyczności komórkowej oraz ryzyka transformacji onkogennej wynikającej z trwałej modyfikacji genetycznej.

Inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę ilościowego pomiaru translokacji peptydów do dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych. Metoda ta dostarcza również informacji o szybkości translokacji przez błonę i może być wykorzystana do identyfikacji peptydów, które w sposób wydajny i spontaniczny przenikają przez dwuwarstwy lipidowe.

Pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednowarstwowych

W tym filmie pokazujemy wprowadzanie białek efektorowych bakterii do komórek ssaków za pomocą elektroporacji. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja bakteryjnych białek efektorowych jest wykrywana za pomocą mikroskopii konfokalnej po barwieniu specyficznymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem.

Wprowadzenie bakteryjnych białek efektorowych do komórek ssaków za pomocą elektroporacji

Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.

Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego

Elektroporacja została użyta do wprowadzenia oczyszczonych bakteryjnych białek efektorowych wirulencji bezpośrednio do żywych komórek eukariotycznych. Lokalizację białek monitorowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na badania nad transportem, funkcją i interakcjami białko-białko przy użyciu aktywnych białek egzogennych, unikając potrzeby heterologicznej ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Domeny palców cynkowych są z natury przepuszczalne dla komórek i zdolne do pośredniczenia w dostarczaniu białek do szerokiego zakresu typów komórek ssaków. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku wdrażania technologii palca cynkowego do wewnątrzkomórkowego dostarczania białka.

Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys2-his 2 palców cynkowych

To jest protokół do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko oparty na systemie pull-down biotyna-awidyna z nowością łączenia sekwencji penetrujących komórki. Główną zaletą jest to, że sekwencja docelowa jest inkubowana z żywymi komórkami, a nie z lizatami komórkowymi, a zatem interakcje będą zachodzić w kontekście komórkowym.

Biotynylowane peptydy penetrujące komórki do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Test wycieku fluorescencji to prosta metoda, która umożliwia badanie interakcji peptyd/błona, aby zrozumieć ich udział w kilku procesach biologicznych, a zwłaszcza zdolność peptydów penetrujących komórki do zakłócania dwuwarstwowych fosfolipidów podczas bezpośredniego procesu translokacji komórkowej.

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Ładowanie koralików wprowadza białka, plazmidy i cząsteczki do przylegających komórek ssaków. Ta technika ładowania komórek jest niedroga, szybka i nie wpływa znacząco na zdrowie komórek. Najlepiej nadaje się do obrazowania żywych komórek.

Ładowanie kulek białek i kwasów nukleinowych do przylegających komórek ludzkich

Endocytowy i retrogradacyjny transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony i regulacji sygnalizacji. Tutaj opisujemy metodę obrazowania i ilościowego transportu endocytarnego białek transbłonowych za pomocą mikroskopii komórek żywych, wykorzystując deriwatyzowane nanociała anty-GFP w komórkach HeLa.

Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Poznaj metodę dostarczania białek i nieprzepuszczalnych cząsteczek do żywych komórek ssaczych przy użyciu odczynnika endosomolitycznego dfTAT. Technika ta umożliwia wysokowydajną dostawę ładunku bez uszkadzania komórek.

Dostarczanie białek, peptydów lub nieprzepuszczalnych dla komórek małych cząsteczek do żywych komórek przez inkubację z odczynnikiem endosomolitycznym dfTAT (Wideo) | JoVE Journal

Dostarczanie białek, peptydów lub nieprzepuszczalnych dla komórek małych cząsteczek do żywych komórek przez inkubację z odczynnikiem endosomolitycznym dfTAT

Przeglądaj więcej filmów