Ocena wrażliwości okołopłciowej i aktywacji komórek tucznych gruczołu krokowego w mysim modelu separacji noworodków od matek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie wpływu stresu we wczesnym okresie życia na układ moczowo-płciowy poprzez pomiar wrażliwości mechanicznej okołopłciowej narządów płciowych i aktywacji komórek tucznych w obrębie prostaty u samców sześciu czarnych myszy C 57, które przeszły separację noworodków od matki. Osiąga się to poprzez pierwsze rozdzielenie noworodków na miotach C 57 czarnych sześciu młodych myszy w celu wywołania stresu we wczesnym okresie życia przez 20 kolejnych dni. Drugim krokiem jest pomiar wrażliwości mechanicznej okołopłciowej narządów płciowych poprzez nałożenie serii monofili Von Fre na okolicę narządów płciowych.

Następnie zakwaszone barwienie błękitem toluidynowym przeprowadza się na skręcinach kriostatu myszy. W celu ilościowego określenia aktywacji komórek tucznych. Wyniki pokazują, że separacja noworodków od matki zwiększa wrażliwość mechaniczną okołopłciową narządów płciowych i aktywację protetycznych komórek tucznych na podstawie naszych analiz behawioralnych i histologicznych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie gruczołu krokowego, jest to, że obejmuje ona ekspozycję na stres we wczesnym okresie rozwoju, co przyspiesza objawy w późniejszym życiu, podobnie jak u pacjentów z przewlekłym zapaleniem gruczołu krokowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przewlekłego bólu miednicy, takie jak wpływ stresu we wczesnym okresie życia na zachowanie, a także dostarczyć histologicznych dowodów na zmienione stany bólowe. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w przewlekłe zapalenie gruczołu krokowego, może być również stosowana do innych funkcjonalnych zespołów bólowych, takich jak śródmiąższowe zapalenie pęcherza moczowego, zespół bolesnego pęcherza, wulwodynia, fibromialgia lub migreny.

Może być nawet stosowany do innych powszechnych chorób współistniejących psychicznych, takich jak lęk i depresja Dzień po urodzeniu wyjmij koferdam z klatki domowej i umieść ją w czystym pojemniku wtórnym. Przetrzyj garść pościeli między czystymi rękami w rękawiczkach, aby utrzymać zapach domowej klatki, a następnie przenieś głębokość od jednego do dwóch centymetrów ściółki domowej klatki do czystego, odpowiednio oznakowanego dwulitrowego szklanego głośnika. Dodatkowo, przy około połowie dodatkowego materiału ściółkowego wzbogacającego, który znajduje się w klatce domowej, takiego jak gniazda lub papier marszczony, do szklanego głośnika następnie, umieść wszystkie młode z jednego miotu w przygotowanej zlewce i natychmiast umieść zlewkę w temperaturze 33 stopni Celsjusza i wilgotności 50% na 180 minut.

Podczas oddzielonego okresu inkubacji należy wyjąć zaporę z pojemnika wtórnego i umieścić ją z powrotem w klatce domowej. Przywróć klatkę domową do odpowiedniego miejsca w wiwarium. Pod koniec okresu separacji wyjmij klatkę domową i usuń zaporę, umieszczając ją w czystym pojemniku wtórnym.

Następnie wyjmij zlewkę z inkubatora i wrzuć garść ściółki między czyste ręce w rękawiczkach, aby utrzymać zapach domowej klatki podczas obchodzenia się ze szczeniętami. Delikatnie przenieś młode pojedynczo ze zlewki do klatki domowej i włóż wszelkie wzbogacenie i ściółkę pozostałą w zlewce do klatki domowej. Po zwróceniu wszystkich szczeniąt przenieś zaporę z pojemnika wtórnego do klatki domowej i umieść ją w odpowiednim miejscu w wiwarium.

Powtarzaj całą tę procedurę dla każdego miotu poddawanego separacji noworodków codziennie do 21 dnia po urodzeniu. Następnie odsadz szczenięta od piersi i trzymaj je w tych samych warunkach, co myszy kontrolne przez cały czas trwania eksperymentu. Przygotuj obszar testowy, umieszczając chłonny podkład pod podwyższonym stołem z siatki drucianej o wysokości 55 centymetrów.

Stół powinien zapewniać wystarczająco dużo miejsca, aby umożliwić badaczowi zbliżenie się od spodu bez płoszenia myszy. Umieść do 12 ośmiotygodniowych myszy pojedynczo w przezroczystych, perforowanych plastikowych komorach na stole z siatki drucianej. Umieść ciężki przedmiot na komorach, aby zapobiec ucieczce myszy.

Przytrzymaj podstawę trzypunktowej 22-gramowej żyłki z ramką i odsłoń schowaną żyłkę. Ustaw sondę tak, aby żyłka była zorientowana pionowo. Kiedy mysz jest czujna, nieruchoma, a jej ciężar ciała rozkłada się równomiernie między tylnymi łapami.

Nałóż go na lewą lub prawą stronę moszny, omijając linię środkową, aż do momentu zaobserwowania lekkiego zgięcia we włóknie. Przytrzymaj żyłkę w miejscu przez 10 sekund lub do momentu, gdy zwierzę wykaże pozytywną reakcję, taką jak energiczne szarpnięcie lub skok, lizanie lub gryzienie skierowane w stronę żyłki. Jeśli mysz ani się nie rusza, ani nie wykazuje żadnych pozytywnych odpowiedzi podczas dziesięciosekundowej aplikacji monofilamentu, nagraj test negatywnej odpowiedzi wszystkich myszy przy użyciu filamentu o tym samym rozmiarze, a następnie przełącz się na następny odpowiedni monofilament.

Kontynuuj testowanie każdej myszy przy użyciu następnej większej lub mniejszej żyłki, w zależności od potrzeb, dla dodatkowych czterech zastosowań. Po zaobserwowaniu pierwszej pozytywnej odpowiedzi należy wypreparować, a następnie wykonać kriosekcję, utrwalić tkankę prostaty od dziewięciotygodniowych myszy w kriogenicznych sekcjach o grubości siedmiu mikronów. Następnie przygotuj 1% roztwór podstawowy błękitu toluidynowego, dodając jeden gram błękitu toluidynowego O do 100 mililitrów 70% etanolu i mieszaj mieszaninę, aż przejdzie do roztworu.

Roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez okres do trzech tygodni. W innej zlewce dodaj jeden gram chlorku sodu do 100 mililitrów wody umieszczonej na talerzu do mieszania. Dostosuj pH roztworu soli za pomocą 12-molowego kwasu solnego, aż do uzyskania zakresu pH od 0,5 do 1,0.

Następnie przygotuj 0,25% zakwaszony roztwór roboczy w kolorze niebieskiej toiny, łącząc osiem mililitrów roztworu podstawowego błękitu Udine i 32 mililitry kwaśnego 1% roztworu chlorku sodu. w górę iw dół, aby zapewnić całkowite włączenie roztworu podstawowego odine blue i wymieszać Za pomocą wiru przygotuj świeży roztwór roboczy dla każdej partii szkiełek. Umyj skrawki tkanki, zanurzając pojedynczo szkiełka na około jedną sekundę w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów zawierającej wystarczającą objętość PBS, aby całkowicie zanurzyć tkankę.

Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu na ręczniku papierowym. Następnie umieść szkiełka w szklanym słoiku zawierającym wystarczającą ilość 0,25% roztworu roboczego błękitu toluidynowego, aby zapewnić, że skrawki tkanki zostaną całkowicie zanurzone. Inkubuj szkiełka przez 10 do 15 minut, siedząc na kołysce platformy ustawionej na 15 obr./min.

Następnie zanurz szkiełka w PBS na około jedną sekundę, aby zmyć nadmiar wysokiego błękitu udine i umieść szkiełka w pudełku na slajdy tak, aby szkiełka znajdowały się na bokach. Aby umożliwić drenaż. Szkiełka suszyć w piekarniku w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez minimum dwie godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej.

Po wyschnięciu zanurz szkiełka w 95% etanolu na około jedną sekundę, a następnie pozostaw sekcję do całkowitego wyschnięcia. Powtórz tę procedurę od jednego do 10 razy, aż tkanka wyschnie bardziej na niebiesko niż fioletowo. Następnie zanurz szkiełka w 100% etanolu na około jedną sekundę i pozostaw sekcję do całkowitego wyschnięcia.

Powtórz tę procedurę od jednego do 10 razy, aż tkanka stanie się ciemnoniebieska lub średnio niebieska, ale nie fioletowa. Na koniec napraw plamę, inkubując szkiełka w 100% ksylenie przez trzy minuty. Pozostaw je do wyschnięcia, a następnie przykryj, wsuń szkiełka za pomocą glicerolu PPS lub stałego nośnika montażowego na bazie ksylenu.

Odcedź nadmiar nośnika i przechowuj gotowe szkiełka w temperaturze pokojowej. Podczas testów z klasyfikowaną serią monofilamentów Von Frame, ośmiotygodniowej separacji noworodków od matek, myszy wykazywały allodynię mechaniczną okołopłciową w porównaniu z naiwnymi odpowiednikami. Świadczy o tym znaczne obniżenie mechanicznego progu wycofania, które wywołało pozytywną reakcję behawioralną.

Dodatkowe dowody przewlekłego zapalenia gruczołu krokowego Zespół przewlekłego bólu miednicy można zobaczyć histologicznie pokazane tutaj skrawki kriostatu tkanek prostaty, które zostały zabarwione zakwaszonym o błękitem toluidynowym w celu obserwacji granulek tryptazy znajdujących się w komórkach tucznych. Istotnie wyższy odsetek granulowanych komórek tucznych zaobserwowano w skrawkach prostaty u noworodków separujących myszy. W porównaniu z naiwnymi myszami Podczas separacji noworodków od matki ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu zapachu klatki domowej, aby uniknąć odrzucenia szczeniąt przez matkę Postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak testy w otwartym polu lub preferencja dwóch wyborów płynów, mogą być wykorzystane do oceny dowodów behawioralnych na współistniejące zaburzenia nastroju. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić wrażliwość mechaniczną narządów płciowych i aktywację komórek tucznych prostaty jako behawioralny i histologiczny dowód przewlekłego zapalenia gruczołu krokowego i myszy po separacji noworodków.