Name: Ocena wrażliwości okołopłciowej i aktywacji komórek tucznych gruczołu krokowego w mysim modelu separacji noworodków od matek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę oceny wrażliwości okołopłciowej i aktywacji komórek tucznych gruczołu krokowego u myszy C57BL/6 po separacji noworodków od matek. Model ten pozwala badać wpływ stresu wczesnodziecięcego na układ moczowo-płciowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Janelle Ryals, Rachel Supple i Frankowi Wangowi za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez granty NIH R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), grant Centrum Doskonałości Badań Biomedycznych (COBRE) P20 GM104936 (JAC), fundusze na rozpoczęcie działalności i podstawowe wsparcie z Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, podstawowe wsparcie z Kansas IDDRC P30 HD002528 oraz The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Wszystkie eksperymenty opisane w tym protokole są zgodne z wytycznymi NIH zgodnie z wytycznymi określonymi przez University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Separacja noworodków (NMS)
<ol>
	<li>Codziennie monitoruj ciężarne matki pod kątem narodzin w miocie. 
	Uwaga: Dzień narodzin miotu jest uważany za P0.</li>
	<li>Na P1 wyjmij zaporę z klatki domowej i umieść ją w czystym pojemniku wtórnym.</li>
	<li>Wetrzyj garść pościeli w dłonie w czystych rękawiczkach, aby utrzymać zapach domowej klatki.</li>
	<li>Dodaj głębokość 1-2 cm ściółki z klatki domowej do czystej, odpowiednio oznakowanej szklanej zlewki o pojemności 2 l. Do szklanej zlewki dodać około połowy dodatkowego materiału ściółkowego do wzbogacania materiału wypełniającego, który znajduje się w klatce domowej, np. gniazda, papieru do marszczenia.</li>
	<li>Delikatnie umieść wszystkie szczenięta z jednego miotu, pojedynczo, w tej samej zlewce.</li>
	<li>Zlewkę należy natychmiast umieścić w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 33 oC i wilgotności 50% przez 180 minut.</li>
	<li>Wyjmij zaporę z dodatkowego pojemnika i włóż ją z powrotem do klatki domowej. Przywróć klatkę domową do odpowiedniego miejsca w wiwarium.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę dla każdego miotu poddawanego NMS, używając czystych rękawiczek i dodatkowych pojemników dla każdego miotu/matki.</li>
	<li>Po upływie 180-minutowego okresu separacji należy umieścić mioty z powrotem w klatkach domowych w tej samej kolejności, w jakiej zostały usunięte.</li>
	<li>Odzyskaj klatkę domową pierwszego miotu, który został oddzielony wcześniej tego dnia. Wyjmij zaporę z klatki domowej i umieść w czystym pojemniku wtórnym.</li>
	<li>Wyjmij pierwszą zlewkę z inkubatora i wetrzyj garść ściółki w czyste ręce w rękawiczkach, aby utrzymać zapach domowej klatki podczas pracy ze szczeniętami.</li>
	<li>Delikatnie przenieś szczenięta, pojedynczo, ze zlewki do klatki domowej.</li>
	<li>Wszelki materiał wzbogacający i ściółkę pozostały w zlewce należy zwrócić do klatki domowej.</li>
	<li>Zwróć zaporę z pojemnika wtórnego do klatki domowej i umieść ją w odpowiednim miejscu w pomieszczeniu w wiwarium.</li>
	<li>Opłucz zlewkę wodą i włóż ją z powrotem do inkubatora. Używaj tej samej zlewki dla każdego miotu przez cały czas trwania procedury oddzielania.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę dla każdego miotu poddanego NMS w tej samej kolejności, w jakiej zostały umieszczone w inkubatorze.</li>
	<li>Powtarzaj całą tę procedurę dla każdego miotu poddawanego NMS codziennie przez P21.</li>
	<li>Odstaw od piersi NMS i naiwne szczenięta na P22, umieszczając rodzeństwo z miotu tej samej płci razem w czystych klatkach wraz z jedzeniem i wodą. Naiwne szczenięta powinny rodzić się i być trzymane w tych samych warunkach, co myszy NMS, ale nie powinny być poddawane żadnym dodatkowym czynnościom poza normalnymi zadaniami związanymi z hodowlą zwierząt.</li>
</ol>
2. Okołopłciowa wrażliwość mechaniczna
<ol>
	<li>Konfiguracja aparatu von Freya
	<ol>
		<li>Przynieś myszy do pokoju testowego i pozwól im zaaklimatyzować się przez 30 minut, pozostając w swoich domowych klatkach.</li>
		<li>Przygotuj obszar testowy, umieszczając chłonny podkład pod podwyższonym stołem z siatki drucianej (79 cm x 28 cm), który zapewnia wystarczająco dużo miejsca, aby umożliwić badaczowi podejście od spodu bez płoszenia myszy o wysokości około 55 cm.</li>
		<li>Umieść do 12 myszy pojedynczo w przezroczystych, perforowanych plastikowych komorach (11 cm x 5 cm x 3.5 cm) na stole z siatki drucianej. Umieść ciężki przedmiot na komorach, aby zapobiec ucieczce myszy.</li>
		<li>Przyzwyczaj myszy przez dodatkowe 30 minut na ekranie przed oceną progu odstawienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena wrażliwości mechanicznej okołopłciowej
	<ol>
		<li>Metodę góra-dół należy wykonać przy użyciu standardowego zestawu stopniowanych monofili von Freya43. Używaj następujących monofili: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g i 4,74 g.
		<ol>
			<li>Chwyć podstawę żyłki 3,22 g i odsłoń schowaną żyłkę. 
			Uwaga: Niektóre modele mogą nie mieć wsuwanej żyłki.</li>
			<li>Ustaw sondę tak, aby żyłka była zorientowana pionowo, a gdy mysz jest czujna, nieruchoma, a jej ciężar ciała rozkłada się równomiernie między tylnymi łapami, przyłóż ją do lewej lub prawej strony moszny, unikając linii środkowej, aż do zaobserwowania lekkiego wygięcia we włóknie.</li>
			<li>Przytrzymaj żyłkę na miejscu przez 10 sekund lub do momentu, gdy zwierzę wykaże pozytywną reakcję. 
			Uwaga: Za pozytywną reakcję uważa się energiczne szarpnięcie lub skok w odpowiedzi na aplikację żyłki lub lizanie lub gryzienie skierowane w stronę żyłki. Jeśli mysz poruszy się podczas 10-sekundowej aplikacji żyłki bez wyświetlania tych zachowań, żyłka musi zostać ponownie przetestowana po co najmniej 1-minutowym okresie odpoczynku. Jeśli mysz ani się nie rusza, ani nie wykazuje żadnego z wyżej wymienionych zachowań podczas 10-sekundowej aplikacji żyłki, uważa się to za reakcję negatywną.</li>
			<li>Zapisz odpowiedź, negatywną lub pozytywną, w notatniku laboratoryjnym lub laptopie i powtórz tę procedurę na wszystkich pozostałych myszach przy użyciu żyłki o gramaturze 3,22 g.</li>
			<li>Przetestuj wszystkie myszy ponownie, używając następnej odpowiedniej żyłki. Uwaga: Jeśli mysz wykazała negatywną reakcję na żyłkę 3,22 g, nałóż żyłkę 3,61 g w ten sam sposób i zapisz odpowiedź. Jeśli mysz wykazała pozytywną reakcję na monofilamentkę 3,22 g, zastosuj żyłkę 2,83 g i zapisz odpowiedź.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kontynuuj testowanie każdej myszy przy użyciu następnej większej lub mniejszej żyłki, w zależności od przypadku, dla dodatkowych 4 aplikacji po zaobserwowaniu pierwszej pozytywnej odpowiedzi.</li>
		<li>Wróć myszy do klatek domowych.</li>
		<li>Wartość końcowej żyłki von Freya zastosowanej w serii próbnej w jednostkach logarytmicznych należy wykorzystać do obliczenia progu poboru 50 % g zgodnie z opisem w Chaplan i wsp.Lokal mieszkalny 43.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zakwaszone barwienie toluidynowych niebieskich komórek tucznych
<ol>
	<li>Przetwarzanie tkanek
	<ol>
		<li>Wypreparuj tkankę prostaty44 od myszy, które zostały perfundowane śródsercowo lodowatym 4% paraformaldehydem45. Utrwalić tkankę w 4% paraformaldehydzie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie krioprotekcjonalizować w 30% sacharozie w 1x PBS w temperaturze 4 °C O/N.</li>
		<li>Przygotuj małą (30 ml) kąpiel z heptanem i umieść ją na suchym lodzie.</li>
		<li>Opłucz tkankę prostaty w 1x PBS i osusz lekką chusteczką.</li>
		<li>Włóż tkankę prostaty do zimnego heptanu, aż zostanie zamrożona.</li>
		<li>Natychmiast umieść zamrożoną tkankę prostaty w kriomold zawierającym pożywkę montażową i umieść na suchym lodzie do momentu zamrożenia.</li>
		<li>Przechowywać krioformy w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przetnij poprzecznie tkankę prostaty na kriosekcje o grubości 7 μm za pomocą kriostatu.</li>
		<li>Umieść 8 - 12 nieseryjnych kriosekcji, które rozciągają się na całej długości tkanki, na dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych.</li>
		<li>Gotowe preparaty przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszej obróbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zakwaszonego błękitu toluidynowego
	<ol>
		<li>Dodać 1 g błękitu toluidynowego O do 100 ml 70% etanolu i mieszać aż do roztworu, aby przygotować 1% roztwór podstawowy. Roztwór podstawowy może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez okres do trzech tygodni.</li>
		<li>Dodać 1 g NaCl do 100 ml wody w zlewce umieszczonej na mieszance.</li>
		<li>Dostosuj pH roztworu NaCl za pomocą 12 M HCl, aż do uzyskania zakresu pH 0,5 - 1,0.</li>
		<li>Przygotować 0,25% roztwór roboczy błękitu toluidynowego, łącząc 8 ml roztworu podstawowego błękitu toluidynowego i 32 ml 1% roztworu NaCl. Pipetować w górę i w dół, aby zapewnić całkowite włączenie roztworu podstawowego błękitu toluidynowego i mieszać za pomocą wiru. Roztwór roboczy musi być świeży i wyrzucony po użyciu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie kriosekcji prostaty
	<ol>
		<li>Wyjmij szkiełka przeznaczone do obróbki z zamrażarki i pozostaw do wyrównania do temperatury suchej przez około 30 minut.</li>
		<li>Umyj skrawki tkanki, zanurzając szkiełka pojedynczo na około 1 sekundę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej wystarczającą objętość 1x PBS, aby upewnić się, że sekcje tkanek zamontowane na szkiełku będą całkowicie zanurzone. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu na ręczniku papierowym.</li>
		<li>Umieść szkiełka w szklanym słoiku do barwienia zawierającym wystarczającą ilość 0,25% roboczego roztworu błękitu toluidynowego, aby zapewnić, że sekcje tkanek zamontowane na szkiełku zostaną całkowicie zanurzone i będą inkubować przez 10 - 15 minut na kołysce platformy ustawionej na 15 obr./min.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w 1x PBS na około 1 sekundę, aby wypłukać nadmiar błękitu toluidynowego.</li>
		<li>Umieść szkiełka w pudełku na suwaki lub stojaku w taki sposób, aby szkiełka znajdowały się na bokach, aby umożliwić drenaż.</li>
		<li>Suszyć szkiełka w piekarniku w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny lub O/N przy RT.</li>
		<li>Szybko odwodnij szkiełka za pomocą alkoholu, pozwalając im całkowicie wyschnąć między ekspozycjami na alkohol. Wysuszyć szkiełka, odsączając na ręczniku papierowym i wycierając grzbiety i krawędzie lekką chusteczką.
		<ol>
			<li>Zanurz szkiełka w 95% EtOH na około 1 sekundę i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Powtórz tę procedurę 1 - 10 razy, aż tkanka wyschnie bardziej niebiesko niż fioletowo.</li>
			<li>Zanurz szkiełka w 100% EtOH na około 1 sekundę i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Powtórz tę procedurę 1 - 10 razy, aż tkanka stanie się ciemnoniebieska lub średnio niebieska, ale nie fioletowa.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Napraw plamę, inkubując szkiełka w 100% ksylenie przez 3 minuty. Pozostawić do wyschnięcia.</li>
		<li>Szkiełko nakrywkowe należy nakryć trwałymi środkami mocującymi na bazie glicerolu, PBS lub ksylenu. Odcedź nadmiar nośnika i przechowuj w RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja komórek tucznych
	<ol>
		<li>Wizualizuj skrawki tkanek zabarwione toluidyną na niebiesko w 20-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii świetlnej (ryc. 2).</li>
		<li>Policz całkowitą liczbę komórek tucznych obecnych w wizualizowanym obszarze i rozróżnij niezdegranulowane i zdegranulowane komórki tuczne. 40-krotne powiększenie może być konieczne, aby potwierdzić stan ziarninacji w niektórych komórkach tucznych. 
		Uwaga: Niezdegranulowane komórki tuczne wykazują gęstą metachromazję bez lub ze słabym konturem jądra i/lub bez ziarnistego wytłaczania wokół komórki. Degranulowane komórki tuczne wykazują mniej intensywną metachromazję i mają oczywisty wyraźny zarys jądra i/lub wolnych granulek w cytoplazmie i poza granicą komórki.</li>
		<li>Kontynuuj ocenę całkowitej liczby niezdegranulowanych i zdegranulowanych komórek tucznych w całym bieżącym odcinku tkanki. Powtórz tę procedurę na co najmniej 7 dodatkowych oddzielnych odcinkach, obejmujących długość każdej tkanki.</li>
		<li>Obliczyć procentową zawartość zdegranulowanych (DG) w stosunku do całkowitej liczby komórek tucznych dla każdej tkanki/myszy zgodnie z następującym równaniem: (DG komórki tuczne / Całkowita liczba komórek tucznych) x 100.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zawiera metodologię wykorzystania stresu noworodkowego w postaci NMS do wywołania objawów wskazujących na CP / CPPS u dorosłych samców myszy. Jako dorosłe myszy NMS wykazują znaczną allodynię mechaniczną okołopłciową, a także dowody na degranulację komórek tucznych w tkance prostaty. Zastosowanie NMS jest nowatorskim podejściem do opracowania przedklinicznego modelu CP/CPPS, ponieważ odtwarza stres we wczesnym okresie życia, który jest często zgłaszany przez pacjentów z przewlekłym bólem miednicy12-14</...

Przewlekły ból miednicy sam w sobie nie jest chorobą, ale raczej terminem związanym z ciągłym spontanicznym i/lub wywołanym bólem doświadczanym przez pacjentów, u których zdiagnozowano zespół jelita drażliwego (IBS), śródmiąższowe zapalenie pęcherza moczowego/zespół bolesnego pęcherza moczowego (IC/PBS), wulwodynię lub przewlekłe zapalenie gruczołu krokowego/zespół przewlekłego bólu miednicy (CP/CPPS). Zespoły te są często współistniejące i mają wiele wspólnych cech, ponieważ nie mają powiązanej patologii ani zidentyfikowanej etiologii, chociaż wykazano, że dysfunkcja w obrębie układu odpornościowego, ośrodkowego układu nerwowego i obwodowego układu nerwowego przyczynia się do utrzymania i progresji tych zaburzeń1-3. Pacjenci z przewlekłym bólem miednicy są bardziej narażeni na objawy dodatkowych, niezwiązanych z miednicą zaburzeń bólu czynnościowego i zaburzeń nastroju, w tym lęku, depresji i zespołu lęku napadowego4-6, co wiąże się ze zmienionym funkcjonowaniem osi podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA)7-10. Narażenie na stres lub traumę we wczesnym okresie życia jest istotnym czynnikiem ryzyka rozwoju nieprawidłowości HPA i związanych z nimi przewlekłych zespołów bólowych10,11 i w związku z tym znaczna podgrupa pacjentów z funkcjonalnymi zaburzeniami bólu miednicy zgłasza, że doświadczyła niepożądanych zdarzeń w dzieciństwie, takich jak znęcanie się lub zaniedbanie12-14.
Modele separacji noworodków (NMS), które polegają na usunięciu młodych od matki na określony czas w okresie przed odsadzeniem, były używane przez ostatnie dwie dekady do badania wyników stresu we wczesnym okresie życia. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że NMS zwiększa aktywację osi HPA i wynikające z niej zachowania podobne do lęku, bezpośrednio wpływając na ekspresję genów w podwzgórzu, a także zakłócając dalszą regulację ze struktur limbicznych15-18. Wykazano, że zakłócenie prawidłowego funkcjonowania osi HPA przyczynia się do zwiększonej wrażliwości jelita grubego19-22 i pochwy16 wykazywanej przez modele NMS gryzoni, ale pomimo obszernej charakterystyki długoterminowych skutków poporodowego zapalenia pęcherza moczowego23-25, wpływ stresu we wczesnym okresie życia w dużej mierze nie został zbadany w narządach moczowo-płciowych. Dlatego w poniższym badaniu opisano, jak wykonać NMS u myszy, a następnie ocenić wrażliwość mechaniczną okołopłciową i infiltrację/aktywację komórek tucznych w prostacie, aby potwierdzić zastosowanie samców myszy NMS jako modelu przedklinicznego CP / CPPS.
Spośród wszystkich zdiagnozowanych przewlekłych zaburzeń bólowych miednicy, CP/CPPS jest prawdopodobnie najmniej rozpoznanym i scharakteryzowanym zespołem, pomimo częstości występowania w ciągu życia około 14% 26 i rocznych kosztów leczenia szacowanych na $4,400 (dwa razy więcej niż ból krzyża lub reumatoidalne zapalenie stawów27). Pacjenci z CP/CPPS zgłaszają ból krocza, odbytnicy, prostaty, prącia, jąder i/lub brzucha28, doświadczają wyższego stopnia stresu psychicznego niż pacjenci z grupy kontrolnej29 i często występują u nich objawy przewlekłego bólu miednicy lub zaburzeń nastroju lub u których diagnozuje się współistniejące przewlekłe bóle miednicy lub zaburzenia nastroju5,29-31. Nawracające infekcje, nieszczelny nabłonek, zapalenie neurogenne i autoimmunizacja zostały uznane za potencjalne przyczyny CP / CPPS2,32,33, a także aktywacji i degranulacji komórek tucznych34. Wyrażona wydzielina prostaty od mężczyzn z CP / CPPS miała zwiększony poziom tryptazy komórek tucznych i czynnika wzrostu nerwów (NGF)34, a późniejsze badanie potwierdziło, że tryptaza i karboksypeptydaza A (CPA3), marker aktywacji komórek tucznych, były również zwiększone w moczu pacjentów z CP / CPPS35. Potencjalna rola komórek tucznych w powstawaniu i utrzymywaniu CP/CPPS była do tej pory głównym celem badań na zwierzętach nad tym zespołem. Najczęściej stosowanym modelem gryzoni wykorzystywanym do badania CP/CPPS jest eksperymentalny model autoimmunologicznego zapalenia gruczołu krokowego (EAP) generowany przez podskórne wstrzyknięcie antygenu prostaty w adiuwant Freunda Complete, co skutkuje różnym stopniem zapalenia gruczołu krokowego w zależności od gatunku i zastosowanego szczepu34,36-39. Wykazano, że infiltracja i aktywacja/degranulacja komórek tucznych zwiększają się po indukcji EAP34,35,40. Myszy transgeniczne z niedoborem komórek tucznych34 lub receptora tryptazy PAR235 nie rozwijają wrażliwości na taktykę prostaty po EAP, w przeciwieństwie do myszy EAP typu dzikiego. Chociaż ten model przedkliniczny powiela wiele cech ludzkiego CP/CPPS, protokół indukcji nie wskazuje na stan człowieka, który ma zróżnicowaną etiologię i często nie wiąże się z bezpośrednim stanem zapalnym, infekcją lub urazem prostaty.
Wpływ stresu we wczesnym okresie życia na rozwój CP/CPPS u ludzi w dużej mierze nie został zbadany; jednak badanie przeprowadzone przez Hu i wsp.41, wykazały, że mężczyźni, którzy zgłosili historię fizycznego, emocjonalnego i/lub seksualnego wykorzystywania w dzieciństwie, byli znacznie bardziej narażeni na objawy sugerujące CP/CPPS. Co więcej, wykazali, że zarówno ból, jak i wyniki w oddawaniu moczu były zwiększone u pacjentów z historią przemocy fizycznej i emocjonalnej. Wcześniej wykazaliśmy, że ten sam paradygmat NMS u samic myszy C57BL / 6 powoduje nadwrażliwość pochwy i nieprawidłową ekspresję genów zarówno w pochwie, jak i pęcherzu, co sugeruje dysfunkcyjną oś wyjściowąHPA 16. Dowody te w połączeniu z wysoką częstością występowania pacjentów z CP / CPPS z innymi chorobami współistniejącymi42, w tym IC / PBS i zaburzeniami nastroju, które wyraźnie wykazano jako związane z ekspozycją na stres we wczesnym okresie życia12-14, stanowią uzasadnienie dla zastosowania modelu NMS do zbadania CP / CPPS u myszy.

<table><tbody><tr><td>Ciężarne samice myszy C57BL/6&nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>Ciężarne samice w ciąży z czasem lub bez niego powinny być codziennie monitorowane pod kątem porodu w domu.</td></tr><tr><td>Szklana zlewka (zlewki) o pojemności 2 litrów CLS10002L</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Każdy miot NMS będzie przechowywany w tej samej zlewce przez cały 21-dniowy okres separacji.</td></tr><tr><td>Inkubator z wymuszonym obiegiem powietrza VWR, podstawowy</td><td>VWR International</td><td>414005-124</td><td>Inkubator powinien znajdować się na 33&deg; C i 50% wilgotności.</td></tr><tr><td>Test dotyku Sensory Evaluator, zestaw 20 sztuk (estezjometr Semmes-Weinstein Von Frey do oceny dotyku)</td><td>Stoelting</td><td>58011</td><td>Do oceny wrażliwości okołopłciowej należy stosować następujące monofilamenty: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g i 4,74 g.</td></tr><tr><td>Wybieg dla zwierząt (12 myszy, 6 szczurów)</td><td>IITC</td><td>435</td><td>Pamiętaj, aby umieścić ciężki przedmiot na indywidualnych, akrylowych wybiegach dla zwierząt, aby zapobiec ucieczce myszy.</td></tr><tr><td>Stojak siatkowy dla myszy i szczurów (12 myszy 6 szczurów)</td><td>IITC</td><td>410</td><td>Umieść stojak na stabilnym blacie, aby uzyskać wygodny dostęp.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>Rozcieńczyć 10x PBS do 1x PBS.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4% roztwór paraformaldehydu jest potrzebny do wewnątrzsercowej perfuzji myszy i tkanki postfix w ramach przygotowań do barwienia komórek tucznych.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td>Cryoprotect utrwalona tkanka w 30% roztworze sacharozy w 4&deg; C z dnia na dzień.</td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td>Schłodź heptan na suchym lodzie, aby zamrozić tkankę.</td></tr><tr><td>Standardowa krioforma&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>4557</td><td>Aby pomóc w zamrażaniu tkanki prostaty przed sekcją kriostatu</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>12 x 125 ml</td></tr><tr><td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td><td>VWR International</td><td>48311-703</td><td>75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>Certyfikowany przez Komisję ds. Barwień Biologicznych. Nadaje się do stosowania jako barwnik metachromatyczny do komórek tucznych.</td></tr><tr><td>Etanol, absolutny (200 dowodów)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Klasa biologii molekularnej, bioodczynniki Fisher; 95% i 100% roztwory będą potrzebne do odwodnienia barwionych kriosekcji przed wizualizacją komórek tucznych.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Zakwaszony roztwór NaCl należy przygotować na świeżo przed barwieniem kriosekcji.</td></tr><tr><td>GeneMate Sterylne probówki wirówkowe 50 ml&nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>C-3394</td><td>Jednorazowe rurki używane do mieszania niebieskich elementów toulidyny lub zanurzania szkiełek w 1xPBS.</td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia z kopeliny na 10 szkiełek, z pokrywą ze szkła gruntowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-815</td><td>Pojemność do 10 standardowych 3 x 1 cal. (75 x 25 mm) przesuwa się tyłem do siebie. Użyj oddzielnych naczyń na roztwór roboczy błękitu toluidyny, 95% EtOH, 100% EtOH i ksylenu.</td></tr><tr><td>Ksyleny (histologiczne)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P</td><td>Po odwodnieniu tkanka jest oczyszczana za pomocą ksylenu.</td></tr><tr><td>Pudełka na szkiełka mikroskopowe, 100-miejscowe</td> pudełka <td>VWR International</td><td>82003</td><td>mogą być używane do przechowywania i transportu preparatów.</td></tr><tr><td>Pudełko na szkiełka mikroskopowe Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-400</td><td>Te pudełka na suwaki są zazwyczaj wystarczająco małe, aby zmieścić się w kriostate.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Glicerol jest tradycyjnym medium montażowym.</td></tr><tr><td>Medium montażowe, Richard-Allan Scientific</td><td>VWR International</td><td>4111</td><td>Medium montażowe mocno łączy szkiełko nakrywkowe z prowadnicą.</td></tr><tr><td>Okulary Micro Cover Square, Nr 1</td><td>VWR International</td><td>48393-106</td><td>Na odwodnioną i oczyszczoną tkankę nakłada się szkiełko nakrywkowe w celu ochrony próbki.</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Nikon</td><td></td><td>Zaawansowany zautomatyzowany mikroskop badawczy Eclipse 90i, używany przez nasze laboratorium, został wycofany i zastąpiony Eclipse Ni-E.&nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

ocena wrażliwości okołopłciowej i aktywacji komórek tucznych gruczołu krokowego w mysim modelu separacji noworodków od matek

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Przewlekłe zapalenie gruczołu krokowego/przewlekły ból miednicy (CP/CPPS) występuje w ciągu całego życia na poziomie 14% i jest najczęstszą diagnozą urologiczną u mężczyzn poniżej 50 roku życia, jednak jest to najmniej poznane i zbadane przewlekłe zaburzenie bólowe miednicy. Znaczna podgrupa pacjentów z przewlekłym bólem miednicy zgłasza, że doświadczyła stresu lub znęcania się we wczesnym okresie życia, co może znacząco wpływać na funkcjonowanie i regulację osi podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA). Aktywacja komórek tucznych, która, jak wykazano, jest zwiększona zarówno w moczu, jak i w wydzielinach sterczowych u pacjentów z CP/CPPS, jest częściowo regulowana przez dalszą aktywację osi HPA. Separacja noworodków od matek (NMS) jest stosowana od ponad dwóch dekad do badania wyników stresu we wczesnym okresie życia w modelach gryzoni, w tym zmian w osi HPA i wrażliwości trzewnej. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół stosowania NMS jako przedklinicznego modelu CP / CPPS u samców myszy C57BL / 6. Opisujemy metodologię wykonywania NMS, ocenę allodynii mechanicznej okołopłciowej oraz histologiczne dowody aktywacji komórek tucznych. Dostarczamy również dowodów na to, że wczesny stres psychologiczny może mieć długotrwały wpływ na męski układ moczowo-płciowy u myszy.

Myszy poddane NMS wykazywały dowody behawioralne wskazujące na CP/CPPS. Podczas testów z wykorzystaniem stopniowanej serii monowłókien von Frey, 8-tygodniowe myszy NMS (n = 4) wykazywały perigenitalną allodynię mechaniczną w porównaniu z grupą kontrolną (n = 5, Rycina 2). Świadczy o tym istotna redukcja (p &lt; 0,01; test t Studenta) progu wycofania mechanicznego wywołującego pozytywną reakcję behawioralną, zarejestrowaną jako gwałtowny szarpnięcie lub skok w odpowiedzi na aplikację monowłókna l...

Mierzymy obwodowo-płciową wrażliwość mechaniczną i aktywację komórek tucznych u samców myszy C57BL/6, które przeszły paradygmat stresu we wczesnym okresie życia - separację noworodków od matek, w celu wywołania przedklinicznego modelu przewlekłego zapalenia gruczołu krokowego/przewlekłego bólu miednicy.

Ocena wrażliwości okołopłciowej i aktywacji komórek tucznych gruczołu krokowego w mysim modelu separacji noworodków od matek

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest określenie wpływu stresu we wczesnym okresie życia na układ moczowo-płciowy poprzez pomiar mechanicznej wrażliwości obszaru okołogenitalnego oraz aktywacji komórek tucznych w obrębie prostaty u samców myszy C 57 black six, które poddano neonatalnej separacji od matki. Cel ten jest realizowany poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności neonatalnej separacji od matki w miotach myszy C 57 black six w celu wywołania stresu we wczesnym okresie życia przez 20 kolejnych dni. W drugim kroku mierzy się mechaniczną wrażliwość obszaru okołogenitalnego poprzez przykładanie serii monofilamentów Von Freya do regionu okołogenitalnego.Następnie wykonuje się barwienie zakwaszonym błękitem toluidynowym na skrawkach prostaty myszy przygotowanych w kriostacie, w celu ilościowego określenia aktywacji komórek tucznych. Wyniki naszych analiz behawioralnych i histologicznych wykazują, że neonatalna separacja od matki zwiększa mechaniczną wrażliwość okolicy genitalnej oraz aktywację komórek tucznych w prostacie.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie prostaty, jest uwzględnienie ekspozycji na stres w okresie wczesnego rozwoju, co przyspiesza wystąpienie objawów w późniejszym życiu, podobnie jak obserwuje się to u pacjentów z przewlekłym zapaleniem prostaty. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przewlekłego bólu miednicy, takie jak wpływ stresu we wczesnym dzieciństwie na zachowanie, oraz dostarczyć dowodów histologicznych na zmienione stany bólowe. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat przewlekłego zapalenia prostaty, może być ona również zastosowana do innych funkcjonalnych zespołów bólowych, takich jak zapalenie pęcherza śródściennego, zespół bolesnego pęcherza, wulwodynia, fibromialgia lub migreny.Można to zastosować nawet w przypadku innych powszechnych chorób psychicznych współistniejących, takich jak lęk i depresja. Dzień po porodzie wyjmij matkę z klatki domowej i umieść ją w czystym, pomocniczym pojemniku. Przetrzyj garść ściółki między czystymi, objętymi rękawiczkami dłońmi, aby zachować zapach klatki domowej, a następnie przenieś warstwę ściółki z klatki domowej o grubości od jednego do dwóch centymetrów do czystego, odpowiednio opisanego szklanego zlewki o pojemności dwóch litrów. Dodatkowo, w ilości około połowy, przenieś dowolny dodatkowy materiał wzbogacający ściółkę obecny w klatce domowej, taki jak nestlety lub papier pognieciony, do szklanej zlewki. Następnie umieść wszystkie szczenięta z jednego miotu w przygotowanej zlewce i natychmiast umieść zlewkę w temperaturze 33 °C i wilgotności 50% na 180 minut.Podczas okresu inkubacji w rozdzieleniu, wyjmij samicę z drugiego pojemnika i przenieś ją z powrotem do klatki macierzystej. Umieść klatkę macierzystą w odpowiednim miejscu w wiwarium. Po zakończeniu okresu rozdzielenia, pobierz klatkę macierzystą i wyjmij samicę, przenosząc ją do czystego drugiego pojemnika.Następnie wyjmij zlew z inkubatora i przesyp garść ściółki między czystymi, objętymi rękawiczkami dłońmi, aby zachować zapach domowej klatki podczas przekładania szczeniąt. Delikatnie przenoś szczenięta pojedynczo ze zlewka do domowej klatki, a wszelkie pozostałe w zlewku wzbogacenia środowiskowe i ściółkę zwróć do klatki. Po przeniesieniu wszystkich szczeniąt przenieś samicę z pojemnika pomocniczego do domowej klatki i umieść ją w odpowiednim miejscu zakwaterowania w wiriarium.Powtórz całą tę procedurę dla każdego miotu poddanego neonatalnej separacji od matki każdego dnia aż do 21. dnia postnatalnego. Następnie odsadź szczenięta i utrzymuj je w tych samych warunkach co myszy kontrolne przez cały czas trwania eksperymentu. Przygotuj obszar testowy, kładąc podkład chłonny pod podwyższonym stołem z siatką o wysokości 55 cm.Stół powinien zapewniać wystarczającą przestrzeń, aby badacz mógł podejść od dołu, nie płosząc myszy. Umieść do 12 ośmiotygodniowych myszy indywidualnie pod przezroczystymi, perforowanymi komorami z tworzywa sztucznego na drucianej siatce stołu. Na wierzchu komór umieść ciężki przedmiot, aby zapobiec ucieczce myszy.Chwyć podstawę trójpunktowego monofilamentu von Frey o sile 2,2 g i wysuń wcięty monofilament. Ustaw sondę tak, aby monofilament był zorientowany pionowo. Zabieg przeprowadź, gdy mysz jest czujna, nieruchoma, a ciężar jej ciała jest równomiernie rozłożony na tylne łapy.Przykładaj go do lewej lub prawej strony moszny, unikając linii środkowej, aż do momentu zauważenia lekkiego zgięcia włókna. Przytrzymaj monowłókno w tym miejscu przez 10 sekund lub do momentu, gdy zwierzę wykaże reakcję pozytywną, taką jak gwałtowne szarpnięcie, skok lub zachowanie polegające na lizaniu lub gryzieniu monowłókna. Jeśli mysz nie poruszy się ani nie wykaże żadnej pozytywnej reakcji podczas dziesięciosekundowego przykładania monowłókna, odnotuj wynik negatywny; przetestuj wszystkie myszy przy użyciu włókna o tym samym rozmiarze, a następnie przejdź do kolejnego odpowiedniego monowłókna.Kontynuuj testowanie każdej myszy, używając kolejnego większego lub mniejszego monofilamentu, zgodnie z potrzebą, przez kolejne cztery aplikacje. Po zaobserwowaniu pierwszej pozytywnej odpowiedzi przeprowadź sekcję, a następnie wykonaj kriostatyczne cięcia utrwalonej tkanki prostaty myszy w wieku dziewięciu tygodni, przygotowując przekroje o grubości 7 µm. Następnie przygotuj 1% roztwór zapasu błękitu toluidyny, dodając 1 g błękitu toluidyny O do 100 mL 70% etanolu i mieszając na wortexie aż do całkowitego rozpuszczenia.Roztwór zapasowy przechowywać w temperaturze pokojowej do trzech tygodni. W innym zlewce dodać jeden gram chlorku sodu do 100 mililitrów wody umieszczonej na mieszalniku magnetycznym. Dostosować pH roztworu soli, używając 12 molarnego kwasu solnego, aż do uzyskania zakresu pH od 0,5 do 1,0.Następnie przygotuj 0,25% roztwór roboczy zakwaszonego błękitu toluidyny, łącząc osiem mililitrów roztworu zapasu błękitu toluidyny i 32 mililitry kwasowego 1% roztworu chlorku sodu. Pipetuj wielokrotnie w górę i w dół, aby zapewnić całkowite włączenie roztworu zapasu błękitu toluidyny, a następnie wymieszaj za pomocą wortexa; roztwór roboczy należy przygotować na świeżo dla każdej partii szkiełek. Przepłucz skrawki tkanek, zanurzając pojedynczo szkiełka na około jedną sekundę w probówce stożkowej o pojemności 50 mililitrów zawierającej wystarczającą objętość PBS, aby całkowicie zanurzyć tkankę.Pozostaw preparaty do wyschnięcia na powietrzu na ręczniku papierowym. Następnie umieść preparaty w szklanym naczyniu z odpowiednią ilością 0.25% roztworu roboczego błękitu toluidyny, aby zapewnić całkowite zanurzenie przekrojów tkankowych. Inkubuj preparaty od 10 do 15 minut na platformie kołyszącej ustawionej na 15 RPMs.Następnie zanurz preparaty w PBS przez około jedną sekundę, aby wypłukać nadmiar błękitu toluidyny, a następnie umieść je w kasecie na szkiełka w pozycji pionowej, aby umożliwić odpływ cieczy. Susz preparaty w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez minimum dwie godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej.Po wyschnięciu zanurz preparaty w 95% etanolu na około jedną sekundę, a następnie pozostaw przekrój do całkowitego wyschnięcia. Powtarzaj tę procedurę od 1 do 10 razy, aż tkanka po wyschnięciu stanie się bardziej niebieska niż fioletowa. Następnie zanurz preparaty w 100% etanolu na około jedną sekundę i pozostaw przekrój do całkowitego wyschnięcia.Powtarzaj tę procedurę od 1 do 10 razy, aż tkanka uzyska ciemnoniebieski lub średnio-niebieski kolor, ale nie fioletowy. Na koniec utrwal barwienie, inkubując preparaty w 100% xylene przez trzy minuty. Pozostaw je do wyschnięcia, a następnie zabezpiecz szkiełka nakładkami z glycerol PPS lub permanentnym medium montażowym na bazie xylene.Odlej nadmiar pożywki i przechowuj przygotowane preparaty w temperaturze pokojowej. W badaniu z wykorzystaniem stopniowanej serii monofilamentów Von Frame u ośmiotygodniowych myszy z neonatalną separacją matczyną zaobserwowano mechaniczną allodynię w okolicy genitalnej w porównaniu z grupą naiwną. Przejawiało się to znacznym obniżeniem progu wycofania mechanicznego, który wywoływał pozytywną odpowiedź behawioralną.Dodatkowe dowody na zespół przewlekłego zapalenia prostaty i przewlekłego bólu miednicy można zaobserwować histologicznie; przedstawiono tutaj przekroje kriotomem tkanek prostaty, które zostały zabarwione zakwaszonym błękitem o-toluidyny w celu obserwacji ziarnistości tryptazy znajdujących się w komórkach tucznych. W przekrojach prostaty myszy poddanych separacji neonatalnej zaobserwowano znacznie wyższy odsetek degranulowanych komórek tucznych w porównaniu z myszami naiwnymi. Podczas przeprowadzania separacji matki od noworodków ważne jest, aby zachować zapach klatki domowej, aby uniknąć odrzucenia szczeniąt przez samicę po wykonaniu tej procedury.Do oceny dowodów behawioralnych na współistniejące zaburzenia nastroju można wykorzystać inne metody, takie jak test otwartego pola lub test preferencji cieczy z dwoma wyborami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat oceny mechanicznej wrażliwości okolicy genitalnej oraz aktywacji komórek tucznych prostaty jako dowodów behawioralnych i histologicznych na przewlekłe zapalenie prostaty u myszy po neonatalnej separacji od matki.

assessment-perigenital-sensitivity-prostatic-mast-cell-activation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Infekcja prostaty może być czynnikiem przyczyniającym się do pośredniczenia w bólu miednicy w przewlekłym zapaleniu gruczołu krokowego. Opisujemy procedurę przygotowania standaryzowanego inokulum bakteryjnego, wkraplania bakterii do cewki moczowej samców myszy oraz metodologii pomiaru allodynii dotykowej u myszy w czasie.

Pomiar dotykowej allodynii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia gruczołu krokowego

Elektroniczne pomiary von Freya są skuteczną i ulepszoną alternatywą dla klasycznych filamentów von Freya, ponieważ pozwalają na szybki i precyzyjny pomiar zmian w progach mechanicznego wycofywania gryzoni do stale stosowanych bodźców ciśnieniowych przed i po zdarzeniu zapalnym.

Pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

Ten protokół dostarcza niezbędnych kroków do ustalenia i oceny sepsy noworodków u 7-dniowych myszy.

Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

Opracowaliśmy model zapalenia błony płodowej, aby symulować narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) bez komplikacji związanych z żywymi organizmami, aby zbadać wpływ FEMI na rozwój przewodu pokarmowego potomstwa. Pozwala to na badanie mechanistycznych przyczyn rozwoju uszkodzenia jelit po zapaleniu błony płodowej.

Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

Paradygmat chronicznego stresu psychospołecznego (CGS) wykorzystuje klinicznie istotne czynniki stresogenne podczas ciąży u myszy do modelowania zaburzeń psychicznych matek i niemowląt. W tym miejscu przedstawiamy procedurę krok po kroku stosowania paradygmatu CGS i dalszych ocen w celu walidacji tego modelu.

Wykorzystanie mysiego modelu stresu psychospołecznego w ciąży jako translacyjnie istotnego paradygmatu dla zaburzeń psychicznych u matek i niemowląt

Zakażenie matki jest czynnikiem ryzyka zaburzeń neurorozwojowych. Mysie modele aktywacji immunologicznej matki (MIA) mogą wyjaśnić wpływ infekcji na rozwój i funkcjonowanie mózgu. W tym miejscu przedstawiono ogólne wytyczne i procedurę produkcji niezawodnie odpornego i podatnego potomstwa narażonego na MIA.

Generowanie powtarzalnego modelu aktywacji immunologicznej matki w połowie ciąży przy użyciu poli(I:C) w celu zbadania podatności i odporności u potomstwa

Tutaj prezentujemy zwięzły protokół tworzenia modelu wcześniaka, ułatwiający badania nad wczesnym leczeniem bólu poporodowego. Metoda polega na wykonaniu cesarskiego cięcia na trzy dni przed spodziewanym porodem, ekstrakcji wcześniaków poprzez histerektomię i zintegrowaniu ich z biologicznym potomstwem matki zastępczej.

Model wcześniaka do badań nad bólem

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Ten protokół opisuje model zwierzęcy do badania, jak przeciwności losu we wczesnym okresie życia, sprowokowane przez zubożałe środowisko i nieprzewidywalną opiekę matki we wczesnym okresie poporodowym, wpływają na rozwój mózgu i przyszłe ryzyko zaburzeń psychicznych.

Ograniczone ściółkowanie i gniazdowanie jako model przeciwności losu we wczesnym okresie życia u myszy

Artykuł zawiera kompleksowy protokół do wygenerowania modelu mysiego aktywacji immunologicznej matki (MIA) w celu zbadania wpływu wczesnego zapalenia w czasie ciąży na neurorozwój, w tym kluczowe wskaźniki, aby zapewnić niezawodność i powtarzalność.

Generowanie wczesno-ciążowego modelu aktywacji odporności matczynej u myszy w celu oceny prenatalnego stanu zapalnego na neurorozwój

Poznaj metodę oceny wrażliwości okołopłciowej i aktywacji komórek tucznych gruczołu krokowego u myszy C57BL/6 po separacji noworodków od matek. Model ten pozwala badać wpływ stresu wczesnodziecięcego na układ moczowo-płciowy.

Ocena wrażliwości okołopłciowej i aktywacji komórek tucznych gruczołu krokowego w mysim modelu separacji noworodków od matek

Przeglądaj więcej filmów