Name: Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metodę generowania ksenoprzeszczepów PDX z krążących komórek nowotworowych u pacjentów z rakiem prostaty. Technika ta umożliwia izolację CTCs z krwi obwodowej i ich wstrzyknięcie do myszy immunokompromitowanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Jordi Ochando z Flow Cytometry Shared Resources w Mount Sinai Medical Center za pomoc w analizie cytometrii przepływowej. Dziękujemy dr Rumana Huq z Microscopy Shared Resource Facility w Mount Sinai Medical Center za pomoc w obrazowaniu. Autorzy dziękują Fundacji TJ Martell za wsparcie w tym projekcie.

Ten protokół został przeprowadzony w naszej instytucji za zgodą instytucjonalnej komisji etyki badań i jest zgodny ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobra człowieka.
1. Pobieranie krwi obwodowej od pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty
Uwaga: Wybierz pacjentów z przerzutowym rakiem prostaty. Uzyskaj pisemną zgodę pacjenta i zapisz charakterystykę kliniczną pacjentów, w tym wiek w momencie izolacji oraz wcześniejszą chemioterapię i leczenie hormonalne. Pacjenci z chorobą przerzutową będą mieli potencjalnie najwyższe stężenie CTC we krwi obwodowej.
<ol>
	<li>Pobieranie próbek krwi po uzyskaniu świadomej zgody i zgodnie z odpowiednim protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną. Przez cały czas trwania zabiegu należy nosić rękawice lateksowe i fartuch laboratoryjny.</li>
	<li>Podłącz igłę motylkową 25 G i rurkę do uchwytu igły. Za pomocą wacika nasączonego alkoholem oczyść obszar żyły łokciowej między bicepsem a przedramieniem, a następnie załóż opaskę uciskową na ramię pacjenta.</li>
	<li>Włóż igłę motylkową do żyły łokciowej i wepchnij probówkę do pobierania krwi do uchwytu igły, aby rozpocząć pobieranie. Zebrać około 10 ml krwi do probówek zawierających kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), aby zapobiec zakrzepom.</li>
	<li>Wyjąć igłę motylkową z pacjenta i uciskać sterylnym gazikiem w miejscu nakłucia żyły przez 1 minutę. Przykryj miejsce sterylnym bandażem.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek jednojądrzastych
Uwaga: Krew pobrana z kroku 1 będzie zawierała komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) (np. limfocyty i monocyty) oprócz jednojądrzastych CTC.
<ol>
	<li>Pipetą serologiczną o pojemności 5 ml odpipetować krew pełną do 50 ml polistyrenowej probówki stożkowej i dodać zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) w stosunku 1:1. Delikatnie odpipetować mieszaninę do homogenizacji.</li>
	<li>Dodać 15 ml komercyjnie przygotowanego roztworu (Ficoll-Paque) w celu oddzielenia składników krwi przez wirowanie w gradionym spadku gęstości z małą prędkością do pustej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować krew pełną i mieszaninę HBSS, z kroku 2.1, do rurki polistyrenowej z kroku 2.2, aby utworzyć wyraźną warstwę wierzchnią. Ustaw pipetę na najniższe ustawienie, aby zminimalizować mieszanie roztworów, zapewni to skuteczną separację.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (25 °C). Ustaw opóźnienie na najniższe ustawienie, aby zapobiec mieszaniu się roztworów po rozdzieleniu. Przyspieszenie można ustawić na dowolną prędkość.</li>
	<li>Po odwirowaniu zidentyfikuj cienki biało-szary pasek PBMC i CTC umieszczony między osoczem na górze a roztworem rozdzielającym na dnie probówki.</li>
	<li>Zebrać komórki z biało-szarego paska w kroku 2.5 do probówki z polistyrenu o pojemności 50 ml za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia.</li>
	<li>Dodać HBSS do 50 ml polistyrenowej probówki stożkowej z PBMC i CTC i ponownie odwirować przy 400 x g przez 10 minut RT do mycia.</li>
	<li>Zdekantować płyn i ponownie zawiesić osad w 50 ml HBSS i ponownie odwirować przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu umycia.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad, zawiesić pozostały osad z 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować roztwór przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć bufor do lizy krwinek czerwonych przez odwirowanie przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS 1x uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w celu zablokowania przed barwieniem przeciwciałami.</li>
</ol>
3. Barwienie komórek jednojądrzastych przeciwciałem CD45-FITC do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)
<ol>
	<li>Określić ilościowo liczbę żywotnych (trypanowo-ujemnych) komórek (od kroku 2.11) za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Przygotować zawiesinę 1 x 106 komórek/ml (w PBS 1x z 10% FBS) i umieścić ją na lodzie na 1 godzinę.</li>
	<li>Ilościowo oznaczoną zawiesinę komórek z poprzedniego etapu rozprowadzić do dwóch probówek. Oznacz probówki jako kontrolne i barwienie CD45.</li>
	<li>Do probówki kontrolnej dodać IgG1κ-FITC (2,5 μg/ml) w rozcieńczeniu 1:250. W probówce do barwienia CD45 dodać sprzężone przeciwciało pierwszorzędowe CD45 FITC (2,5 μg/ml) w rozcieńczeniu 1:250 i inkubować zawiesiny komórek na lodzie przez 30 minut. W celu wykluczenia komórek krwiotwórczych stosuje się znakowanie antygenem CD45.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie, zawieszając każdą granulkę sterylnym 1 x PBS uzupełnionym 10% FBS, a następnie odwirować przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 1 ml roztworze PBS 1x zawierającym 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) w stężeniu 10 μg/ml.</li>
	<li>Przefiltruj końcowy roztwór przez nasadki sitka 35 μm do rurek polistyrenowych o wymiarach 12 mm x 75 mm.</li>
</ol>
4. Izolacja CTC prostaty przez FACS
Uwaga: Użyj cytometru przepływowego do zbierania żywych ujemnych CTC CD45.
<ol>
	<li>Ustaw kontrolki kompensacji za pomocą komórek z rurki oznaczonej "Kontrola".</li>
	<li>Utwórz bramki, które wykluczają zanieczyszczenia i skupiska komórek, używając odpowiednich parametrów rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego.</li>
	<li>Ustal bramki FITC za pomocą zawiesin komórek z probówki oznaczonej "CD45-FITC".</li>
	<li>Bramka żywotnych komórek (DAPI-ujemnych) wykorzystujących pacyficzny kanał blue-A.</li>
	<li>Zbierz populację CD45 ujemną do sterylnej 15 ml polistyrenowej stożkowej probówki zawierającej 2 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% FBS.</li>
	<li>Odwirować posortowaną zawiesinę komórek nowotworowych prostaty o sile 400 x g przez 3 minuty, a następnie ponownie zawiesić granulki w 200 - 500 μl RPMI uzupełnionym 10% FBS.</li>
</ol>
5. Wstrzykiwanie CTC myszom i monitorowanie wzrostu ksenoprzeszczepu
Uwaga: Przeprowadzaj wszystkie procedury na zwierzętach zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami. Protokół ten został przeprowadzony w naszej instytucji zgodnie ze specjalnym Protokołem Wykorzystania Zwierząt zatwierdzonym przez nasz Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami zgodnie i zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi agencjami regulacyjnymi i instytucjonalnymi, przepisami i wytycznymi.
<ol>
	<li>Wymieszaj posortowaną zawiesinę komórek nowotworu prostaty z macierzą zewnątrzkomórkową w stosunku 1:1 i umieść na lodzie.</li>
	<li>Znieczulić mysz przed implantacją podskórną w komorze dostarczającej 5% (v/v) wziewnego izofluranu w 1 l/min tlenu. Zapewnij odpowiednie znieczulenie, sprawdzając, czy u myszy nie ma utraty odruchu rogówkowego i palca u stóp.</li>
	<li>Za pomocą igły 25 G i strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć podskórnie 250 μl zawiesiny komórek nowotworu prostaty i komórek macierzy zewnątrzkomórkowej w obie górne strony 8-10-tygodniowego samca myszy z niedoborem odporności. Wstrzyknąć 250 μl niezależnie od stężenia CTC, ponieważ objętość wstrzyknięcia jest ważną wartością. Maksymalne podanie SQ u myszy wynosi nie więcej niż 1 ml. </li>
	<li>Monitoruj myszy, wykonując cotygodniowe badanie palpacyjne miejsc wstrzyknięć myszy pod kątem wzrostu podskórnej gęstości guzkowej i mierząc masę myszy dwa razy w tygodniu.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy i pobierz podskórne ksenoprzeszczepy ludzkiego raka prostaty, gdy rozmiar guza jest większy niż 0,5 cm i mniejszy niż 1 cm w największej średnicy, aby zapewnić wystarczającą ilość tkanki nowotworowej do analiz molekularnych i seryjnego pasażu. Eutanazja myszy z objawami niepokoju lub utratą masy ciała o 15%, mimo że guz nie jest wyczuwalny. </li>
</ol>

<ol><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer discovery. 4, 998-1013 (2014).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer research. 73, 5315-5319 (2013).</li>
<li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%2C+detection%2C+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Biology, detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO molecular medicine. 1, 1-11 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+enrichment+by+immunomagnetic+nanobeads+for+unbiased+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Negative enrichment by immunomagnetic nanobeads for unbiased characterization of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients.</a> Journal of translational medicine. 9, 1-9 (2011).</li>
<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics+%2C+2013%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+cancer+journal+for+clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics , 2013.</a> CA: a cancer journal for clinicians. 63, 11-30 (2013).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer cell. 22, 373-388 (2012).</li>
<li>Klein, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+metastatic+human+prostate+cancer+to+androgen+independence+in+immunodeficient+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progression of metastatic human prostate cancer to androgen independence in immunodeficient SCID mice.</a> Nature Medicine. 3, 402-408 (1997).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345, 216-220 (2014).</li>
<li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nature medicine. 20, 897-903 (2014).</li>
<li>Vidal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Targetable+GATA2-IGF2+Axis+Confers+Aggressiveness+in+Lethal+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">A Targetable GATA2-IGF2 Axis Confers Aggressiveness in Lethal Prostate Cancer.</a> Cancer cell. 27, 223-239 (2015).</li>
<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature. 17, 1514-1520 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W artykule opisano metodę generowania modeli PDX raka gruczołu krokowego na podstawie CTC. Wykorzystanie CTC do generowania modeli PDX ma kilka potencjalnie ważnych zalet w porównaniu z istniejącymi metodami. Po pierwsze, dostępne pobieranie CTC z krwi obwodowej umożliwia generowanie modeli eksperymentalnych od tego samego pacjenta w różnych stadiach choroby. Po drugie, pobieranie krwi stanowi bezpieczniejszą i tańszą metodę izolowania komórek nowotworowych w porównaniu z istniejącymi metodologiami, któr...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/53182">Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells</a>. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells.

Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów są coraz bardziej popularnymi modelami eksperymentalnymi wykorzystywanymi do badań nad rakiem. Mogą być wykorzystywane do charakterystyki biomarkerów i szlaków biologicznych, przedklinicznej oceny skuteczności leków oraz tworzenia awatarów do spersonalizowanych terapii przeciwnowotworowych 1,2. Wcześniej inne grupy badawcze opracowały modele PDX poprzez wszczepianie lub wstrzykiwanie zawiesin pojedynczych komórek nowotworowych lub całych eksplantatów guza myszom z obniżoną odpornością 1. Te modele PDX wymagają chirurgicznego pobrania świeżego guza litego, złośliwego wodobrzusza lub wysięku opłucnowego od pacjenta poddawanego zabiegowi chirurgicznemu, który jest zarówno kosztowny, jak i naraża pacjenta na zwiększone ryzyko zachorowalności jatrogennej.
Znaczącym osiągnięciem w badaniach nad rakiem było wykrywanie, izolacja i charakterystyka krążących komórek nowotworowych. Te komórki nowotworowe uciekają z pierwotnej masy guza i wchodzą do krążenia, gdzie odgrywają kluczową rolę w przerzutach i nawrotach, najczęstszej przyczynie śmiertelności związanej z rakiem 3. Ocena i charakterystyka CTC z kilku typów guzów litych dostarczyły informacji klinicznych do diagnozy, rokowania i monitorowania choroby resztkowej 3. Do skutecznego izolowania CTC 4 można wykorzystać różne obecnie stosowane podejścia oparte na właściwościach fizycznych, ekspresji biomarkerów lub cechach funkcjonalnych CTC 4. Istniejące metody izolacji CTC w skali makro obejmują wirowanie w gradionym gradieniu gęstości, fizyczną filtrację z porami filtracyjnymi i separację od cząsteczek powierzchniowych. Najczęściej stosowane metody izolacji CTC opierają się na wychwytywaniu CTC na podstawie przeciwciał. Zarówno pozytywna, jak i negatywna selekcja markerów powierzchni komórek może być wykorzystana do wyizolowania CTC z krwi obwodowej. Pozytywna selekcja CTC w krążeniu obwodowym zwykle wykorzystuje markery nabłonkowe (np. EpCAM), które ulegają ekspresji na CTC, ale nie na komórkach krwiotwórczych. Wadą tej metody jest to, że CTC z potencjałem przerzutowym często przechodzą przemianę nabłonkowo-mezenchymalną (EMT), która obniża poziom markerów powierzchni nabłonka 3. W celu wyizolowania CTC z potencjałem przerzutowym można zastosować metodologię selekcji negatywnej, która wykorzystuje marker powierzchni hematopoetycznej, CD45, w celu zubożenia normalnej populacji komórek leukocytów 5.
Rak prostaty jest najczęściej diagnozowanym nowotworem i główną przyczyną zgonów związanych z rakiem u mężczyzn 6. Mechanizmy progresji i agresywności nowotworu nie są w pełni poznane, dlatego generowanie i charakteryzacja modeli eksperymentalnych, które podsumowują heterogeniczność molekularną raka gruczołu krokowego, są bardzo interesujące. Modele PDX raka gruczołu krokowego zostały wcześniej wygenerowane przez wszczepienie ludzkich komórek raka prostaty myszom z obniżoną odpornością 7,8. Jednak generowanie takich modeli zostało utrudnione przez niski wskaźnik wszczepiania raka prostaty myszom z obniżoną odpornością, co przypisuje się przede wszystkim powolnemu charakterowi choroby. Ostatnio CTC zostały wykorzystane do wygenerowania modeli PDX raka piersi 9, raka płuc 10 i raka prostaty 11. Te badania potwierdzające słuszność koncepcji wprowadziły możliwość generowania modeli PDX niezależnie od konieczności pobierania próbek chirurgicznych. W tym artykule szczegółowo opisujemy metodę generowania tego nowatorskiego modelu eksperymentalnego.

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>35 &mikro; m Sitko do komórek</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polistyrenowa rurka stożkowa</td><td>Crystalgen</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>d3571</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Rurki polistyrenowe z nasadką sitową BD</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>BD Vacutainer Lawendowe probówki do pobierania krwi z EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Winged Blood Collection Set z przyciskiem Igła do cofania 23 gauge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Jednorazowy uchwyt</td><td></td><td></td><td></td>na igłę</tr><tr><td>Lateksowa opaska</td><td></td><td></td><td></td>uciskowa</tr><tr><td>Rękawiczki</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>lateksowe lub nielateksoweWaciki nasączone alkoholem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 x 2 bawełniane gaziki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandaż</td><td></td><td></td><td></td>samoprzylepny</tr><tr><td>Igła 25 G</td> Strzykawka <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>1 ml</td></tr></tbody></table>

generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) zyskują na popularności w badaniach nad rakiem i są używane do przedklinicznej oceny leków, identyfikacji biomarkerów, badań biologicznych i strategii medycyny spersonalizowanej. Krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają kluczową rolę w przerzutach nowotworowych i zostały wyizolowane od pacjentów z kilkoma typami nowotworów. Ostatnio CTC zostały wykorzystane do generowania eksperymentalnych modeli PDX raka piersi i prostaty. Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje metodę generowania modeli PDX raka prostaty na podstawie CTC opracowanych przez naszą grupę. Zaletą tej metody w porównaniu z konwencjonalnymi modelami PDX jest niezależność od chirurgicznego pobierania próbek i generowanie modeli eksperymentalnych na różnych etapach choroby. Wirowanie w gradiencie gęstości, a następnie liza czerwonych krwinek i zubożenie komórek jednojądrzastych CD45 dodatnich metodą cytometrii przepływowej stosuje się do wzbogacenia CTC z próbek krwi obwodowej pobranych od pacjentów z chorobą przerzutową. CTC są następnie wstrzykiwane myszom z obniżoną odpornością; Wygenerowane następnie ksenoprzeszczepy mogą być wykorzystane do badań funkcjonalnych lub pobrane w celu charakterystyki molekularnej. Podstawowym ograniczeniem tej metody jest metoda selekcji negatywnej stosowana do wzbogacania CTC. Pomimo tego ograniczenia, generowanie modeli PDX z CTC zapewnia nowatorski model eksperymentalny, który można zastosować w badaniach nad rakiem prostaty.

Niniejszy protokół prowadzi do generowania modeli PDX z wyizolowanych, CD45-ujemnych krążących komórek nowotworowych (CTC) raka prostaty. Ze względu na zastosowaną w naszym protokole metodę selekcji negatywnej konieczne jest wykluczenie martwych komórek za pomocą barwienia DAPI. Procent CD45-ujemnych komórek wykrytych metodą cytometrii przepływowej jest zmienny i zależy od obciążenia nowotworowego pacjenta (Ryc. 1A). Barwienie immunofluorescencyjne nieposortowanych komórek z użyciem CD45 i DAPI (w celu i...

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Ogólnym celem poniższego protokołu jest wytworzenie ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z raka prostaty z krążących komórek nowotworowych. Jest to osiągane poprzez wstępne pobranie krwi obwodowej od pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty.W drugim kroku izolowana jest frakcja mononuklearnych komórek krwi, która zawiera krążące komórki nowotworowe. Następnie komórki mononuklearne barwi się przeciwciałem CD 45 ZI. W celu wyselekcjonowania krążących komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepłyewej, komórki są następnie wstrzykiwane myszom z niedoborem odporności. Wyniki wykazują utworzenie ksenograftów raka prostaty na podstawie wstrzyknięcia krążących komórek nowotworowych wyizolowanych metodą cytometrii przepłyewej z krwi obwodowej pacjentów z rakiem prostaty.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie raka prostaty poprzez tworzenie nowych modeli eksperymentalnych, które mogą być wykorzystane do charakterystyki molekularnej raka prostaty oraz opracowania nowych biomarkerów. Procedurę zademonstrują Williams, student z laboratorium, oraz Omada, badacz z oddziału onkologii tutaj w Mount Sinai. Aby rozpocząć, należy pobrać krew pełną od wybranych pacjentów z przerzutowym rakiem prostaty, ponieważ mogą oni mieć wysoką liczbę krążących komórek nowotworowych w krwi obwodowej. Za pomocą pipety serologicznej o objętości 10 ml przenieś krew pełną do stożkowatej probówki polistyrenowej o pojemności 50 ml, wraz z zrównoważonym roztworem soli Hanksa.W stosunku jeden do jednego, delikatnie pipetuj mieszaninę, aby ją zhomogenizować. Następnie dodaj 15 mililitrów roztworu z zestawu FI call pack do pustej 50-mililitrowej stożkowatej probówki polistyrenowej. Delikatnie pipetuj 20 mililitrów rozcieńczonej krwi pełnej, używając najniższego ustawienia, na powierzchnię roztworu, aby utworzyć wyraźną górną warstwę.Następnie wiruj probówkę przy 400 Gs przez 30 minut. W temperaturze pokojowej ustaw opóźnienie wirówki na najniższą wartość, aby zapobiec wymieszaniu roztworów po separacji. Po wirowaniu zidentyfikuj cienki, biało-szary pasek monocyto-limfocytów krwi obwodowej oraz krążących komórek nowotworowych, znajdujący się pomiędzy górną warstwą osocza a roztworem separacyjnym.Z dna probówki ostrożnie zbierz komórki z biało-szarego paska i przenieś je do polistyrenowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie, używając plastikowej pipety transferowej, dodaj zrównoważony roztwór soli Hanksa do wyizolowanych komórek do uzyskania całkowitej objętości 10 ml.Ponownie odwiruj mieszaninę przy 400 Gs przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby wypłukać komórki, usuń nadsącz i powtórz ten etap płukania jeszcze raz.Po drugim przemyciu odrzuć nadsącz. Resztę osadu zawieś w pięciu mililitrach buforu do lizy erytrocytów i inkubuj roztwór przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwiruj próbkę przy 400 Gs przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i usuń bufor do lizy, odrzucając nadsącz.Na koniec, przed barwieniem, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS uzupełnionego o 10% fetal bovine serum. Ilościowo określić liczbę żywych komórek, stosując standardową metodę wykluczania błękitu trypanu przy użyciu hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Następnie rozcieńczyć komórki do stężenia 1 milion komórek na mililitr w PBS z 10%FBS i pozostawić je na lodzie przez jedną godzinę.Aby zablokować niespecyficzne wiązanie, rozdziel zawiesinę komórkową do dwóch oddzielnych probówek. Oznacz jedną probówkę jako komórki kontrolne, a drugą jako komórki do barwienia CD 45. Do probówki kontrolnej dodaj IgG one Kappa Zi w rozcieńczeniu 1:250 do końcowego stężenia 10 ng/ml.Do probówki przeznaczonej do barwienia CD 45 dodać przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z CD 45 ZI w tym samym stężeniu 10 ng/ml i inkubować zawiesiny komórkowe na lodzie przez 30 minut. Następnie odwirować komórki przy 400 ×g przez trzy minuty w temperaturze 4 °C, a następnie odlać nadosad.Umyj komórki dwukrotnie, zawieszając każdy osad w sterylnym PBS uzupełnionym o 10% FBS, a następnie odwiruj przy 400 Gs przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przemyciu resuspenduj komórki w jednym mililitrze roztworu PBS zawierającego 10 µg/mL barwnika dappy. Przefiltruj końcowy roztwór przez sita o rozmiarze oczek 35 µm do polistyrenowych probówek o wymiarach 12 mm na 75 mm, aby wykluczyć obecność skupisk komórek lub zanieczyszczeń.Następnie, z zawiesiny należy wykluczyć komórki CD 45-dodatnie oraz martwe komórki, wykorzystując sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu ich usunięcia, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Wymieszaj posortowaną zawiesinę komórek guza prostaty z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej w stosunku jeden do jednego i umieść mieszaninę na lodzie. Następnie znieczul samca myszy immunodeficjentnej w wieku od ośmiu do 10 tygodni zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, stosując 5% izofluranu wdychanego przy przepływie tlenu wynoszącym jeden litr na minutę.Upewnij się, że zastosowano odpowiednią anestezję, sprawdzając utratę odruchu rogówkowego oraz odruchu palców u myszy. Pobierz 250 µL zawiesiny komórkowej za pomocą igły o rozmiarze 25 G i strzykawki o pojemności 1 mL. Następnie wstrzyknij całą objętość zawiesiny komórek macierzy zewnątrzkomórkowej podskórnie w górne boki ciała myszy. Monitoruj guzy, wykonując cotygodniową palpację miejsc wstrzyknięć w poszukiwaniu wzrostu podskórnych zagęszczeń guzkowych.Z uwagi na zastosowaną w tym protokole metodę selekcji negatywnej, konieczne jest wykluczenie martwych komórek za pomocą barwienia DAPI. Jak tu pokazano, odsetek komórek CD 45-ujemnych spośród pozostałych żywych komórek jest zmienny i zależy od obciążenia nowotworowego pacjenta, jednak są one łatwo oddzielne od komórek CD 45-dodatnich. Przy zastosowaniu odpowiedniego bramkowania, po implantacji zawiesiny komórek guza prostaty, po obu bokach myszy pojawią się widoczne podskórne zagęszczenia guzkowe.Każda gęstość guzkowa reprezentuje wzrost ksenoprzeszczepu i może zostać odróżniona od zdrowej tkanki, ponieważ wystaje ona z mięśni grzbietowych myszy i ma twardszą strukturę. Modele ksenoprzeszczepów pochodzenia pacjenta, wytworzone z krążących komórek nowotworowych, odtwarzają ludzkie guzy prostaty, co potwierdzono w barwieniu hematoksyliną i eozyną oraz w badaniu immunohistochemicznym w kierunku specyficznych markerów komórkowych prostaty, takich jak receptor androgenowy oraz antygen swoisty dla błony prostaty, po wytworzeniu ksenoprzeszczepów. Można przeprowadzić inne protokoły, takie jak profilowanie ekspresji genów lub białek, aby zbadać mechanizmy komórkowe i molekularne przyczyniające się do agresywności raka prostaty.

generation-prostate-cancer-patient-derived-xenograft-models-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy produkcję skompresowanych granulek hormonów, jak również podskórne chirurgiczne wszczepianie implantów myszom. Strategia ta może być połączona ze wzrostem ksenoprzeszczepów komórkowych i tkankowych pod torebką nerkową nagich myszy w celu oceny kancerogenezy hormonalnej i regulacji łagodnego wzrostu prostaty.

Ksenograf torebki nerkowej i podskórna implantacja osadu w celu oceny kancerogenezy gruczołu krokowego i łagodnego przerostu gruczołu krokowego

Rak prostaty jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Ortotopowy model raka stanowi użyteczne podejście do zrozumienia biologii raka prostaty i oceny skuteczności schematów terapeutycznych. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki niezbędne do ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty.

Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

Opisujemy metodę stabilnego znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) cząstkami lentiwirusowymi wyrażającymi białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy. Metoda ta pozwala na śledzenie wzrostu PDX w miejscu pierwotnym, a także wykrywanie spontanicznych i eksperymentalnych przerzutów za pomocą systemów obrazowania in vivo.

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie domięśniowego wstrzykiwania komórek raka prostaty do środka prostaty, z późniejszą kastracją. Ortotopowe modele przedkliniczne androgenozależnego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego mają kluczowe znaczenie dla badania choroby w kontekście klinicznie istotnego mikrośrodowiska guza i immunokompetentnego gospodarza.

Bioluminescencyjny i fluorescencyjny, ortotopowy, syngeniczny mysi model androgenowego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego

Ten protokół opisuje generowanie modeli ortotopowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów poprzez dopęcherzowe wkraplanie komórek raka urotelialnego o wysokim stopniu złośliwości lub dodoodbytnicze wstrzykiwanie komórek raka jelita grubego do myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) w celu pierwotnego wzrostu guza i spontanicznych przerzutów pod wpływem komórek zrębu węzłów chłonnych, co naśladuje postęp ludzkich chorób przerzutowych.

Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów pobrane od pacjentów dla ludzkiego raka urotelialnokomórkowego i raka jelita grubego, wzrostu guza i spontanicznych przerzutów

Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.

Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Obecny protokół opisuje metody tworzenia modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) i pierwotnych linii komórek rakowych z próbek chirurgicznego raka żołądka. Metody te stanowią użyteczne narzędzie do opracowywania leków i badań w zakresie biologii nowotworów.

Opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Przedstawiamy protokół generowania minimalnie inwazyjnego modelu ortotopowego raka trzustki poprzez wstrzykiwanie ludzkich komórek raka trzustki pod kontrolą ultradźwięków i późniejsze monitorowanie wzrostu guza in vivo za pomocą obrazowania ultradźwiękowego.

Wytwarzanie ortotopowego ksenoprzeszczepu komórek raka trzustki za pomocą iniekcji pod kontrolą ultradźwięków

Heterogeniczność raka prostaty i oporność na leczenie pozostają wyzwaniami. Opisujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów (PDO), które zachowują kluczowe cechy guza rodzicielskiego. Ten standaryzowany model wspiera badania przesiewowe leków i postępy w medycynie precyzyjnej.

Ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów: szczegółowy protokół eksperymentalny

Poznaj metodę generowania ksenoprzeszczepów PDX z krążących komórek nowotworowych u pacjentów z rakiem prostaty. Technika ta umożliwia izolację CTCs z krwi obwodowej i ich wstrzyknięcie do myszy immunokompromitowanych.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów