Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Ogólnym celem poniższego protokołu jest wygenerowanie raka prostaty. Ksenoprzeszczep uzyskany od pacjenta z krążących komórek nowotworowych. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw krwi obwodowej od pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty.

W drugim etapie izoluje się przedział komórek jednojądrzastych krwi, który zawiera krążące komórki nowotworowe. Następnie komórki jednojądrzaste są barwione przeciwciałem CD 45 ZI W celu wyselekcjonowania krążących komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej, komórki są następnie wstrzykiwane myszom z obniżoną odpornością. Wyniki wskazują na wytwarzanie ksenoprzeszczepów raka gruczołu krokowego na podstawie iniekcji krążących komórek nowotworowych wyizolowanych metodą cytometrii przepływowej z krwi obwodowej pacjentów z rakiem gruczołu krokowego.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka prostaty poprzez wygenerowanie nowych modeli eksperymentalnych, które można wykorzystać do molekularnej charakterystyki raka prostaty i opracowania nowych biomarkerów. Procedurę zademonstruje Williams, student z laboratorium i Omada, badacz z oddziału onkologii w Mount Sinai Aby rozpocząć pobieranie pełnej krwi od wybranych pacjentów z przerzutowym rakiem prostaty, ponieważ mogą oni mieć dużą liczbę krążących komórek nowotworowych we krwi obwodowej. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej przenieś pełną krew do 50-mililitrowej stożkowej probówki z polistyrenu wraz z roztworem soli równoważącej Hanka.

W stosunku jeden do jednego delikatnie odpipetuj mieszaninę, aby ją zhomogenizować. Następnie dodaj 15 mililitrów roztworu pakietu FI do pustej 50-mililitrowej stożkowej rurki z polistyrenu. Delikatnie odpipetować 20 mililitrów rozcieńczonej krwi pełnej, używając najniższego ustawienia na wierzchu roztworu, aby utworzyć wyraźną górną warstwę.

Następnie odwirować probówkę o sile 400 g przez 30 minut. W temperaturze pokojowej ustaw opóźnienie wirówki na najniższe ustawienie, aby zapobiec mieszaniu się roztworów po oddzieleniu. Po odwirowaniu zidentyfikuj cienki, biały, szary pasek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i krążących komórek nowotworowych umieszczonych między górną warstwą osocza a roztworem rozdzielającym.

Na dnie probówki ostrożnie zbierz komórki z biało-szarego paska i przenieś je do 50-mililitrowej rurki polistyrenowej. Za pomocą plastikowej pipety transferowej dodaj Hank's. Zrównoważyć roztwór soli do izolowanych komórek na łączną objętość 10 mililitrów.

Ponownie odwirować mieszaninę przy 400 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. W celu przemycia komórek należy usunąć supernatant i powtórzyć to płukanie. Krok jeszcze raz.

Po drugim przemyciu wyrzucić supernatant. Zawiesić pozostały osad w pięciu mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować roztwór przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować próbkę o sile 400 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i usunąć bufor do lizy, odrzucając supernatant.

Na koniec ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą przed barwieniem. Określ ilościowo liczbę żywotnych komórek za pomocą standardowej metody wykluczenia błękitu trianowego na hemometrze, cytometrze lub automatycznym liczniku komórek. Następnie rozcieńczyć komórki do 1 miliona komórek na mililitr w PBS z 10% FBS i umieścić je na lodzie na godzinę.

Aby zablokować niespecyficzne wiązanie, rozprowadź zawiesinę komórek do dwóch oddzielnych probówek. Oznaczyć jedną probówkę dla komórek kontrolnych i jedną dla komórek barwiących CD 45 w probówce kontrolnej. Dodać IgG jeden Kappa Zi w rozcieńczeniu od jednego do 250 do końcowego stężenia 10 nanogramów na mililitr.

W tubie do barwienia CD 45. Dodać sprzężone przeciwciało pierwszorzędowe CD 45 ZI o tym samym stężeniu 10 nanogramów na mililitr i inkubować zawiesiny komórek na lodzie przez 30 minut. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 400 G przez trzy minuty w czterech stopniach Celsjusza, a następnie wyrzuć snat.

Umyj komórki dwukrotnie, zawieszając każdą osadkę w sterylnym PBS uzupełnionym 10% FBS, a następnie odwiruj w 400 G przez trzy minuty w czterech stopniach Celsjusza. Po umyciu resus zawiesić komórki w jednomililitrowym roztworze PBS zawierającym 10 mikrogramów na mililitr plamy dappy. Przefiltruj końcowy roztwór przez 35-mikrometrowe nasadki sitkowe do probówek polistyrenowych o wymiarach 12 milimetrów na 75 milimetrów, aby wykluczyć wszelkie grudki komórek lub zanieczyszczenia.

Następnie wykluczyć komórki CD 45 dodatnie i martwe komórki z zawiesiny za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu ich usunięcia, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Wymieszaj posortowaną zawiesinę komórek nowotworu prostaty z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej w stosunku jeden do jednego i umieść mieszaninę na lodzie. Następnie znieczulij usta mężczyzny w wieku od 8 do 10 tygodni z niedoborem odporności zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, używając 5% wdychanego izofluoru w jednym litrze tlenu na minutę.

Zapewnij odpowiednie znieczulenie, sprawdzając, czy u myszy nie ma utraty odruchu rogówkowego i palca u stóp. Pobrać 250 mikrolitrów zawiesiny komórek za pomocą igły o rozmiarze 25 i strzykawki o rozmiarze 1 mililitra. Następnie wstrzyknąć całą objętość zawiesiny komórek macierzy zewnątrzkomórkowej podskórnie do obu górnych boków guzów monitora myszy, wykonując cotygodniowe badanie palpacyjne miejsc wstrzyknięcia myszy w celu wzrostu podskórnej gęstości guzkowej.

W oparciu o metodę selekcji negatywnej zastosowaną w tym protokole konieczne jest wykluczenie martwych komórek za pomocą barwienia DAPI. Jak pokazano tutaj, odsetek komórek ujemnych CD 45 od pozostałych żywotnych komórek jest zmienny i zależy od obciążenia guza pacjenta, ale można je łatwo oddzielić od komórek CD 45 dodatnich. Gdy stosuje się prawidłowe bramkowanie, po zagnieżdżeniu się zawiesiny komórek nowotworowych prostaty, podskórne gęstości guzkowe staną się widoczne po obu stronach myszy.

Każda gęstość guzkowa reprezentuje wzrost ksenoprzeszczepu i można ją ocenić jako odrębną od zdrowej tkanki, ponieważ wystaje z mięśni grzbietowych myszy i ma twardszą teksturę. Modele ksenoprzeszczepów pochodzące od pacjentów wygenerowane z krążących komórek nowotworowych podsumowują ludzkie guzy gruczołu krokowego, jak widać za pomocą barwienia hematów, toiny i eozyny oraz za pomocą immunohistochemii dla markerów komórkowych specyficznych dla prostaty, takich jak receptor androgenowy i antygen błonowy specyficzny dla prostaty Po wygenerowaniu ksenoprzeszczepów. Inne protokoły, takie jak profilowanie ekspresji genów lub białek, można wykonać w celu zbadania mechanizmów komórkowych i molekularnych, które przyczyniają się do agresywności raka prostaty.