Name: Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj metodę analizy integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa. Technika ta umożliwia badanie dystrofii mięśniowej i rozwoju terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Trentowi Waughowi za jego pomoc techniczną. Dziękujemy również Oddziałowi Pediatrii Szpitala dla Chorych Dzieci i Leczenia Wrodzonej Dystrofii Mięśniowej (CMD) za hojne fundusze na ten projekt.

1. Przygotowanie płytek iniekcyjnych do agaru (Czas: 45 min)
<ol>
	<li>Zagotuj od 2% do 3% agarozy w pożywce E3 i pozostaw roztwór do lekkiego ostygnięcia na ławce. Uwaga: Liczba przygotowywanych płytek iniekcyjnych decyduje o wymaganej ilości agarozy. Na każdą płytkę iniekcyjną potrzeba około 35 ml roztworu agarozy.</li>
	<li>Po ugotowaniu pozostaw agarozę do ostygnięcia, aż zostanie osiągnięta żądana temperatura (np. 45 °C) zgodnie z instrukcjami producenta formy wtryskowej.</li>
	<li>Wlać około 35 ml schłodzonej agarozy do naczynia o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Umieść jeden koniec preferowanej formy wtryskowej w roztworze, a następnie połóż pozostałą część formy na roztworze agarozy (pomoże to zmniejszyć występowanie pęcherzyków powietrza).</li>
	<li>Pozostawić roztwór agarozy do zestalenia się w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez około 30 minut.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki oddziel jeden koniec formy od stałej agarozy. Powoli usuń pozostałą część formy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mieszanki iniekcyjnej Evans Blue Dye (EBD) (Czas: 30 min)
<ol>
	<li>Zrób 1% zapasu EBD w roztworze 1X Ringera (155 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; 2 mM Na2HPO4; 10 mM HEPES; 10 mM glukozy; pH do 7,2), który można przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Sporządzić roztwór podstawowy izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu MW 10 000 kDa o stężeniu 25 mg/ml w roztworze 1X Ringera i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę iniekcyjną, rozcieńczając EBD do 0,1% bezpośrednio w roztworze podstawowym FITC-dekstranu (tj. dla końcowej objętości roboczej 100 μl: zmieszać 10 μl 1% EBD z 90 μl dekstranu FITC).</li>
	<li>Dokładnie zwiruj mieszankę iniekcyjną (powinna zmienić kolor na zielony) i trzymaj z dala od bezpośredniego światła, owijając rurkę z mieszanką do wstrzykiwań w folię aluminiową.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do iniekcji EBD (czas: około 30 min)
Uwaga: Protokół działa najlepiej z larwami od 3-7 dni po zapłodnieniu (dpf).
<ol>
	<li>Wstępnie ciepła płyta wtryskowa do RT.</li>
	<li>Ustaw aparat iniekcyjny, ustawiając mikromanipulator na metalowej płytce i stań obok mikroskopu używanego do wstrzykiwania. Włącz sterownik mikroiniekcji napędzany powietrzem. Uwaga: Preferowany system wstrzykiwań różni się w zależności od laboratorium i nie powinien zmieniać wyniku analizy.</li>
	<li>Igła do wstrzykiwań z tyłu wypełniona około 2-4 μl mieszanki EBD.</li>
	<li>Skalibrować objętość wtrysku do około 5 nl mieszanki EBD. Uwaga: Kalibracja objętości wtrysku będzie zależeć od metody kalibracji. Wtrysk napędzany tłokiem może być bezpośrednio ustawiony na określoną objętość wtrysku, podczas gdy wtryskiwacze ciśnieniowe gazu będą wymagały kalibracji objętości wtrysku za pomocą bolusa objętościowego za pomocą mikrometru.</li>
	<li>Zwilż płytkę iniekcyjną 1X roztworem Ringera i usuń nadmiar z dołków.</li>
	<li>Wstępnie potraktuj larwy 0,04% solą metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (trikainą) rozcieńczoną w roztworze 1X Ringera w celu unieruchomienia larw przed rozpoczęciem wstrzykiwania. Uwaga: Upewnienie się, że larwy są całkowicie nieruchome, jest ważne, ponieważ prawidłowe wstrzyknięcie jest trudne przy każdym szczątkowym ruchu.</li>
	<li>Umieścić znieczulone larwy w dołkach płytek iniekcyjnych agaru za pomocą szklanej pipety. Upewnij się, że larwy znajdują się całkowicie w studni i leżą na boku. Uwaga: Liczba larw w studzience zależy od eksperymentatora.</li>
	<li>Po umieszczeniu larw w studzienkach usuń nadmiar roztworu Ringera, aby zminimalizować ruch larw w studni. Pozostaw pozostałą ilość roztworu, aby larwy się nie odwodniły.</li>
</ol>
4. Iniekcja osierdziowa larw danio pręgowanego z EBD (Czas: Zależny od liczby wstrzykniętych larw, szacowany 1-3 godziny)
<ol>
	<li>Umieścić płytkę iniekcyjną zawierającą larwy na lunecie sekcyjnej, w której będą wykonywane zastrzyki.</li>
	<li>Umieścić igłę do pipety iniekcyjnej zawierającą mieszaninę EBD na larwie danio pręgowanego.</li>
	<li>Ponownie umieścić płytkę iniekcyjną, obracając ją tak, aby igła do wstrzykiwań znajdowała się w pobliżu serca larwy i około 45° brzusznie od osi przednio-tylnej.</li>
	<li>Wprowadzić igłę do wstrzykiwań do wspólnej żyły kardynalnej (CCV) w obszarze żyły w przedniej części żółtka, gdzie żyła początkowo obraca się w kierunku grzbietowym (ryc. 1). Uwaga: Powiększenie do 40x może być przydatne, aby wyraźnie zobaczyć CCV.</li>
	<li>Wstrzyknąć 5 nl mieszanki EBD i trzymać igłę do wstrzykiwań w odpowiedniej pozycji przez 5-8 sekund, aby zminimalizować natychmiastowy wyciek mieszanki EBD. Uwaga: Dobre wstrzyknięcie będzie miało zabarwienie barwnikiem widoczne w komorach serca (ryc. 1). Jeśli mieszanina EBD nie zostanie zaobserwowana w sercu, wstrzyknięcie dodatkowych 5 nl mieszaniny EBD może być wystarczające do wywołania wychwytu barwnika. Alternatywnie zarodek można wyrzucić. 
	Uwaga: W niektórych sytuacjach serce może przestać bić. W takim przypadku należy kontynuować monitorowanie larw przez 20-40 sekund. Zazwyczaj serce wznawia bicie, gdy barwnik przepływa przez układ krążenia.</li>
	<li>Przejdź do następnych larw i powtórz.</li>
	<li>Zidentyfikuj pomyślnie wstrzyknięte zarodki, obserwując obecność FITC-dekstranu w naczyniach krwionośnych bezpośrednio po wstrzyknięciu (ryc. 2).</li>
</ol>
5. Inkubacja i absorpcja EBD (Czas: 4-6 godzin)
<ol>
	<li>Po wstrzyknięciu żądanej liczby larw, wstrzyknięte larwy należy umieścić z powrotem w roztworze 1X Ringera bez tricainy w szalkach 100 mm.</li>
	<li>Naczynia należy przechowywać zawinięte w folię aluminiową. Uwaga: Trzymanie wstrzykniętych larw w ciemności znacznie zwiększa przeżywalność i zapewnia największą spójność siły sygnału. Owijanie w folię aluminiową jest szczególnie ważne w okresie, w którym larwy znajdują się poza inkubatorem.</li>
	<li>Pozostawić larwy do inkubacji w temperaturze 28,5 °C przez 4-6 godzin, aby zapewnić wystarczające pobieranie EBD.</li>
</ol>
6. Wizualizacja EBD w mięśniu (czas: zależny od liczby wstrzykniętych larw i rodzaju mikroskopii, szacowany na 0,5-3 godziny)
<ol>
	<li>Przed obrazowaniem należy znieczulić larwy 0,04% tricainą, aby zapobiec ruchom.</li>
	<li>Zobacz larwy pod wpływem czerwonej fluorescencji, aby określić, czy wychwyt EBD występuje w mięśniach szkieletowych (ryc. 3).</li>
</ol>

<ol><li>Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Duchenne+muscular+dystrophy+%28DMD%29+for+the+pediatricians+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Pediatr+%28Phila%22%5BJournal%5D)">Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community.</a> Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).</li>
<li>Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+into+prominence%3A+the+zebrafish+as+a+valuable+tool+for+studying+human+myopathies+and+muscular+dystrophies%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies).</a> FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).</li>
<li>Lancet, , 381-845 (2013).</li>
<li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dystrophin+glycoprotein+complex%3A+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Campbell, K. P., Kahl, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+dystrophin+and+an+integral+membrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein.</a> Nature. 338, 259-262 (1989).</li>
<li>Cohn, R. D., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of muscular dystrophies.</a> Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).</li>
<li>Yoshida, M., Ozawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+complex+anchoring+dystrophin+to+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma.</a> J Biochem. 108, 748-752 (1990).</li>
<li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).</li>
<li>Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+dystrophic+muscle+fibers+in+mdx+mouse+by+vital+staining+with+Evans+blue%3A+evidence+of+apoptosis+in+dystrophin-deficient+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle.</a> J Biochem. 118, 959-964 (1995).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+muscle+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Modeling human muscle disease in zebrafish.</a> Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).</li>
<li>Cavanna, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+genetic+mapping+of+the+mouse+mdx+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus.</a> Genomics. 3, 337-341 (1988).</li>
<li>Bassett, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Horstick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stac3+is+a+component+of+the+excitation-contraction+coupling+machinery+and+mutated+in+Native+American+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy.</a> Nat Commun. 4, (1952).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li>
<li>Whitfield, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral.</a> , 123-241 (1996).</li>
<li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, (2013).</li>
<li>Waugh, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoxetine+prevents+dystrophic+changes+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.</li>
<li>Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+embryonic+and+larval+zebrafish+skeletal+myofibers+from+dissociated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations.</a> J Vis Exp. 50259, (2013).</li>
<li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. 50925, (2013).</li>
<li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo.+marker+of+myofibre+damage%3A+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+isolation+and+characterization+of+a+splicing+mutant+of+zebrafish+dystrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin.</a> Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Majczenko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Mutation+of+CCDC78+in+a+Unique+Congenital+Myopathy+with+Prominent+Internal+Nuclei+and+Atypical+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum%22%5BJournal%5D)">Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores.</a> Am J Hum. , (2012).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Evans+blue+dye+to+compare+limb+muscles+in+exercised+young+and+old+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice.</a> Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Danio pręgowany staje się potężnym narzędziem do badania chorób nerwowo-mięśniowych2,29. Do tej pory system danio pręgowanego był wykorzystywany do walidacji nowych mutacji powodujących choroby mięśni16,17,30, wyjaśniania nowych patomechanizmów18 i identyfikowania potencjalnie nowych leków terapeutycznych12,24. Te zbiorowe wysiłki ustaliły przydatność danio pręgowanego do modelowania ludzkich chorób nerwowo-mięśniowych. Jednak pomimo postępów poczynionych w modelach danio pręgowanego i ssaków, istnieją ograniczone możliwości leczenia pacjentów w szerokim spektrum schorzeń nerwowo-mięśniowych. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na opracowanie terapii dla tej grupy wyniszczających chorób. Równolegle z tym zapotrzebowaniem na terapie idzie w parze potrzeba ciągłych innowacji eksperymentalnych, a także rygorystycznych analiz w celu weryfikacji nowych modeli zwierzęcych i przypuszczalnych strategii terapeutycznych.
Analiza EBD jest powszechnie stosowana w modelach mysich do badania uszkodzeń tkanek i komórek w mózgu, sercu i mięśniach szkieletowych27,31. Przede wszystkim EBD jest szeroko stosowany w mysich modelach różnych podtypów dystrofii mięśniowej, aby pokazać nasilenie niestabilności i uszkodzenia błony mięśniowej8. Zastosowanie EBD w celu ujawnienia uszkodzenia błony mięśniowej jest parametrem pomocniczym określającym podobieństwo modelu zwierzęcego do stanu chorobowegoczłowieka 9. Moc EBD u myszy skłoniła kilka laboratoriów, w tym nasze, do opracowania i zastosowania EBD w modelach chorób nerwowo-mięśniowych danio pręgowanego. Ze względu na możliwość zastosowania analizy EBD, technika ta jest aktywnie wdrażana w celu potwierdzenia modeli danio pręgowanego w stanie chorobowymczłowieka 11,15,22,24,32. Larwy z uszkodzonymi błonami mięśniowymi będą miały wychwyt EBD, a tym samym czerwoną fluorescencję we włóknach mięśniowych. Fluorescencja obserwowana w przestrzeni międzywłóknistej, ale nie w obrębie pojedynczych włókien mięśniowych, może również informować o odłączaniu się włókien od błony podstawnej przy braku uszkodzenia błony, dostarczając użytecznych szczegółów diagnostycznych. Analiza EBD ma potencjalne zastosowanie wykraczające poza walidację modeli zwierzęcych. Wysiłki naszego laboratorium wykazały niedawno, że analiza EBD jest korzystna w walidacji potencjalnie nowych leków terapeutycznych24. Ustalenie, czy potencjalne terapie zmniejszają lub znoszą wychwyt EBD w modelach chorób nerwowo-mięśniowych, może oznaczać odpowiednie działanie terapeutyczne8. Ten rodzaj analizy może pomóc w ustaleniu mechanizmu (mechanizmów) terapii i rozszerza zastosowanie analizy EBD.
Podobnie jak w przypadku wielu technik, analiza EBD ma kilka zastrzeżeń, które należy zaobserwować podczas projektowania i praktyki eksperymentalnej. Na przykład zidentyfikowanie CCV może być trudne ze względu na pogrubienie tkanki wraz z wiekiem. Ponadto łatwo jest uszkodzić larwy podczas przygotowań przed i w trakcie iniekcji osierdzia, co zmniejsza liczbę doświadczalną i zwiększa potrzebę przygotowania dużej liczby larw. Co więcej, fizyczne uszkodzenia larw podczas obchodzenia się z nimi i wstrzykiwania mogą skutkować fałszywie dodatnimi wynikami, ponieważ uszkodzone mięśnie mogą wchłonąć EBD. Aby przezwyciężyć niektóre z tych przeszkód, w tym artykule wideo opisaliśmy strategię koiniekcji, która umożliwia łatwą i niezawodną identyfikację larw z udanym wlewem barwnika natychmiast po wstrzyknięciu i przed późniejszą analizą. Jednoczesna iniekcja FITC-dekstran kontroluje skuteczne wstrzyknięcie, umożliwiając potwierdzenie EBD w układzie naczyniowym przed jego wychwytem przez włókna mięśniowe. Może to być szczególnie przydatne, ponieważ fluorescencja EBD staje się wysoce rozproszona u larw po kilku godzinach, jeśli nie zostanie zebrana we włóknach mięśniowych; W związku z tym może być trudny do wykrycia. Ponadto pominięcie CCV i wstrzyknięcie EBD do żółtka lub jamy ciała może, po inkubacji, spowodować rozproszoną czerwoną fluorescencję podobną do zarodków kontrolnych, ale ze zmniejszonym prawdopodobieństwem wychwytu przez uszkodzone włókna mięśniowe. Łącznie te zastrzeżenia sugerują, że wstrzyknięcie EBD wymaga cierpliwości i praktyki, aby osiągnąć spójne i wiarygodne wyniki.
Podsumowując, opisujemy praktyczną i prostą metodę przeprowadzania analizy EBD na larwach danio pręgowanego. Do tej pory wykorzystanie danio pręgowanego jako systemu modelowego, zwłaszcza jako modelu choroby człowieka, szybko się rozwija. Ekspansja ta jest częściowo spowodowana ciągłym rozwojem i modyfikacją technik eksperymentalnych, które poprawiają obecne zalety systemu danio pręgowanego. Technika iniekcji EBD stanowi dodatkowe i potężne narzędzie do arsenału badaczy do walidacji i badania modeli chorób mięśni danio pręgowanego. Trwające wdrażanie i modyfikowanie tej techniki może pomóc w odkryciu nowych strategii terapeutycznych, a także mechanizmów powodujących choroby.

Dystrofie mięśniowe stanowią grupę powszechnych i niejednorodnych chorób mięśni ludzkich o specyficznych cechach histopatologicznych1,2. Objawy zwykle związane z tą wyniszczającą grupą chorób obejmują osłabienie mięśni, zwyrodnienie mięśni, utratę motoryki i wczesną śmiertelność1,3. Głównymi patomechanizmami dystrofii mięśniowych jest utrata białek, które stabilizują sarkolemmę, zakotwiczają kompleksy transbłonowe i pośredniczą w sygnalizacji komórkowej przez błonę4-6. Na przykład całkowita utrata białka dystrofiny, głównego białka rusztowania kompleksu dystrofina-glikoproteina, powoduje destabilizację błony mięśniowej w dystrofii mięśniowejDuchenne'a 7. Ze względu na fakt, że większość dystrofii mięśniowych wynika z mutacji w białkach, które uczestniczą w połączeniu między macierzą zewnątrzkomórkową a cytoszkieletem sarkolemmalnym, częstą obserwacją na poziomie komórkowym jest utrata integralności krzyżowej8,9. To zrozumienie głównych patomechanizmów związanych z dystrofiami mięśniowymi jest wynikiem wielu lat badań z wykorzystaniem systemów modeli zwierzęcych2,10-15. Jednak pomimo postępów w tej dziedzinie, nadal istnieją ograniczone możliwości terapeutyczne w zakresie leczenia lub zarządzania szeregiem podtypów dystrofii. To ograniczenie skutecznych terapii wynika z kilku kluczowych czynników: 1) trudności strategii terapii genowej, 2) wysokiej częstotliwości przypadków chorób de novo i związanego z tym braku translowalnych modeli zwierzęcych oraz 3) braku rygorystycznych strategii testowania fizjologicznych konsekwencji domniemanych środków terapeutycznych za pomocą jasnych i odtwarzalnych miar wyników.
Aby przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń, liczne laboratoria, w tym nasze, wykorzystują danio pręgowanego jako system do modelowania i badania ludzkich chorób nerwowo-mięśniowych2. Do tej pory danio pręgowany okazał się cennym narzędziem w badaniach nad chorobami. Model danio pręgowanego został wykorzystany do identyfikacji i walidacji nowych mutacji powodujących chorobę u ludzi16,17, wyjaśnienia niescharakteryzowanych mechanizmów wywołujących chorobę17,18 oraz identyfikacji nowych strategii terapeutycznych12,19. Postępy te zostały częściowo osiągnięte dzięki kanonicznym zaletom systemu danio pręgowanego, takim jak ich przejrzystość optyczna, łatwość manipulacji genetycznej i zdolność do rozmnażania się wdużych ilościach. Danio pręgowany okazał się również podatny na badania przesiewowe leków na dużą skalę21, co jest cenną metodą identyfikacji nowych terapii22-24. Jeśli chodzi o badania nad chorobami mięśni, mocne strony te są uzupełnione przez zdolność do izolowania pojedynczych włókien mięśni szkieletowych danio pręgowanego poprzez dysocjację25 oraz przez zdolność do badania organizacji mięśni in vivo przy użyciu zjawiska optycznego zwanego dwójłomnością26, co łącznie pozwala na szybkie określenie makroskopowej integralności mięśni. Niezależnie od tych dostępnych narzędzi, ciągły rozwój narzędzi jest wymagany w celu poczynienia postępów w badaniach.
My, wraz z innymi, dostosowaliśmy protokół wstrzykiwania i analizy EBD w modelu danio pręgowanego. EBD jest niezbędnym, przepuszczalnym dla komórek barwnikiem, który jest pobierany przez uszkodzone, degenerujące się lub apoptotyczne komórki, a następnie wizualizowany pod wpływem fluorescencji27. Do tej pory analiza EBD była szeroko stosowana do analizy integralności błony mięśniowej w mysich modelach chorób mięśni szkieletowych i serca8,9,27. Jednak w preparatach ssaków pobrane mięśnie zazwyczaj wymagają pracochłonnego cięcia lub sekcji przed analizą. W przypadku danio pręgowanego możliwa jest bezpośrednia analiza w dużych ilościach przy użyciu żywych i nienaruszonych zwierząt. W tym artykule wideo zademonstrujemy metodologię wykonywania iniekcji i analizy EBD u żywych larw danio pręgowanego, z reprezentatywnymi obrazami wychwytu EBD w zmutowanej linii dystrofii danio pręgowanego sapje15,28. Ponadto przedstawiamy strategię koiniekcji, która pozwala na zwiększenie ilościowej oceny preparatów EBD.

<table><tbody><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran MW 10 000</td><td>Sigma</td><td>FD10S</td> Evan's Blue Dye Sigma E2129 Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu Sigma A5040 100 mm szalka Petriego FB0875712 Fischerbrand Podstawa formy wtryskowej Cienkościenne <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> szklane kapilary World Precision Instruments <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>TW100F-4</td><td>Do igły iniekcyjnej</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>Forma wtryskowa</td></tr><tr>Forma do<td>mikroiniekcji</td><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td><td>TU-1</td><td>Forma wtryskowa</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Bioshop</td><td>SOD001</td><td>Roztwór Ringera</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td>Roztwór Ringera</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>Roztwór Ringera</td></tr><tr><td>Sodu fosforan jednozasadowy</td><td>jednowodny Sigma</td><td>S9638</td><td>Roztwór Ringera</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Roztwór Ringera</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Roztwór Ringera</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C1061</td><td>Roztwór Ringera</td></tr></tbody></table>

analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika evansa

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Model danio pręgowanego to nowy system do badania zaburzeń nerwowo-mięśniowych. W badaniach nad chorobami nerwowo-mięśniowymi integralność błony mięśniowej jest krytycznym wyznacznikiem choroby. Do tej pory wiele schorzeń nerwowo-mięśniowych objawia się degeneracją włókien mięśniowych z nieprawidłową integralnością błony; Najczęściej obserwuje się to w dystrofiach mięśniowych. Niebieski barwnik Evansa (EBD) jest niezbędnym, przepuszczalnym dla komórek barwnikiem, który jest szybko wchłaniany do komórek degenerujących, uszkodzonych lub apoptotycznych; W przeciwieństwie do tego, nie jest pobierany przez komórki z nienaruszoną błoną. Wstrzyknięcie EBD jest powszechnie stosowane w celu ustalenia integralności mięśni w mysich modelach chorób nerwowo-mięśniowych. Jednak takie eksperymenty EBD wymagają rozbioru mięśni i/lub sekcji przed analizą. Natomiast wychwyt EBD przez danio pręgowanego jest wizualizowany w żywych, nienaruszonych preparatach. W tym miejscu demonstrujemy prostą i nieskomplikowaną metodologię wykonywania iniekcji i analizy EBD u żywych ryb pręgowanych. Ponadto demonstrujemy strategię koiniekcji w celu zwiększenia skuteczności analizy EBD. Ogólnie rzecz biorąc, ten artykuł wideo zawiera zarys wykonywania iniekcji i charakterystyki EBD w modelach choroby nerwowo-mięśniowej danio pręgowanego.

Mieszaninę wstrzykiwaną EBD wstrzykiwano do CCV homozygotycznych mutantów sapje oraz ich rodzeństwa typu dzikiego w 3. dniu po zapłodnieniu (dpf). W przypadku wstrzykiwań, które wypełniły komory serca (Rycina 1B), analizowano poprawność procedury poprzez wizualizację dekstranu FITC w układzie naczyniowym przy użyciu zielonej fluorescencji (Rycina 2).
Po 4-godzinnym okresie inkubacji pobieranie EBD badano na poziomie somytów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Rodzeństwo typu dzikiego nie wykazywało fluorescencji EBD w żadnych widocznych włóknach mięśniowych (Rysunek 3A), natomiast mutanty homozygotyczne sapje wykazały pobieranie EBD, co wskazuje na uszkodzenie błony mięśniowej15 (Rysunek 3B).
<img alt="Etapy rozwoju zarodkowego danio pręgowanego, obrazy mikroskopowe, podkreślające zmiany w różnicowaniu tkanek." src="/files/ftp_upload/53183/53183fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Wstrzykiwanie mieszaniny EBD do wspólnej żyły głównej (CCV) zarodka danio pręgowanego. (A) Zarodek niewstrzyknięty. Strzałka wskazuje optymalne miejsce wstrzyknięcia do CCV. (B) Prawidłowe wstrzyknięcie do CCV. Barwnik dostaje się do komór serca (strzałka) i zaczyna być pompowany przez układ naczyniowy. (C) Nieudane wstrzyknięcie do CCV skutkuje dostaniem się części lub całości barwnika do pęcherzyka żółtkowego zarodka (strzałka). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej włókien mięśniowych ryb zebrafish, wyróżniający rozkład białka." src="/files/ftp_upload/53183/53183fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zarodki można sortować pod kątem udanego wstrzyknięcia, obserwując rozkład FITC-dekstranu w całej sieci naczyniowej pod wpływem zielonej fluorescencji bezpośrednio po wstrzyknięciu i przed pobraniem EBD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopowy obraz tkanki mięśniowej przedstawiający włókna prawidłowe (A) oraz uszkodzone (B) z zaznaczonym stanem zapalnym." src="/files/ftp_upload/53183/53183fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: EBD zostanie wchłonięty przez włókna z uszkodzonymi błonami. (A) Rodzeństwo typu dzikiego nie wykazuje fluorescencji EBD we włóknach mięśniowych. (B) Sapje mutant homozygotyczny z fluorescencją EBD w wielu włóknach mięśniowych (strzałki). Wszystkie larwy zostały wstrzyknięte mieszaniną EBD i przeanalizowane po 4-godzinnym okresie inkubacji w 3 dpf. Rodzeństwo i mutanty zostały posegregowane pod kątem odrywania się włókien mięśniowych przed wstrzyknięciem CCV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego. Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ogólnym celem wspólnego wstrzykiwania barwnika Evans Blue oraz dekstryny Fitzy do żyły głównej jest obserwacja integralności błony mięśni szkieletowych u żywych rybek zebrafish, co pomaga w charakterystyce mechanizmów wywołujących chorobę w odniesieniu do różnych podtypów dystrofii mięśniowej. Wstrzykiwanie barwnika Evans Blue może pomóc w odkryciu mechanizmów biologicznych przyczyniających się do patologii choroby podczas charakterystyki modeli zwierzęcych dystrofii mięśniowej, a także może przyczynić się do zrozumienia potencjalnych mechanizmów terapeutycznych w leczeniu tej choroby. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej przeprowadzenia i analizy z wykorzystaniem żywych rybek zebrafish.Dodatkowo, współiniekcja Fitz Dextrin stanowi kontrolę jakości potwierdzającą powodzenie iniekcji, co zwiększa rygorystyczność i precyzję ilościową badań. Zastosowanie tej techniki ma znaczenie dla walidacji modeli chorób mięśni u rybek zebrafish. Pozwala ona również na lepsze zrozumienie, w jaki sposób określone mutacje prowadzą do fenotypów chorób mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co jest kluczowe dla opracowania metod leczenia i terapii.Aby przygotować agarowe płytki do iniekcji, należy zagotować 2-3% agar w pożywce E3, a następnie pozostawić roztwór do lekkiego ostygnięcia na blacie. Nalać około 35 ml ostudzonego agaru do każdej płytki o średnicy 100 mm. Następnie należy umieścić jeden koniec wybranej formy do iniekcji w roztworze, a potem położyć resztę formy na powierzchni agaru.Pozostaw roztwór agarowy do stężenia w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez około 30 minut. Następnie za pomocą szpatułki oddziel jeden koniec formy od utwardzonego agaru i powoli usuń resztę formy. Przygotuj 1% roztwór zapasowy barwnika Evan's Blue Dye (EBD) w jednokrotnym roztworze Ringera.Następnie należy przygotować roztwór zapasowy Fitzy Dextrin w roztworze Ringer'a 1x i przechowywać go w temperaturze -20 °C. Aby przygotować mieszaninę do iniekcji, rozcieńczyć EBD do stężenia 0,1% bezpośrednio w roztworze zapasowym Fitz Dextrin, dokładnie wymieszać mieszaninę za pomocą wortexa i chronić przed bezpośrednim światłem, owijając probówkę folią aluminiową przed wykonaniem iniekcji. Płytkę do iniekcji należy uprzednio ogrzać do temperatury pokojowej.Umieść mikromanipulator na metalowej płytce i ustaw go obok mikroskopu do iniekcji. Włącz pneumatyczny sterownik mikroiniekcji. Następnie, używając około 2-4 µL mieszaniny EBD, wypełnij igłę do iniekcji od tyłu.Następnie skalibruj objętość iniekcji, używając około 5 nL mieszaniny EBD. Potem użyj 1x roztworu Ringera do zwilżenia płytki do iniekcji i usuń nadmiar roztworu z dołków. Przetraktuj larwy 0,04% tricainem rozcieńczonym w 1x roztworze Ringera, aby całkowicie unieruchomić larwy przed iniekcją za pomocą szklanej pipety. Umieść znieczulone larwy w dołkach płytek do iniekcji, upewniając się, że larwy znajdują się całkowicie w dołkach i leżą na bokach.Usunąć nadmiar roztworu trica, aby zminimalizować ruch larw w dołku, pozostawiając jednak ilość wystarczającą do zapobiegania odwodnieniu. Umieścić płytkę z larwami do iniekcji pod mikroskopem stereoskopowym i ustawić igłę pipety iniekcyjnej zawierającą EBD. Wykonać wstrzyknięcie w okolicy serca larwy danio pręgowanego, pod kątem około 45 stopni względem osi przednio-tylnej.Wprowadź igłę do wstrzykiwania do wspólnej żyły głównej (CCV) w pobliżu przedniej części żółtka, w miejscu, gdzie żyła zaczyna skręcać w kierunku grzbietowym. Następnie wstrzyknij 5 nL mieszaniny EBD i pozostaw igłę w tej pozycji przez od 5 do 8 sekund. Aby zminimalizować natychmiastowy wyciek mieszaniny EBD, prawidłowe wstrzyknięcie powinno skutkować widocznością barwnika w komorach serca; w przeciwnym razie procedurę można powtórzyć.Jeśli EB DMX nie jest widoczny w sercu bezpośrednio po udanym wstrzyknięciu, w układzie naczyniowym zarodka nagromadzi się Fitz Dextrin, jak pokazano tutaj. Po wstrzyknięciu odpowiedniej liczby larw, należy przenieść je do roztworu 1x Ringer bez trica w szalkach 100 mm, aby zwiększyć przeżywalność i utrzymać siłę sygnału. Szalki należy owinąć folią aluminiową.Inkubować larwy w temperaturze 28,5 °C przez cztery do sześciu godzin, aby zapewnić wydajne pobieranie EBD. Aby zwizualizować EBD w mięśniach, należy zastosować 0,04% trica w celu znieczulenia larw przed ich obserwacją w czerwonej fluorescencji. EBD wstrzyknięto do CCV mutantów homogenicznych Sapia oraz rodzeństwa typu dzikiego w 3D PF; wstrzyknięcia wypełniły komory serca, jak pokazano tutaj, a następnie przeanalizowano skuteczność perfuzji barwnika poprzez wizualizację fitzy dextrin w naczyniach krwionośnych w zielonej fluorescencji.Po czterogodzinnym okresie inkubacji zbadano pobieranie EBD na poziomie pojedynczych ryb, co przedstawiono na tej rycinie. Rodzeństwo typu dzikiego nie wykazywało fluorescencji EBD w żadnych widocznych włóknach mięśniowych, podczas gdy mutanty homozygotic sapia wykazywały pobieranie EBD, co wskazywało na uszkodzenie błony mięśniowej. Po opanowaniu techniki wstrzykiwania barwnika błękitu Evansa do wspólnej żyły głównej danio pręgowanego, procedura u larw może zostać zakończona w ciągu 30 do 60 minut, w zależności od liczby wstrzykiwanych larw.Dodatkowo, w celu zapewnienia biegłości, wyniki eksperymentalne można uzyskać w ciągu jednego dnia. Należy pamiętać o precyzyjnym celowaniu w żyłę główną, aby uzyskać spójne i interpretowalne wyniki. Może to być trudne i prawdopodobnie będzie wymagało praktyki po zapoznaniu się z tą procedurą.W celu ustalenia mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za uszkodzenia błony związane z dystrofiami mięśniowymi można przeprowadzić inne metody, takie jak przesiewy chemiczne i genetyczne. Eksperymenty te mogą pomóc w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych w chorobach mięśni. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie chorób mięśni do badania integralności błon w modelach dystrofii mięśniowej u rybek danio pręgowanych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wstrzyknąć barwnik błękit Evansa do wspólnej żyły głównej larw zebrafish. Powinni Państwo również wiedzieć, jak zidentyfikować włókna mięśniowe z uszkodzeniem błony komórkowej na podstawie obecności barwnika błękit Evansa wewnątrz włókien.

analysis-zebrafish-larvae-skeletal-muscle-integrity-with-evans-blue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Danio pręgowany to nowy system do modelowania zaburzeń mięśni szkieletowych u ludzi.  Opisujemy szybką i skuteczną metodę izolowania włókien mięśniowych mięśni szkieletowych od embrionalnego i larwalnego danio pręgowanego.  Metoda ta pozwala uzyskać preparat z włókien mięśniowych o dużej gęstości, odpowiedni do badania morfologii pojedynczych włókien mięśni szkieletowych, lokalizacji subkomórkowej białek i fizjologii mięśni.

Analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych

Pomiary siły mogą być użyte do pokazania zmian w funkcjonowaniu mięśni spowodowanych rozwojem, kontuzją, chorobą, leczeniem lub toksycznością chemiczną. W tym filmie pokazujemy metodę pomiaru siły podczas maksymalnego skurczu mięśnia tułowia larw danio pręgowanego.

Pomiar siły podczas skurczu w celu oceny funkcji mięśni u larw danio pręgowanego

Danio pręgowany jest teraz sprawdzonym i potężnym narzędziem do modelowania dystrofii mięśniowych, wrodzonych miopatii i pokrewnych chorób nerwowo-mięśniowych. Dwójłomność i zachowanie ucieczki wywołane dotykiem to dwa powszechne nieinwazyjne testy stosowane do określenia stopnia dezorganizacji mięśni i upośledzenia lokomocji zarodków danio pręgowanego we wczesnym okresie rozwoju.

Analiza wad mięśni szkieletowych u larw danio pręgowanego za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki wywołanej dotykiem

Mięśnie szkieletowe są niezbędne do poruszania się i są głównym magazynem białka w organizmie. Pomiary zdrowia mięśni w obrębie C. Opisano elegans. Potencjalne zmiany w strukturze i funkcji mięśni ocenia się za pomocą zlokalizowanego GFP i barwników kationowych.

Metody oceny subkomórkowych kompartmentów mięśniowych u C. elegans

Danio pręgowany to doskonały model do badania funkcji mięśni i chorób. Podczas wczesnej embriogenezy danio pręgowany rozpoczyna regularne skurcze mięśni, powodując rytmiczne zachowanie podczas pływania, które zmienia się, gdy mięsień jest zakłócony. W tym miejscu opisujemy reakcję wywołaną dotykiem i test lokomocji, aby zbadać wydajność pływania jako miarę funkcji mięśni.

Wykorzystanie reakcji wywołanej dotykiem i testów lokomocji do oceny wydajności i funkcji mięśni u danio pręgowanego

Analiza metodą elementów skończonych jest często używanym narzędziem do badania właściwości mechanicznych konstrukcji pod obciążeniem. Tutaj zastosujemy jego zastosowanie do modelowania biomechaniki szczęki danio pręgowanego.

Budowa modeli elementów skończonych w celu zbadania biomechaniki szczęk danio pręgowanego

Celem tego protokołu jest zmiana penetracji śmiercionośnych zmutowanych fenotypów szkieletowych u danio pręgowanego poprzez selektywną hodowlę. Śmiertelne mutanty nie mogą być dorosłe do dorosłości i rozmnażane samodzielnie, dlatego ten protokół opisuje metodę śledzenia i selekcji penetracji przez wiele pokoleń za pomocą testów potomstwa.

Przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Tutaj użyliśmy czerwonego barwienia alizaryną, aby pokazać, że ekspozycja na octan ołowiu powoduje zmianę masy kostnej u larw danio pręgowanego. Ta metoda barwienia może być dostosowana do badania utraty kości u larw danio pręgowanego wywołanej przez inne niebezpieczne substancje toksyczne.

Stosowanie barwienia czerwienią alizarynową w celu wykrycia chemicznie wywołanej utraty masy kostnej u larw danio pręgowanego

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Ten protokół opisuje model kriouszkodzeń w celu wywołania głębokiego uszkodzenia kilku miomerów ogonowych u dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia nowe podejście do badania regeneracji mięśni szkieletowych po ciężkiej utracie tkanki u kręgowców innych niż ssaki.

Model kriouszkodzeń do badania regeneracji mięśni szkieletowych szypułki ogonowej u dorosłych danio pręgowanych

Poznaj metodę analizy integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa. Technika ta umożliwia badanie dystrofii mięśniowej i rozwoju terapii.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Przeglądaj więcej filmów