Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Ogólnym celem iniekcji do żyły kardynalnej Evans Blue Dye i Fitzy Dextrin jest obserwacja integralności błony mięśni szkieletowych u żywych danio pręgowanych, aby pomóc scharakteryzować mechanizmy powodujące choroby związane z różnymi podtypami dystrofii mięśniowej. Wstrzyknięcie niebieskiego barwnika Evana może pomóc w odkryciu mechanizmów biologicznych, które przyczyniają się do patologii choroby podczas charakteryzowania modeli zwierzęcych na dystrofii mięśniowej, może również przyczynić się do zrozumienia potencjalnych mechanizmów terapeutycznych w leczeniu choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją przeprowadzić i przeanalizować przy użyciu żywego danio pręgowanego.

Dodatkowo, jednoczesne wstrzyknięcie Fitz Dextrin demonstruje kontrolę jakości dla udanego wstrzyknięcia, co poprawia rygor i kwantyfikację. Implikacje tej techniki odnoszą się do użyteczności w walidacji modeli chorób mięśni danio pręgowanego. Pogłębiają również wiedzę na temat tego, w jaki sposób niektóre mutacje prowadzą do fenotypów chorób mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co ma kluczowe znaczenie dla znalezienia metod leczenia i leków.

Aby przygotować płytki iniekcyjne agaru, zagotuj od dwóch do 3% aros w E, trzech podłożach i pozwól roztworowi lekko ostygnąć na ławce. Wlej około 35 mililitrów schłodzonego agrosu do każdego 100-milimetrowego naczynia. Następnie umieść jeden koniec preferowanej formy wtryskowej w roztworze przed ułożeniem pozostałej części formy na roztworze agro.

Pozostaw roztwór agro do zestalenia się w temperaturze pokojowej lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około 30 minut. Następnie za pomocą szpatułki oddziel jeden koniec formy od stałego agrosu i powoli usuń pozostałą część formy. Zrób 1% zapasu Evan's Blue Dye lub EBD w jednym roztworze x dzwonek.

Następnie przygotuj roztwór podstawowy dekstryny Fitzy w jednym roztworze x Ringera i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować mieszankę do wstrzykiwań, rozcieńczyć EBD do 0,1% bezpośrednio w roztworze podstawowym dekstryny Fitz, dokładnie odwirować mieszankę iniekcyjną i trzymać z dala od bezpośredniego światła, używając folii aluminiowej do owinięcia probówki przed wstrzyknięciem. Rozgrzej płytkę wtryskową do temperatury pokojowej.

Umieść mikromanipulator na metalowej płytce i stań obok mikroskopu iniekcyjnego. Włącz sterownik mikrowtrysku napędzany powietrzem. Następnie za pomocą około dwóch do czterech mikrolitrów mieszanki EBD wypełnij igłę do wstrzykiwań.

Następnie skalibruj objętość wtrysku za pomocą około pięciu nanolitrów mieszanki EBD. Następnie użyj jednego roztworu x ringera, aby zwilżyć płytkę iniekcyjną i usunąć nadmiar roztworu z dołków, wstępnie potraktować larwy 0,04% trica rozcieńczonego w jednym roztworze x ringera, aby całkowicie unieruchomić larwy przed wstrzyknięciem szklaną pipetą. Znieczulone larwy umieścić w studzienkach płytek iniekcyjnych ślimaka, upewniając się, że larwy są całkowicie w studzienkach leżących na bokach.

Usuń nadmiar roztworu trica, aby zminimalizować ruch larw w studni, ale pozostaw wystarczająco dużo, aby zapobiec odwodnieniu. Umieścić płytkę iniekcyjną z larwami na lunecie sekcyjnej i umieścić igłę do pipety iniekcyjnej zawierającą EBD. Wymieszaj larwy danio pręgowanego w pobliżu serca i około 45 stopni od przedniej tylnej osi.

Wprowadzić igłę do wstrzykiwań do wspólnej żyły kardynalnej lub CCV w pobliżu przedniej części żółtka, gdzie żyła początkowo skręca w kierunku grzbietowym. Następnie wstrzyknąć pięć nanolitrów mieszanki EBD i utrzymać igłę do wstrzykiwań na miejscu przez pięć do ośmiu sekund. Aby zminimalizować natychmiastowy wyciek mieszanki EBD, dobre wstrzyknięcie pokaże barwnik w komorach serca i można go powtórzyć.

Jeśli EB DMX nie zostanie zauważony w sercu bezpośrednio po udanym wstrzyknięciu, zarodek będzie gromadził dekstrynę Fitz w układzie naczyniowym, jak pokazano tutaj. Po wstrzyknięciu żądanej liczby larw należy umieścić larwy z powrotem w jednym roztworze dzwonka x bez trica w 100-milimetrowych szalkach, aby zwiększyć przeżywalność i utrzymać siłę sygnału. Naczynia należy przechowywać zawinięte w folię aluminiową.

Wysiaduj larwy w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza przez cztery do sześciu godzin, aby zapewnić skuteczne wchłanianie EBD. Aby uwidocznić EBD w mięśniu, użyj 0,04% trica do znieczulenia larw przed obejrzeniem larw pod czerwoną fluorescencją. EBD wstrzyknięto do CCV jednorodnych mutantów Sapia i rodzeństwa typu dzikiego w iniekcjach 3D PF, które wypełniły komory serca, jak pokazano tutaj, a następnie przeanalizowano je pod kątem udanej perfuzji matrycowej poprzez wizualizację fitzy dekstryny w układzie naczyniowym pod wpływem zielonej fluorescencji.

Po czterogodzinnym okresie inkubacji wychwyt EBD badano na poziomie roztoczy, jak pokazano na tym rysunku. Rodzeństwo typu dzikiego nie wykazywało fluorescencji EBD w obrębie widocznych włókien mięśniowych, podczas gdy homozygotyczne mutanty sapia wykazywały wychwyt EBD wskazujący na uszkodzenie błony mięśniowej. Po sprawnym wstrzyknięciu niebieskiego barwnika Evansa do wspólnej żyły kardynalnej danio pręgowanego, larwy można zakończyć w ciągu 30 do 60 minut, w zależności od liczby wstrzykiwanych larw.

Dodatkowo wyniki eksperymentalne można uzyskać w ciągu jednego dnia, aby zapewnić biegłość. Ważne jest, aby pamiętać, aby dokładnie dążyć do żyły kardynalnej, aby uzyskać spójne i możliwe do interpretacji wyniki. Może to być trudne i prawdopodobnie będzie wymagało praktyki Przestrzeganie tej procedury.

Można zastosować inne metody, takie jak chemiczne i genetyczne badania przesiewowe, w celu określenia mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za uszkodzenie błony związane z dystrofiami mięśniowymi. Eksperymenty te mogą pomóc w ustaleniu nowych strategii terapeutycznych dla choroby mięśni po jej rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad chorobami mięśni do zbadania integralności błony w modelach dystrofii mięśniowej danio pręgowanego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dokładnie zrozumieć, jak wstrzyknąć niebieski barwnik Evana do wspólnej żyły kardynalnej larw danio pręgowanego. Powinieneś także zrozumieć, jak zidentyfikować włókna mięśniowe z uszkodzeniem błony z powodu obecności niebieskiego barwnika Evana we włóknach.