Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa
30 listopada 2015
W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego. Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.
Ogólnym celem wspólnego wstrzykiwania barwnika Evans Blue oraz dekstryny Fitzy do żyły głównej jest obserwacja integralności błony mięśni szkieletowych u żywych rybek zebrafish, co pomaga w charakterystyce mechanizmów wywołujących chorobę w odniesieniu do różnych podtypów dystrofii mięśniowej. Wstrzykiwanie barwnika Evans Blue może pomóc w odkryciu mechanizmów biologicznych przyczyniających się do patologii choroby podczas charakterystyki modeli zwierzęcych dystrofii mięśniowej, a także może przyczynić się do zrozumienia potencjalnych mechanizmów terapeutycznych w leczeniu tej choroby. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej przeprowadzenia i analizy z wykorzystaniem żywych rybek zebrafish.
Dodatkowo, współiniekcja Fitz Dextrin stanowi kontrolę jakości potwierdzającą powodzenie iniekcji, co zwiększa rygorystyczność i precyzję ilościową badań. Zastosowanie tej techniki ma znaczenie dla walidacji modeli chorób mięśni u rybek zebrafish. Pozwala ona również na lepsze zrozumienie, w jaki sposób określone mutacje prowadzą do fenotypów chorób mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co jest kluczowe dla opracowania metod leczenia i terapii.
Aby przygotować agarowe płytki do iniekcji, należy zagotować 2-3% agar w pożywce E3, a następnie pozostawić roztwór do lekkiego ostygnięcia na blacie. Nalać około 35 ml ostudzonego agaru do każdej płytki o średnicy 100 mm. Następnie należy umieścić jeden koniec wybranej formy do iniekcji w roztworze, a potem położyć resztę formy na powierzchni agaru.
Pozostaw roztwór agarowy do stężenia w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez około 30 minut. Następnie za pomocą szpatułki oddziel jeden koniec formy od utwardzonego agaru i powoli usuń resztę formy. Przygotuj 1% roztwór zapasowy barwnika Evan's Blue Dye (EBD) w jednokrotnym roztworze Ringera.
Następnie należy przygotować roztwór zapasowy Fitzy Dextrin w roztworze Ringer'a 1x i przechowywać go w temperaturze -20 °C. Aby przygotować mieszaninę do iniekcji, rozcieńczyć EBD do stężenia 0,1% bezpośrednio w roztworze zapasowym Fitz Dextrin, dokładnie wymieszać mieszaninę za pomocą wortexa i chronić przed bezpośrednim światłem, owijając probówkę folią aluminiową przed wykonaniem iniekcji. Płytkę do iniekcji należy uprzednio ogrzać do temperatury pokojowej.
Umieść mikromanipulator na metalowej płytce i ustaw go obok mikroskopu do iniekcji. Włącz pneumatyczny sterownik mikroiniekcji. Następnie, używając około 2-4 µL mieszaniny EBD, wypełnij igłę do iniekcji od tyłu.
Następnie skalibruj objętość iniekcji, używając około 5 nL mieszaniny EBD. Potem użyj 1x roztworu Ringera do zwilżenia płytki do iniekcji i usuń nadmiar roztworu z dołków. Przetraktuj larwy 0,04% tricainem rozcieńczonym w 1x roztworze Ringera, aby całkowicie unieruchomić larwy przed iniekcją za pomocą szklanej pipety. Umieść znieczulone larwy w dołkach płytek do iniekcji, upewniając się, że larwy znajdują się całkowicie w dołkach i leżą na bokach.
Usunąć nadmiar roztworu trica, aby zminimalizować ruch larw w dołku, pozostawiając jednak ilość wystarczającą do zapobiegania odwodnieniu. Umieścić płytkę z larwami do iniekcji pod mikroskopem stereoskopowym i ustawić igłę pipety iniekcyjnej zawierającą EBD. Wykonać wstrzyknięcie w okolicy serca larwy danio pręgowanego, pod kątem około 45 stopni względem osi przednio-tylnej.
Wprowadź igłę do wstrzykiwania do wspólnej żyły głównej (CCV) w pobliżu przedniej części żółtka, w miejscu, gdzie żyła zaczyna skręcać w kierunku grzbietowym. Następnie wstrzyknij 5 nL mieszaniny EBD i pozostaw igłę w tej pozycji przez od 5 do 8 sekund. Aby zminimalizować natychmiastowy wyciek mieszaniny EBD, prawidłowe wstrzyknięcie powinno skutkować widocznością barwnika w komorach serca; w przeciwnym razie procedurę można powtórzyć.
Jeśli EB DMX nie jest widoczny w sercu bezpośrednio po udanym wstrzyknięciu, w układzie naczyniowym zarodka nagromadzi się Fitz Dextrin, jak pokazano tutaj. Po wstrzyknięciu odpowiedniej liczby larw, należy przenieść je do roztworu 1x Ringer bez trica w szalkach 100 mm, aby zwiększyć przeżywalność i utrzymać siłę sygnału. Szalki należy owinąć folią aluminiową.
Inkubować larwy w temperaturze 28,5 °C przez cztery do sześciu godzin, aby zapewnić wydajne pobieranie EBD. Aby zwizualizować EBD w mięśniach, należy zastosować 0,04% trica w celu znieczulenia larw przed ich obserwacją w czerwonej fluorescencji. EBD wstrzyknięto do CCV mutantów homogenicznych Sapia oraz rodzeństwa typu dzikiego w 3D PF; wstrzyknięcia wypełniły komory serca, jak pokazano tutaj, a następnie przeanalizowano skuteczność perfuzji barwnika poprzez wizualizację fitzy dextrin w naczyniach krwionośnych w zielonej fluorescencji.
Po czterogodzinnym okresie inkubacji zbadano pobieranie EBD na poziomie pojedynczych ryb, co przedstawiono na tej rycinie. Rodzeństwo typu dzikiego nie wykazywało fluorescencji EBD w żadnych widocznych włóknach mięśniowych, podczas gdy mutanty homozygotic sapia wykazywały pobieranie EBD, co wskazywało na uszkodzenie błony mięśniowej. Po opanowaniu techniki wstrzykiwania barwnika błękitu Evansa do wspólnej żyły głównej danio pręgowanego, procedura u larw może zostać zakończona w ciągu 30 do 60 minut, w zależności od liczby wstrzykiwanych larw.
Dodatkowo, w celu zapewnienia biegłości, wyniki eksperymentalne można uzyskać w ciągu jednego dnia. Należy pamiętać o precyzyjnym celowaniu w żyłę główną, aby uzyskać spójne i interpretowalne wyniki. Może to być trudne i prawdopodobnie będzie wymagało praktyki po zapoznaniu się z tą procedurą.
W celu ustalenia mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za uszkodzenia błony związane z dystrofiami mięśniowymi można przeprowadzić inne metody, takie jak przesiewy chemiczne i genetyczne. Eksperymenty te mogą pomóc w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych w chorobach mięśni. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie chorób mięśni do badania integralności błon w modelach dystrofii mięśniowej u rybek danio pręgowanych.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wstrzyknąć barwnik błękit Evansa do wspólnej żyły głównej larw zebrafish. Powinni Państwo również wiedzieć, jak zidentyfikować włókna mięśniowe z uszkodzeniem błony komórkowej na podstawie obecności barwnika błękit Evansa wewnątrz włókien.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę przeprowadzania analizy z użyciem barwnika Evans Blue Dye (EBD) u larw zebrafish, co jest niezbędne do oceny integralności mięśni szkieletowych. Technika ta pomaga w charakteryzacji modeli dystrofii mięśniowej oraz opracowywaniu nowych metod terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia mięśni
- Rozwój terapii
Wprowadzenie
- Barwnik Evans Blue służy do oceny integralności błony mięśniowej.
- Modele rybek zebrafish są cenne w badaniach nad dystrofią mięśniową.
- Technika ta umożliwia obserwację mechanizmów biologicznych in vivo.
- Współwstrzyknięcie dekstryny Fitz służy jako środek kontroli jakości.
Cel badania
- Obserwacja integralności błony mięśni szkieletowych u rybek zebrafish.
- Charakterystyka mechanizmów chorobowych związanych z dystrofią mięśniową.
- Pogłębienie wiedzy na temat potencjalnych strategii terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Wstrzykiwanie EBD do wspólnej żyły głównej larw danio-ostrasek.
- Przygotowanie agarowych płytek do wstrzykiwania oraz roztworów EBD.
- Użycie tricyny do unieruchomienia larw podczas wstrzykiwania.
- Wizualizacja poboru EBD przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
Główne wyniki
- Pomyślne wstrzyknięcie EBD potwierdzono za pomocą fluorescencji w komorach serca.
- Mutanty homozygotyczne Sapia wykazały pobieranie EBD, co wskazuje na uszkodzenie błony mięśniowej.
- Rodzeństwo typu dzikiego nie wykazywało fluorescencji EBD w włóknach mięśniowych.
- Technika ta umożliwia szybką analizę wielu larw w ciągu jednego dnia.
Wnioski
- Metoda wstrzykiwania EBD jest skuteczna w badaniu integralności mięśni u rybek zebrafish.
- Technika ta może ułatwić badania nad dystrofią mięśniową oraz potencjalnymi metodami leczenia.
- Dalsze badania mogą służyć do analizy molekularnych mechanizmów chorób mięśni.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ocena integralności błony mięśni szkieletowych jest kluczowa dla walidacji modeli zaburzeń nerwowo-mięśniowych u rybek zebrafish oraz minimalizacji ryzyka w procesie walidacji celów w badaniach nad dystrofią mięśniową. Technika wstrzykiwania barwnika Evans Blue (EBD) umożliwia ilościową ocenę uszkodzeń błony w organizmach żywych, co wspiera analizę mechanistyczną i zwiększa wiarygodność prognostyczną modeli przedklinicznych. Podejście to poprawia ciągłość translacyjną, zapewniając powtarzalny i skalowalny odczyt do przesiewu terapeutycznego oraz dopasowania biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację uszkodzeń błony mięśniowej w żywych modelach rybek danio (*zebrafish*) z chorobami nerwowo-mięśniowymi.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki bezpośredniej obserwacji poboru barwnika Evans Blue jako biomarkera integralności błon.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez rozróżnianie fenotypów typu dzikiego od mutantów na podstawie fluorescencji EBD w mięśniach szkieletowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną metodę przygotowania zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszego screeningu związków.
- Wynik ilościowy: Generuje odczyty oparte na fluorescencji, które umożliwiają wiarygodne porównanie integralności błon w różnych warunkach doświadczalnych.
- Skalowalność: Pozwala na szybką analizę wielu larw w ciągu jednego dnia, wspierając przepływy pracy w screeningu o średniej wydajności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Bezpośrednio modeluje fenotypy dystrofii mięśniowej poprzez wykrywanie poboru EBD w mutantach homozygotycznych sapia, co odzwierciedla mechanizmy choroby u ludzi.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, zapewniając spójną miarę integralności błon w różnych systemach modelowych.
- Postęp w ujęciu analizy ryzyka: Wspiera decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) poprzez ilościowe określenie terapeutycznego ratowania mięśni przed uszkodzeniem w przesiewach genetycznych lub chemicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda iniekcji EBD wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, oferując test na żywych komórkach do mechanistycznej oceny ryzyka oraz przesiewu terapeutycznego w programach badawczych nad chorobami nerwowo-mięśniowymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez powiązanie mutacji genetycznych z obserwowalnymi defektami błony mięśniowej.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację i powtarzalność analizy dzięki współwstrzyknięciu dekstryny Fitza jako kontroli jakości skuteczności dostarczenia.
- Analityka: Dostarcza ilościowe pomiary fluorescencji, które pozwalają zespołom porównywać pobór EBD pomiędzy larwami typu dzikiego a mutantami.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez walidację modeli z ryb zebrafish, które odtwarzają patologię ludzkich chorób mięśni.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody oceny integralności błony w wielu modelach chorób nerwowo-mięśniowych i kampaniach przesiewowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w modelach chorób mięśni.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje standaryzację i powtarzalność dzięki kontrolowanym parametrom wstrzykiwania oraz kontrolom współwstrzykiwania jakościowego.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o odczyty integralności błony.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów terapeutycznych z uwzględnieniem ryzyka poprzez obiektywną, ilościową ocenę uszkodzeń mięśni.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z danio pręgowanym, mikroiniekcji oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależne od mikrofluidycznych systemów iniekcyjnych oraz infrastruktury obrazowania fluorescencyjnego.
- Wymaga standaryzacji objętości iniekcji, czasu inkubacji oraz protokołów znieczulenia pomiędzy zespołami.
- Przy porównywaniu wyników należy uwzględnić zmienność szczepów larwalnych, stadium rozwoju oraz tło genetyczne.
- Metoda ograniczona do wykrywania przepuszczalności błon; do dalszych analiz patologicznych niezbędne są uzupełniające testy.
Często zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Preparation of Agar Injection Plates and Evans Blue Dye Injection Mix
2:42
Evans Blue Dye Injection Preparation
3:54
Pericardial Injection and Uptake of Evans Blue Dye in Zebrafish Larvae
5:29
Results: Skeletal Muscle Analysis in Zebrafish Larvae Using Evans Blue Dye
6:14
Conclusion
