Badanie stechiometrii receptora naskórkowego czynnika wzrostu w nienaruszonych komórkach przy użyciu mikroskopii korelacyjnej

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wizualizacja rozkładu i stechiometrii receptorów nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) w błonie plazmatycznej nienaruszonych i uwodnionych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez uprawę komórek wykazujących ekspresję EGFR, takich jak cos7, na mikrochipach z 50 nanometrową cienką membraną z azotku krzemu rozciągniętą nad centralnie położonym obszarem okna. Następnie komórki inkubuje się z biotynilowaną wersją nabłonkowego czynnika wzrostu, który wiąże się z receptorem i zmienia konformację EGFR, prowadząc do dimeryzacji i aktywacji.

Następnie komórki są utrwalane w celu unieruchomienia receptorów i inkubowane z odstripowanymi kropkami kwantowymi sprzężonymi z Hagenem, które wiążą się z receptorami aktywowanymi przez EGF, a następnie wykonuje się obrazowanie komórek. Na koniec drugie utrwalenie glutaraldehydem sieciuje odstripowany habit w sprzężonych kropkach kwantowych z EGFR i stabilizuje próbkę do mikroskopii elektronowej. Wyniki pokazują emisję czerwonej fluorescencji poprzez obrazowanie fluorescencyjne kropek kwantowych oraz rozkład EGFR i jego stan stechiometryczny lub klastrowanie za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Ta metoda dostarcza unikalnych informacji o geometrii i rozmieszczeniu receptorów błonowych w nienaruszonych komórkach i może być wykorzystana do uzyskania wglądu w aktywację receptora epidermalnego czynnika wzrostu w komórkach prawidłowych oraz nowotworowych. Można ją również zastosować do badania innych receptorów błonowych, takich jak kanały jonowe. Rozpocząć pracę, operując pod wyciągiem chemicznym. W pierwszych krokach przygotowania mikrochipów z membrany z azotku krzemu, po zanurzeniu w acetonie zgodnie z protokołem tekstowym, przenieść mikrochipy bezpośrednio do zlewki z etanolem i odczekać dwie minuty, następnie wyjąć chipy z etanolu i położyć je na chusteczce do czystych pomieszczeń.

Po wyschnięciu chipów przenieś je na szkiełko przedmiotowe, które uprzednio umieszczono w szalce Petriego. Następnie przykryj szalkę pokrywką. W kolejnym kroku umieść szkiełko z mikrochipami w czyszczarce plazmowej.

Uruchom pięciominutowy standardowy program czyszczenia, aby powierzchnia membrany z azotku krzemu stała się hydrofilowa. Następnie, pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, przenieś mikroczipy ze szkła. Przesuń je na chusteczkę do czystych pomieszczeń, a następnie umieść w studzience płytki 24-dołkowej wypełnionej roztworem poli-L-lizyny (PLL) i inkubuj przez pięć minut.

Następnie, jeden po drugim, przenieś mikroczipy do drugiej studni zawierającej wodę klasy HPLC, a następnie wypłucz je w drugiej studni z wodą. Na koniec umieść mikroczipy pojedynczo w studniach płytki 96-dołkowej wypełnionych medium DM i wstaw płytkę do inkubatora z dwutlenkiem węgla, wykorzystując subkulturę siedmiu komórek COS. Przygotuj monodyspersyjną zawiesinę komórek o stężeniu około 5 × 10⁷.

Pięć komórek na mililitr. Dodaj jedną kroplę zawiesiny komórkowej do każdego mikrochipu na płytce 96-dołkowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut pod mikroskopem odwróconym. Rozpocznij badanie obszarów mikrochipów, aby uzyskać przybliżone zagęszczenie od 20 do 30 komórek na pole widzenia o wymiarach 150 by 400 mikrometrów.

Po odpowiednim przytwierdzeniu się komórek, ostrożnie przenieś mikroczipy z warstwą komórek skierowaną do góry do nowych studzienek zawierających dm. Gdy wystarczająca liczba komórek pozostanie przytwierdzona, przenieś mikroczipy z komórkami skierowanymi do góry do nowych studzienek zawierających serum free dmm. Następnie inkubuj mikroczipy w temperaturze 37 °C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla przez kilka godzin lub przez noc przed kolejnymi etapami.

Używając płytki 96-dołkowej, napełnić dołki odpowiednimi roztworami, przypisując jeden wiersz lub kolumnę do każdego mikrochipu. Przepłukać mikrochipy, umieszczając je w dołku ze świeżym roztworem B-S-A-G-E-L-P-B-S, i inkubować w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Przenieść mikrochipy do roztworu 300 nM biotynowanego EGF i ponownie umieścić je w inkubatorze na trzy minuty, aby komórki rozpoczęły endocytozę znakowanego EGF do EGFR.

Szybko przemyj mikroczipy trzy razy, używając PBS. Następnie przemyj próbki, stosując 0,1 molarny bufor cate lub CB. W kolejnym kroku przenieś mikroczipy do 3% PFA i inkubuj przez 10 minut.

Po jednorazowym płukaniu w CB i trzykrotnym płukaniu w PBS, przenieś chipy do G-L-Y-P-B-S i inkubuj przez dwie minuty. Następnie wypłucz je dwukrotnie za pomocą PBS. Teraz umieść mikrochipy w 10 nM S-T-R-Q-D na 10 minut, a następnie wypłucz cztery razy w B-S-A-P-B-S.

Następnie zanurz jeden mikrochip w szalku o dnie szklanym o średnicy 35 milimetrów, uprzednio napełnionym B-S-A-P-B-S o temperaturze pokojowej, aby obrazować komórki za pomocą mikroskopii DIC i fluorescencyjnej. Do wykonania obrazów ogólnych komórek znakowanych QD 6 55 użyj obiektywu powietrznego 40 x. Użyj kostki filtru, która wzbudza kropki kwantowe w zakresie od 340 do 380 nanometrów z emisją powyżej 420 nanometrów.

Zminimalizuj natężenie światła, aby uniknąć zbyt intensywnego oświetlenia, które mogłoby uszkodzić próbkę. Ustaw czas ekspozycji na co najmniej 300 milisekund, aby zarejestrować sygnały wszystkich qds, ponieważ fluorescencja QD migocze; dostosuj natężenie światła i wzmocnienie tak, aby uzyskać jasne obrazy bez widocznego szumu, zachowując jednocześnie minimalne natężenie światła. Po wykonaniu obrazowania umieść mikrochip z powrotem w płytce 96-dołkowej z B-S-A-P-B-S.

Przepłucz raz w cb, następnie przenieś do 2% glutaraldehydu i inkubuj przez kolejne 10 minut. Przemyj i użyj B-S-A-P-B-S, aby trzykrotnie przemyć mikrochip, a następnie przechowuj w wypełnionych B-S-A-P-B-S studzienkach nowej płytki 96-dołkowej dla każdego mikrochipa. Wypełnij rząd czterech studzienek wodą klasy HPLC.

Po skonfigurowaniu ESEM zgodnie z protokołem tekstowym, wprowadź próbkę do stopnia pre-COOL ESEM STEM, wyjmując płytkę 96 WAT z pojemnika chłodzącego i umieszczając ją blisko otwartego stopnia ESEM. Obok niej połóż chusteczkę do czystych pomieszczeń. Szybko wypłucz mikrochip, zanurzając go cztery razy na sekundę w dołku wypełnionym wodą klasy HPLC.

Krótko osusz tył mikrochipu za pomocą chusteczki i umieść go na wstępnie schłodzonym stoliku, dodając 3 µL schłodzonej wody klasy HPLC. Zwilż powierzchnię próbki i przymocuj ją do stolika. Następnie nanieś na stolik, w pobliżu próbki, trzy dodatkowe krople wody po 3 µL każda i zamknij komorę na preparat.

Po zidentyfikowaniu interesującej komórki, zgodnie z protokołem tekstowym, należy zarejestrować obraz ogólny komórki w technice STEM, przejść do obszaru peryferyjnego komórki, w którym widoczna jest jej krawędź, a następnie zwiększyć powiększenie do 50 000 X. Należy zarejestrować obrazy przedstawiające pojedyncze kropki kwantowe (QD), stosując czas przebywania piksela od 20 do 30 mikrosekund; pokazano tutaj membranowe EGFR znakowane QD 655 w nienaruszonych, w pełni hydratyzowanych komórkach COS-7. Obraz DIC przedstawia topografię błony komórkowej, a odpowiadający mu obraz fluorescencyjny pokazuje rozkład EGFR na całej powierzchni komórki po trzech minutach inkubacji z biotyną EGF.

Te obrazy ESEM STEM o niskim powiększeniu ukazują drobne struktury, takie jak filopodia rozciągające się z komórki w stronę sąsiednich komórek, oraz niektóre struktury wewnątrz cieńszych obszarów komórki. Grube, centralne obszary komórkowe, w tym jądro, wydają się białe, ponieważ transmisja przez próbkę nie jest możliwa dla elektronów o zastosowanej energii. Wysoka rozdzielczość.

Obrazy ESEM STEM cieńszych obszarów peryferyjnych pokazują etykiety QD na fałdzie błony przekraczającej obraz po przekątnej. Ta struktura błonowa wykazuje w kilku miejscach wyższą gęstość EGFR niż otaczające obszary błony, przy czym dwie etykiety znajdowały się w bliskim sąsiedztwie. Dwa przykłady z odległościami 20 i 24 nanometrów zostały zaznaczone grotami strzałek.

Te pary etykiet są interpretowane jako należące do domen EGF. Obraz ten został zarejestrowany w obszarze o niższej gęstości EGFR i słabszym sygnale fluorescencyjnym. Niemniej jednak, EGFR znaleziono tutaj również w formie dimerów, a obecne były dwa skupiska zawierające po 10 lub 11 EEG.

Po opanowaniu metody przygotowanie próbki może zająć mniej niż dwie godziny, co jest znacznie szybsze niż w przypadku powszechnie stosowanych technik mikroskopii elektronowej. Następnie obrazowanie essem STEM pozwala na uzyskanie do 100 obrazów o wysokiej rozdzielczości w ciągu pół dnia.