Name: Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj automatyczną ekstrakcję DNA z próbek FFPE i detekcję mutacji BRAF V600E metodą cyfrowej reakcji kropelkowej PCR. Ta technika umożliwia wykrywanie rzadkich mutacji w badaniach onkologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Program Badawczo-Rozwojowy dla Society of the National Research Foundation (NRF), finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (Grant nr 2013M3C8A1075908).

1. Ekstrakcja DNA z referencyjnych linii komórkowych FFPE
Uwaga: Dla tej procedury, ekstrakcja DNA została przeprowadzona z referencyjnych standardowych linii komórkowych FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 i typu dzikiego (WT)) przy użyciu zestawu do izolacji FFPE Tissue DNA, jak opisano w poniższym protokole. Zautomatyzowana ekstrakcja DNA została osiągnięta dzięki postępowaniu zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi całkowitej izolacji DNA.
<ol>
	<li>Używając mikrotomu i oryginalnego bloku FFPE, ręcznie przygotuj świeże skrawki przed ekstrakcją i analizą DNA, zgodnie z ustalonymi procedurami. Należy upewnić się, że próbka wejściowa dla analizowanego odcinka lub odcinków tkanki nie przekracza łącznej całkowitej grubości 10 μm oraz aby powierzchnia nie przekraczała 600mm2 dla pojedynczego przekroju.</li>
</ol>
1.2 Protokół TPS
Uwaga: Objętości podane w Tabeli 1 odpowiadają minimalnemu wymaganemu do przetworzenia 48 próbek, a przedstawiona procedura jest zgodna z wytycznymi TPS. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy umieścić próbki FFPE w e-tubie przez odwirowanie przy 600 x g, aby uniknąć utraty próbek podczas automatycznego programu.
<ol>
	<li>Włącz automatyczny instrument do izolacji DNA i komputer. Otwórz oprogramowanie sterujące uruchamianiem i włóż tacę z automatycznym ładowaniem do obszaru załadunku pokładu TPS.</li>
	<li>Dozować odczynniki do odpowiednich koryt, jak pokazano na rysunku 1.
	<ol>
		<li>Umieść 4 próbki (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% i 1%) w stojakach na próbki.</li>
		<li>Umieść pojemniki na końcówki w korytach w kolumnach 2 i 3 i sprawdź, czy w końcówkach nie ma więcej niż jednego filtra na końcówkę, co spowoduje przerwanie biegu.</li>
		<li>Zapewnić prawidłowe wymieszanie buforu do lizy i buforu do płukania, odwracając je 3–5 razy i załadować do odpowiednich koryt w kolumnie 4 ( Rysunek 1).</li>
		<li>Po kilkukrotnym odwróceniu lub łagodnym wirowaniu załaduj bufor elucyjny, kulki magnetyczne i bufor FFPE do małych rynien w kolumnie 5, pozostawiając 1 szczelinę pustą w miejscu wskazanym (Rysunek 1, Tabela 1).</li>
		<li>Załadować płytkę o głębokości 2 ml (DWP) na nośnik płytki (Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed rozpoczęciem przebiegu wykonaj następujące końcowe kroki:
	<ol>
		<li>Odkręć wszystkie probówki i koryta z odczynnikami. Upewnij się, że w butelce na odpady płynne dostępna jest wystarczająca pojemność. Upewnij się, że butelka na odpady stałe jest pusta i wyłożona torbą na zagrożenie biologiczne. Upewnij się, że płyta wyrzutnika końcówki jest wyśrodkowana w zespole odpływowym.</li>
		<li>Zamknij przednią pokrywę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie. Otwórz plik NA_Prep_Main_MLSTARlet.med.</li>
	<li>Kliknij "Start". Stan urządzenia zmieni się z bezczynnego na uruchomiony.</li>
	<li>Wprowadź liczbę próbek dla tego przebiegu. Wybierz żądaną metodę dla tego przebiegu (DNA = 0). Wprowadź pozycję pierwszej końcówki o dużej głośności, wybierając "1", jeśli wszystkie tace są pełne. Wprowadź pozycję pierwszej końcówki o standardowej objętości, wybierając "1", jeśli wszystkie tace są pełne. 
	Uwaga: Urządzenie będzie wtedy działać przez zautomatyzowane kroki bez interwencji użytkownika. Szczegółowy przepływ pracy przedstawiono na rysunku 2. Po zakończeniu eksperymentu odpady odczynników i końcówki są wstrzykiwane do zespołu odpadów.</li>
	<li>Ilościowe określenie oczyszczonego genomowego DNA przy użyciu metody fluorometrycznej. 
	Uwaga: Próbki DNA, które zawierają minimalne stężenie 3,3 ng/μl, poddaje się analizie ddPCR (sekcja 2).</li>
</ol>
2. Profilowanie mutacji DNA: Protokół ddPCR
Uwaga: Protokół profilowania mutacji DNA składa się z 3 głównych kroków:1) Wytwarzanie kropel, 2) konwencjonalna amplifikacja PCR, 3) odczyt kropelek i 4) profilowanie mutacji DNA.
2.1. Generowanie kropel
Uwaga: ddPCR supermix jest zalecany do ddPCR, ponieważ ta mieszanka zawiera odczynniki niezbędne do generowania kropel.
<ol>
	<li>Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy przestrzegać standardowych środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, używanie czystego kaptura do PCR, czystych pipet i probówek o niskiej zawartości białka.</li>
	<li>Upewnij się, że minimalne stężenie próbki ludzkiego genomowego DNA wynosi 3,3 ng/μl. Uwaga: Stężenie próbki oczyszczonego DNA będzie się różnić w zależności od analizy wykrywania % częstotliwości mutacji.</li>
	<li>Zebrać mieszaniny reakcyjne na 96-dołkowych płytkach PCR. Rozmrozić i zrównoważyć składniki reakcji z RT. Przygotować reakcje PCR, łącząc 2X ddPCR supermix (10 μl) i 20 starterów (do przodu i do tyłu, 900 nM) i sondę (250 nM) z każdą oczyszczoną próbką DNA (66 ng/2 μl) uzupełnić do 20 μl wodą destylowaną (zgodnie z protokołem generatora kropel)</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj mieszankę, aby zapewnić jednorodność i krótko odwiruj, aby zebrać zawartość na dnie probówki przed dozowaniem. Załaduj 20 μl na wkład w celu utworzenia kropel.</li>
	<li>Działanie generatora kropel, zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta
	<ol>
		<li>Włóż wkład do uchwytu z wycięciem we wkładzie umieszczonym w lewym górnym rogu uchwytu. Dodać 20 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej próbki do środka i 70 μl oleju generatorowego do studzienek dennych.</li>
		<li>Przymocuj uszczelkę w poprzek górnej części wkładu. Upewnij się, że uszczelka jest bezpiecznie zaczepiona na obu końcach uchwytu; W przeciwnym razie nie zostanie osiągnięte ciśnienie wystarczające do wytworzenia kropel.</li>
		<li>Otwórz generator kropel, naciskając zielony przycisk na górze przyrządu i włóż wkład. Gdy uchwyt znajduje się we właściwej pozycji, zarówno kontrolka zasilania (po lewej, po prawej), jak i uchwytu (po środku) świecą na zielono.</li>
		<li>Ponownie naciśnij górny przycisk na instrumencie, aby zamknąć drzwi i zainicjować wytwarzanie kropel. Uwaga: Po naciśnięciu przycisku kolektor ustawia się nad studzienkami wylotowymi, zasysając olej i próbki przez kanały mikroprzepływowe, w których powstają kropelki. Kropelki wpływają do studni kropelkowej, gdzie się gromadzą. Kontrolka kropli (po prawej) na zielono po 10 sekundach, wskazując, że trwa wytwarzanie kropli.</li>
		<li>Po zakończeniu generowania kropel wszystkie 3 kontrolki zmienią kolor na ciągły zielony; otwórz drzwi, naciskając przycisk i wyjmij uchwyt z urządzenia. Wyjmij jednorazową uszczelkę z uchwytu i wyrzuć ją. Uwaga: Górne studzienki wkładu zawierają kropelki, a środkowa i dolna studzienka są prawie puste, z niewielką ilością resztek oleju.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.2. Przygotowanie do PCR
<ol>
	<li>Dla każdej próbki odpipetować 40 μl zawartości kropel z górnej studzienki wkładów do pojedynczego dołka zalecanej 96-dołkowej płytki PCR, jak wskazano w protokole przyrządów producenta. Uwaga: Użycie pipety wielokanałowej jest idealne do przenoszenia emulsji kropelkowych. Zaleca się powolne i delikatne zasysanie kropel, aby zminimalizować ścinanie kropel podczas przenoszenia.</li>
	<li>Natychmiast po przeniesieniu kropel należy uszczelnić płytkę do PCR folią, aby uniknąć parowania. Używaj przebijalnych uszczelek z płytek foliowych, które są kompatybilne ze zgrzewarką do płytek PCR i igłami w czytniku kropelkowym. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi zgrzewarki do płytek PCR.</li>
	<li>Ustaw temperaturę zgrzewarki do płyt na 180 °C, a czas na 5 sekund.</li>
	<li>Dotknij strzałki, aby otworzyć drzwiczki tacy. Umieść blok nośny na tacy stroną z 96 dołkami skierowaną do góry. Umieść 96-dołkową płytkę na bloku nośnym i upewnij się, że wszystkie dołki płytkowe są wyrównane z blokiem nośnym.</li>
	<li>Przykryj płytkę 96-dołkową 1 arkuszem przebijalnej uszczelki foliowej. Po zamocowaniu płytki 96-dołkowej na bloku nośnym i przykryciu przebijalną uszczelką foliową, dotknij przycisku uszczelki. Taca zamknie się i rozpocznie się zgrzewanie.</li>
	<li>Po zakończeniu zgrzewania drzwi otwierają się automatycznie; wyjmij płytkę z bloku grzewczego w celu cyklicznych cykli termicznych, a następnie wyjmij blok grzewczy.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie dołki w płycie są uszczelnione, sprawdzając, czy wgłębienia w folii są łatwo widoczne nad każdym dołkiem. Po uszczelnieniu płytka jest gotowa do cykli termicznych.</li>
	<li>Po usunięciu kropelek naciśnij zatrzaski na uchwycie wkładu, aby go otworzyć. Wyjmij pusty wkład i wyrzuć go.</li>
	<li>Przeprowadzić konwencjonalną amplifikację PCR, postępując zgodnie z parametrami wyszczególnionymi w Tabeli 2.</li>
</ol>
2.3 Odczyt kropel (zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta)
Uwaga: Po amplifikacji PCR docelowego kwasu nukleinowego w kropelkach, czytnik kropelek analizuje każdą kroplę indywidualnie za pomocą dwukolorowego systemu detekcji13. Zazwyczaj ustawiamy się na wykrywanie fluoroforów reporterowych FAM i VIC.
<ol>
	<li>Kliknij "System spłukiwania", aby zalać czytnik kropel i przygotować go do analizy ddPCR.</li>
	<li>Załaduj płytkę do czytnika kropel i kliknij "start". Czytnik kropel zasysa każdą próbkę, izoluje kropelki i przesyła je strumieniowo w jednym pliku przez detektor 2-kolorowy. Detektor odczytuje kropelki w celu zliczenia próbek dodatnich i ujemnych.</li>
	<li>Po zakończeniu odczytu kropel otwórz drzwi i wyjmij uchwyt płytki z urządzenia. Wyjąć 96-dołkową płytkę do PCR z uchwytu i wyrzucić ją.</li>
	<li>W celu prawidłowej konserwacji wymień olej w czytniku kropel i w razie potrzeby opróżnij pojemnik na odpady. Dodaj 50 ml 10% wybielacza do butelki na odpady, aby zapobiec rozwojowi drobnoustrojów.</li>
</ol>
2.4 Profilowanie mutacji DNA (zgodnie z zalecanym przez producenta protokołem)
Uwaga: Kropelki PCR-dodatnie i PCR-ujemne są liczone w celu zapewnienia bezwzględnej kwantyfikacji docelowych mutacji DNA BRAF V600E w formie cyfrowej, przy użyciu oprogramowania do analizy danych.
<ol>
	<li>Kliknij przycisk Konfiguracja, aby wprowadzić informacje o próbkach, testach i eksperymentach.</li>
	<li>W oknie Ustawienia załaduj tabliczkę (nazwa_pliku.qlp), a następnie kliknij przycisk Analizuj, aby otworzyć i przeanalizować dane. Interfejs analizy danych jest podzielony na trzy okna: Tabela wyników, Selektor studni i Przetworzone dane/Wyświetlacz graficzny.</li>
	<li>W oknie Dane przetworzone dane dotyczące stężeń dla każdego celu pojawiają się w studzienkach na mapie płytowej i są zestawione w tabeli wyników. Kliknij przycisk Koncentracja, aby wyświetlić dane na wykresach stężeń.</li>
</ol>

<ol><li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li>
<li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li>
<li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras%2FRaf%2F+MEK%2FERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+patents+on+anti-cancer+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li>
<li>Brose, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+and+RAS+mutations+in+human+lung+cancer+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.</a> Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutations+in+colon+cancer+are+not+likely+attributable+to+defective+DNA+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair.</a> Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li>
<li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline%2C+%27definetherain%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological+methods%22%5BJournal%5D)">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li>
<li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943(2013).</li>
<li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li>
<li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+using+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li>
<li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li>
<li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+detection+and+quantification%22%5BJournal%5D)">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li>
<li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li>
<li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li>
<li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li>
</ol>

Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim i Young Deug Kim są pracownikami ABION CRO.

W tym miejscu podkreślamy możliwość zastosowania ddPCR i izolacji DNA z referencyjnych próbek wzorcowej linii komórkowej FFPE do oceny specyficznej mutacji genowej. W tym badaniu zastosowano metodę automatycznej izolacji DNA TPS, którą można łatwo dostosować, zautomatyzować i może pomieścić do 48 różnych próbek jednocześnie, co pozwala na eksperymenty na większą skalę i mniejszą zmienność. Jednym z ograniczeń izolacji DNA w niniejszej pracy jest to, że każda próbka FFPE jest unikalna i będzie się różnić pod względem zani...

Nagromadzenie mutacji genetycznych w kluczowych genach regulatorowych zmienia normalne programowanie komórek, takie jak proliferacja, różnicowanie i przeżywanie komórek, prowadząc do raka1. Szlak kinazy RAS-RAF-MAP pośredniczy w odpowiedziach komórkowych na sygnały wzrostu. Onkogenne mutacje BRAF mogą wynikać z mutacji sterujących w genie BRAF, które mogą powodować nadaktywność onkoproteiny BRAF2. Mutacje w genie BRAF powodują również nadaktywną sygnalizację za pośrednictwem MEK i ERK3, co z kolei prowadzi do nadmiernego wzrostu i proliferacji komórek niezależnie od regulacji za pośrednictwem czynnika wzrostu4-6.
Dostępnych jest kilka narzędzi do profilowania mutacji DNA, takich jak ilościowe mutacje BRAF V600E w czasie rzeczywistym w standardowych liniach komórkowych opartych na formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) za pomocą ddPCR. ddPCR to metoda bezwzględnej kwantyfikacji oparta na PCR, oferująca wyższą dokładność w porównaniu do konwencjonalnego ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)7,8. ddPCR zapewnia również wyższą zdolność rozdzielczą i dokładność wykrywania rzadkich mutacji w matrycach DNA, umożliwiając bardziej pouczające badania i diagnozowanie nowotworów9. Dodatkowe zalety ddPCR w porównaniu z konwencjonalnym qPCR obejmują jego zwiększoną czułość i dokładność podczas badania niskiej liczby kopii matryc10-12. W niniejszym artykule przedstawiono protokół automatycznej ekstrakcji DNA ze standardowych linii komórkowych odniesienia FFPE, a następnie określania obecności lub braku mutacji BRAF V600E za pomocą ddPCR. Opisano również wykorzystanie oprogramowania do analizy danych oraz graficzne przedstawienie wyników. Cała procedura jest stosunkowo prosta i całkowicie zależy od liczby próbek do profilowania oraz liczby dostępnych konwencjonalnych maszyn do PCR i ddPCR.
Poniższy protokół opisuje standardowe procedury dla standardowych linii komórkowych BRAF V600E-dodatnich FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 i typu dzikiego (WT)) są wykonywane w pełni zautomatyzowanym urządzeniu przy użyciu protokołu Tissue Preparation System (TPS). Następnie wyizolowane próbki DNA są analizowane pod kątem obecności mutacji BRAF V600E za pomocą systemu ddPCR. Celowana analiza mutacji jest wykonywana po profilowaniu wszystkich próbek i załadowaniu danych do oprogramowania do analizy danych. W zależności od liczby badanych próbek/grup, analiza danych może trwać od jednej do kilku godzin. Eksperymentalny komponent metodologii wymaga dokładności w obsłudze <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Izolowanie kwasów nukleinowych od drożdży, film JoVE Science Education wyjaśniający więcej na temat kontekstu RNA">DNA</a> i <a href="http://www.jove.com/science-education/5034/introduction-to-serological-pipettes-and-pipettors" title="Wprowadzenie do pipet serologicznych i Pipettors, film JoVE Science Education wyjaśniający więcej na temat kontekstu pipetowania>pipetowania</a> do płytek 96-dołkowych, podczas gdy analiza danych odbywa się za pomocą oprogramowania.

<table><tbody><tr><td>Instrument Hamilton MICROLAB STARlet IVD</td><td>Siemens</td><td>10701001</td><td>Automatyczny instrument do izolacji DNA</td></tr><tr><td>Generator kropel QX200&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>772BR1119</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Czytnik kropel</td><td>Bio-Rad</td><td>771BR1497</td><td></td></tr><tr><td>Konwencjonalna maszyna do PCR z regulacją</td><td></td> w czasie narastania <td>621BR17718</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka do płytek PCR PX1</td><td>Bio-Rad</td><td>770BR1575</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie QuantaSoft</td> Zestaw do izolacji DNA <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Odczynniki do preparatyki tkanek Pudełko 1&nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632398</td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Odczynniki do przygotowania tkanek Pudełko 1&nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632399</td><td></td></tr><tr><td>CO-RE Końcówki</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR analiza</td><td></td><td></td><td></td>mutacji</tr><tr><td>ddPCR Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3010</td> Wkład DG8 <td>o stężeniu 2X</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-4008</td><td></td></tr><tr><td>Generator kropelek</td><td>oleju Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3006</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik kropelek</td><td>oleju Bio-Rad&nbsp;</td><td>Zobacz materiał BR-186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej pcr do wykrywania mutacji braf v600e w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR to bardzo czuła metoda PCR, która wykorzystuje system emulsji wodno-olejowej. Za pomocą generatora kropelek wyekstrahowana próbka kwasu nukleinowego jest dzielona na ~ 20 000 nanorozmiarowych kropelek wody w oleju, a amplifikacja PCR następuje w pojedynczych kropelkach. Podejście ddPCR polega na identyfikacji mutacji sekwencji, zmianach liczby kopii i wybranych rearanżacjach strukturalnych obejmujących docelowe geny. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie ddPCR jako potężnej techniki precyzyjnego ilościowego oznaczania rzadkich mutacji BRAF V600E w standardowych liniach komórkowych FFPE, co jest pomocne w identyfikacji osób z rakiem. Podsumowując, technika ddPCR oferuje potencjał do precyzyjnego profilowania specyficznych rzadkich mutacji w różnych genach w różnych typach próbek FFPE.

W naszej analizie ddPCR zbadaliśmy linie komórkowe standardów referencyjnych FFPE z mutacją BRAF V600E. Czytnik kropelek jest podłączony do laptopa z zainstalowanym oprogramowaniem do analizy danych. Każda pojedyncza kropelka jest definiowana na podstawie amplitudy fluorescencji jako dodatnia lub ujemna. Oprogramowanie dostarczone przez producenta pozwala również na wprowadzenie zdefiniowanego przez użytkownika punktu odcięcia w celu określenia progu między kropelkami dodatnimi a ujemnymi. Liczbę kropelek dodatn...

Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wyizolowanie ludzkiego genomowego DNA z referencyjnych linii komórkowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) przy użyciu systemu do przygotowania tkanek, a następnie analiza mutacji BRAF V600E w genomowym DNA przy użyciu cyfrowej PCR kropelkowej (ddPCR). ddPCR może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w onkologii molekularnej, takie jak obecność i liczebność mutacji sekwencji RNA oraz kwantyfikacja kwasów nukleinowych przy niskiej liczbie kopii matrycy. Chociaż metoda ta jest demonstrowana na standardowych liniach komórkowych, może ona zostać zastosowana również w innych próbkach biologicznych, pod warunkiem optymalizacji warunków izolacji interesującego DNA.Ten system przygotowania tkanek może być wykorzystany do izolacji do 48 próbek wolnego od zanieczyszczeń ludzkiego genomowego DNA w ciągu czterech godzin w porównaniu z innymi procedurami manualnymi. System ten jest nieco kosztowniejszy w przygotowaniu ze względu na zastosowanie kulek magnetycznych. Jest on jednak bezpieczniejszy i pozwala uzyskać wysoką jakość produktu. Procedurę zaprezentują ssu A oraz technik z naszego laboratorium.Ekstrakcja DNA zostanie przeprowadzona w pełni zautomatyzowanym urządzeniu do izolacji DNA z wykorzystaniem systemu przygotowania tkanek lub protokołu TPS. Należy rozpocząć od włączenia instrumentu oraz komputera. Następnie należy uruchomić oprogramowanie sterujące procesem i wsunąć tacę automatycznego załadunku do obszaru załadunkowego pokładu TPS.Następnie rozdziel odczynniki do odpowiednich koryt, jak pokazano na tej rycinie, i umieść cztery próbki w statywie do próbek. Zapewnij właściwe wymieszanie buforu lizującego i buforów płuczących, odwracając je od trzech do pięciu razy, a następnie wprowadź je do odpowiednich koryt w kolumnie czwartej. Po kilkukrotnym odwróceniu lub delikatnym mieszaniu w wirówce typu vortex, wprowadź bufor elucyjny, kulki magnetyczne i bufor FFPE do małych koryt w kolumnie piątej, pozostawiając dwa puste miejsca w indicated miejscach.Umieść płytkę z głębokimi dołkami o pojemności dwóch mililitrów na nośniku płytek. Przed rozpoczęciem pracy zdejmij nakrętki UNC ze wszystkich probówek i koryt z odczynnikami. Upewnij się, że w butelce na odpady ciekłe jest wystarczająca przestrzeń, a butelka na odpady stałe jest pusta i wyłożona workiem na odpady biologiczne.Należy upewnić się, że płyta wyrzucająca końcówki jest wycentrowana w module na odpady. Zamknij przednią pokrywę, uruchom oprogramowanie, otwórz główny panel przygotowania NA dla ML starlet. Wykonaj plik med.Kliknij start. Status instrumentu zmieni się ze stanu spoczynku na stan pracy. Wprowadź liczbę próbek dla bieżącego pomiaru.Wybierz pożądaną metodę dla tego cyklu. Wprowadź pozycję pierwszej końcówki o dużej pojemności, wybierając jedną z nich. Jeśli wszystkie tacki są pełne, wprowadź pozycję pierwszej końcówki o standardowej pojemności, wybierając jedną z nich.Jeśli wszystkie tacki są pełne, urządzenie wykona kroki automatyczne bez ingerencji użytkownika. W celu uniknięcia kontaminacji przedstawiono tutaj szczegółowy schemat postępowania. Należy przestrzegać standardowych środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i korzystanie z czystego dygestorium do PCR.Należy użyć czystych pipet i probówek o niskim wiązaniu białek. Przygotować mieszaniny reakcyjne w paskach probówek do PCR, rozmrozić i doprowadzić składniki reakcji do temperatury pokojowej. Próbka ludzkiego DNA genomicznego do analizy digital droplet PCR lub D-D-P-C-R musi mieć stężenie co najmniej 3.3 ng/µL.Przygotować reakcje PCR. Połączyć 20 x super mix X-D-D-P-C-R, startery forward i reverse oraz sondę z każdą z oczyszczonych próbek DNA, a następnie uzupełnić objętość do 20 µL wodą destylowaną. Mieszaninę dokładnie wymieszać w wirówce vorexowej w celu zapewnienia homogeniczności i krótko odwirować, aby zgromadzić zawartość na dnie probówek przed dozowaniem.Generator kropel należy obsługiwać zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Włożyć kartridż do uchwytu tak, aby wcięcie w kartridżu znajdowało się po górnej lewej stronie uchwytu. Do środkowych studzienek dodać 20 µl mieszaniny reakcyjnej zawierającej próbki, a do dolnych studzienek 70 µl oleju do generatora.Zamocuj uszczelkę na górnej części kartridża. Upewnij się, że uszczelka jest stabilnie zahaczona na obu końcach uchwytu. W przeciwnym razie nie zostanie osiągnięte ciśnienie wystarczające do generowania kropel.Otwórz generator kropel, naciskając zielony przycisk na górze urządzenia. Włóż kartridż, gdy uchwyt znajduje się w prawidłowej pozycji. Zarówno kontrolka zasilania, jak i kontrolka uchwytu świecą na zielono.Ponownie naciśnij górny przycisk na urządzeniu, aby zamknąć drzwiczki i rozpocząć generowanie kropel. Po 10 sekundach kontrolka kropel zacznie migać na zielono, co oznacza, że proces generowania kropel trwa. Po zakończeniu generowania kropel wszystkie trzy kontrolki zmienią kolor na stały zielony.Otwórz drzwiczki, naciskając przycisk, i wyjmij uchwyt z urządzenia. Zdejmij jednorazową uszczelkę z uchwytu i ją wyrzuć. Należy zauważyć, że górne dołki kartridża zawierają kropelki, natomiast dołki środkowe i dolne są prawie puste, z niewielką ilością pozostałego oleju po procesie generowania kropelek.Przygotuj próbki do konwencjonalnej amplifikacji PCR. Dla każdej próbki pipetuj 40 µL zawartości kropelki z górnej studni kartridża do pojedynczej studni zalecanej płytki PCR 96-dołkowej, zgodnie z protokołem urządzenia producenta; aspiruj kropelkę powoli i delikatnie, aby zminimalizować siły ścinające podczas przenoszenia. Natychmiast po przeniesieniu kropelki płytka PCR musi zostać zamknięta, aby zapobiec parowaniu.Ustaw temperaturę zgrzewarki do płytek na 180 °C, a czas na pięć sekund. Dotknij strzałki, aby otworzyć drzwiczki tacy. Umieść blok wspierający na tacy stroną z 96 dołkami do góry.Umieść płytkę 96-dołkową na bloku wspierającym i upewnij się, że wszystkie dołki płytki są wyrównane z pokrywą bloku wspierającego. Płytkę 96-dołkową należy zamknąć jednym arkuszem folii uszczelniającej. Należy stosować utwardzalne folie uszczelniające do płytek, które są kompatybilne z zaprasowarką do płytek PCR oraz igłami w czytniku kropel. Upewnij się, że płytka 96-dołkowa jest stabilnie osadzona na bloku wspierającym i przykryta utwardzalną folią uszczelniającą.Naciśnij przycisk uszczelniania. Taca zamknie się, a proces zgrzewania termicznego zostanie rozpoczęty. Po zakończeniu zgrzewania termicznego drzwiczki otworzą się automatycznie.Wyjmij płytkę z bloku grzejnego, a następnie usuń blok grzejny. Upewnij się, że wszystkie dołki w płytce są uszczelnione, sprawdzając, czy nad każdym dołkiem widoczne są wklęsłości folii.Po zamknięciu płytka jest gotowa do cyklicznej obróbki termicznej. Przeprowadź konwencjonalną amplifikację PCR, stosując parametry szczegółowo opisane w tekście protokołu. Po zakończeniu amplifikacji PCR docelowego kwasu nukleinowego w kropelkach.Kolejnym krokiem jest analiza każdej kropelki z osobna przy użyciu dwukolorowego systemu detekcji. Zazwyczaj urządzenie do odczytu kropel jest ustawione na detekcję fluoroforów raportujących FAM i VIC. Kliknij „flush system”, aby przepłukać czytnik kropel i przygotować go do analizy D-D-P-C-R.Włóż płytkę do czytnika kropelek i kliknij start. Po zakończeniu odczytu kropelek otwórz drzwiczki i wyjmij uchwyt na płytkę z urządzenia. Wyjmij płytkę 96-dołkową z uchwytu i ją zutylizuj.Następnie należy przeprowadzić profilowanie mutacji DNA przy użyciu oprogramowania do analizy danych, zgodnie z opisem w tekście protokołu. W tej analizie d-d-p-c-r badano mutacje RAF V 600 E. Fluorescencję wykryto i przetworzono w formie dwuwymiarowego wykresu rozrzutu.Do wyznaczenia odpowiednich bramek użyto specjalistycznego oprogramowania, a następnie zliczano liczbę kropel w obrębie każdej bramki. Krople reprezentowane przez niebieskie kropki powyżej różowej linii odcięcia we wszystkich próbkach są dodatnie. W obu wykresach krople typu dzikiego dla zmutowanego RAF V 600 E są reprezentowane przez zielone kropki.Szare kropki na dole są traktowane jako tło fluorescencyjne. Całkowite częstości występowania alleli zmutowanych obliczono następnie na podstawie względnych wartości procentowych stężeń matrycy typu dzikiego bra oraz brav V 600 E wykrytych w jednym semestrze. HR z analizą indywidualną można przeprowadzić w ciągu czterech godzin po zastosowaniu tej procedury.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak monitorowanie progresji nowotworu po opracowaniu metody, można przeprowadzić inne analizy, np. płynną biopsję PPT. Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu diagnostyki towarzyszącej do eksploracji różnych detekcji mutacji w dziedzinie onkologii molekularnej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat przeprowadzania przygotowania tkanek oraz cyfrowego ddPCR w celu detekcji specyficznej punktowej mutacji DNA.

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Blokowanie PCR typu dzikiego, a następnie sekwencjonowanie bezpośrednie, oferuje bardzo czułą metodę wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek.

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Wykrywanie krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) we krwi jest niezaspokojoną potrzebą w diagnostyce klinicznej. W tym miejscu opisujemy metody charakteryzujące cRNA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przy użyciu czułej i specyficznej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Testy spełniają wymagania projektowe, aby wykryć warianty fuzji w ciągu 72 godzin.

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Tutaj opisujemy test hybrydyzacji in situ, który umożliwia czułe i specyficzne wykrywanie sekwencji tak krótkich jak 50 nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu na poziomie pojedynczej komórki. Test, który może być wykonywany ręcznie lub automatycznie, może umożliwić wizualizację wariantów splicingu, krótkich sekwencji i mutacji w kontekście tkanki.

Wizualizacja wariantów genetycznych, krótkich celów i mutacji punktowych w kontekście morfologicznym tkanki za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Ten protokół zapewnia powtarzalną metodę wizualizacji amplifikacji genów w próbkach tkanek z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie.

Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ

Identyfikacja mechanizmów leżących u podstaw uszkodzeń mięśni jest kluczowa. Przedstawiamy tutaj technikę histologiczną przygotowywania skrawków z laniny oraz skrawków mrożonych mięśni klatki piersiowej Drosophila. Pozwala to na analizę morfologii mięśni oraz lokalizację białek i innych składników komórek mięśniowych.

Przekroje woskowe i mrożone mięśni dorosłych osobników Drosophila

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół ekstrakcji DNA z materiału utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie. Jest to procedura wielodniowa, w ramach której skrawki tkanek są deparafinowane ksylenem, rehydratowane etanolem i traktowane proteinazą K w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA do późniejszej analizy genowo-specyficznej lub całego genomu.

Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Poznaj automatyczną ekstrakcję DNA z próbek FFPE i detekcję mutacji BRAF V600E metodą cyfrowej reakcji kropelkowej PCR. Ta technika umożliwia wykrywanie rzadkich mutacji w badaniach onkologicznych.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Przeglądaj więcej filmów