Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wyizolowanie ludzkiego genomowego DNA z formalnych i utrwalonych wzorcowych linii komórkowych osadzonych w parafinie przy użyciu systemu przygotowania tkanek, a następnie analiza mutacji bra V 600 E w genomowym DNA przy użyciu cyfrowej kropelki. P-C-R-D-D-P-C-R Może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w onkologii molekularnej, takie jak obecność i obfitość mutacji sekwencji RZS oraz kwantyfikacja kwasu nukleinowego przy niskiej liczbie kopii matrycy. Chociaż metoda ta jest demonstrowana w AEP od czasu standardowych linii komórkowych, można ją również stosować w innych próbkach biologicznych, aby upewnić się, że zoptymalizujesz warunki izolacji DNA, które Cię interesuje.

Ten system przygotowania tkanek może być używany do izolowania do 48 próbek ludzkiego genomowego DNA wolnego od zanieczyszczeń w ciągu czterech godzin w porównaniu z innymi procedurami ręcznymi. Ten system jest nieco drogi w przygotowaniu ze względu na użycie kulki magnetycznej. Jest jednak bezpieczniejszy i wyprodukowany oraz wysokiej jakości Ciśnienie zostanie zademonstrowane przez ssu A i technika z naszego laboratorium.

Ekstrakcja DNA zostanie przeprowadzona w pełni zautomatyzowanym instrumencie do izolacji DNA przy użyciu systemu przygotowania tkanek lub protokołu TPS. Zacznij od włączenia instrumentu i komputera. Otwórz oprogramowanie sterujące pracą i włóż tacę z automatycznym ładowaniem do obszaru załadunku pokładu TPS.

Następnie dozuj odczynniki do odpowiednich koryt, jak pokazano na tym rysunku, umieść cztery próbki w stojaku na próbki. Zapewnić prawidłowe wymieszanie buforu do lizy i do płukania, odwracając je trzy do pięciu razy, a następnie załadować je do odpowiednich koryt w kolumnie czwartej. Po kilkukrotnym odwróceniu lub łagodnym wirowaniu, załaduj elasyjne kulki magnetyczne bufora i bufor FFPE do małych rynien w kolumnie piątej, pozostawiając dwie puste szczeliny w miejscu wskazanym.

Załaduj płytkę o głębokości dwóch mililitrów na nośnik płyty. Przed rozpoczęciem biegu UNC zakryj wszystkie probówki i koryta z odczynnikami. Upewnij się, że w butelce na odpady płynne dostępna jest wystarczająca pojemność oraz że butelka na odpady stałe jest pusta i wyłożona workiem na odpady biologiczne.

Upewnij się, że płyta wyrzutnika końcówki jest wyśrodkowana w zespole odpływowym. Zamknij przednią pokrywę, uruchom oprogramowanie, otwórz główną gwiazdę ML przygotowania NA. Do med file.

Kliknij przycisk Start. Stan instrumentu zmieni się z bezczynnego na uruchomiony. Wprowadź liczbę próbek dla tego przebiegu.

Wybierz żądaną metodę dla tego przebiegu. Wprowadź pozycję pierwszej końcówki o dużej głośności, wybierając jedną. Jeśli wszystkie tace są pełne, wprowadź pozycję pierwszej standardowej końcówki objętościowej, wybierając jedną.

Jeśli wszystkie tace są pełne, urządzenie przejdzie przez zautomatyzowane kroki bez interwencji użytkownika. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy przebieg pracy, aby uniknąć zanieczyszczenia. Postępuj zgodnie ze standardowymi środkami ostrożności, takimi jak noszenie rękawiczek i używanie czystego kaptura do PCR.

Wyczyść pipety i probówki o niskiej zawartości białka. Mieszaniny reakcyjne zebrać w paski probówek do PCR, rozmrozić i zrównoważyć składniki reakcji do temperatury pokojowej. Próbka ludzkiego genomowego DNA do cyfrowej analizy kropelkowej, PCR lub D-D-P-C-R musi mieć minimalne stężenie 3,3 nanograma na mikrolitr.

Przygotuj reakcje PCR. Połącz dwa super startery X-D-D-P-C-R 20 x do przodu i do tyłu oraz sondę z każdą oczyszczoną próbką DNA i uzupełnij do 20 mikrolitrów wodą destylowaną. Dokładnie wymieszaj mieszankę, aby zapewnić jednorodność i krótko odwiruj, aby zebrać zawartość na dnie probówek przed dozowaniem.

Generator kropel należy uruchamiać zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Włóż wkład do uchwytu z wycięciem we wkładzie umieszczonym w lewym górnym rogu uchwytu. Dodać 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej zawierającej próbki do studzienek środkowych i 70 mikrolitrów oleju generatorowego do studzienek dennych.

Przymocuj uszczelkę w poprzek górnej części wkładu. Upewnij się, że uszczelka jest dobrze zaczepiona na obu końcach uchwytu. W przeciwnym razie nie zostanie osiągnięte ciśnienie wystarczające do wytworzenia kropel.

Otwórz generator kropel, naciskając zielony przycisk na górze instrumentu. Włóż wkład, gdy uchwyt znajduje się we właściwej pozycji. Zarówno kontrolka zasilania, jak i uchwytu świecą na zielono.

Ponownie naciśnij górny przycisk na instrumencie, aby zamknąć drzwi i zainicjować wytwarzanie kropel. Kontrolka kropli na zielono po 10 sekundach, wskazując, że trwa wytwarzanie kropli. Po zakończeniu generowania kropel wszystkie trzy kontrolki zmienią kolor na zielony.

Otwórz drzwi, naciskając przycisk i wyjmij uchwyt z urządzenia. Wyjmij jednorazową uszczelkę z uchwytu i wyrzuć ją. Należy pamiętać, że górne studzienki wkładu zawierają kropelki, a środkowe i dolne studzienki są prawie puste z niewielką ilością pozostałego oleju po wytworzeniu kropel.

Przygotuj się do konwencjonalnej amplifikacji PCR. Dla każdej próbki rura miała 40 mikrolitrów zawartości kropli z górnej studzienki wkładów do pojedynczego dołka zalecanej 96-dołkowej płytki PCR, jak wskazano w protokole przyrządów producenta, zasysać kroplę powoli i delikatnie, aby zminimalizować ścinanie kropli podczas przenoszenia. Natychmiast po przeniesieniu kropel płytka do PCR musi zostać szczelnie zamknięta, aby uniknąć parowania.

Ustaw temperaturę zgrzewarki do płyt na 180 stopni Celsjusza, a czas na pięć sekund. Dotknij strzałki, aby otworzyć drzwiczki tacy. Umieść blok nośny na tacy stroną z dołkiem 96 skierowaną do góry.

Umieść płytkę 96-dołkową na bloku nośnym i upewnij się, że wszystkie dołki płytowe są wyrównane z pokrywą bloku nośnego. Płytka 96-dołkowa z jednym arkuszem uszczelki foliowej Użyj równoległych uszczelek foliowych, które są kompatybilne z uszczelniaczem do płytek PCR i igłami w czytniku kropelkowym. Po zamocowaniu płytki 96-dołkowej na bloku nośnym i przykryciu utwardzalną uszczelką foliową.

Dotknij przycisku uszczelnienia. Taca zamknie się i rozpocznie się ogrzewanie sufitu. Po zakończeniu zgrzewania drzwi otworzą się automatycznie.

Wyjmij płytkę z bloku grzewczego, a następnie wyjmij blok grzewczy. Upewnij się, że wszystkie studzienki w płycie są uszczelnione, sprawdzając wgłębienia. Folia jest dobrze widoczna nad każdym dołkiem.

Po uszczelnieniu płytka jest gotowa do cykli termicznych. Wykonaj konwencjonalną amplifikację PCR, postępując zgodnie z parametrami wyszczególnionymi w tekście protokołu. Po zakończeniu amplifikacji PCR docelowego kwasu nukleinowego w kropelkach.

Kolejnym krokiem jest analiza każdej kropli z osobna za pomocą dwukolorowego systemu detekcji. Zazwyczaj przyrząd do odczytywania kropel jest ustawiony na wykrywanie czwórek fluorowych FAM i VIC reporterowych. Kliknij system spłukiwania, aby zalać czytnik kropel i przygotować go do analizy D-D-P-C-R.

Załaduj płytkę do czytnika kropel i kliknij przycisk start. Po zakończeniu odczytu kropel otwórz drzwi i wyjmij uchwyt płytki z urządzenia. Usunąć. Zdejmij płytkę ścienną 96 z uchwytu i wyrzuć ją.

Następnie należy przeprowadzić profilowanie mutacji DNA za pomocą oprogramowania do analizy danych, zgodnie z opisem w tekście protokołu. W tej analizie D-D-P-C-R badano mutacje RAF V 600 E. Fluorescencję wykryto i przetworzono na dwuwymiarowy wykres rozrzutu.

Do narysowania odpowiednich bramek użyto specjalnego oprogramowania i policzono liczbę kropel w każdej bramce. Kropelki reprezentowane przez niebieskie kropki powyżej różowej linii odcięcia dla wszystkich próbek są dodatnie. W przypadku zmutowanego biustonosza RAF V 600 E typu wild kropelki biustonosza są reprezentowane przez zielone kropki na obu wykresach.

Szare kropki na dole są uważane za tło fluorescencyjne. Ogólne częstości występowania zmutowanych alleli zostały następnie obliczone na podstawie względnych wartości procentowych stężeń matryc biustonosza typu dzikiego i brav V 600 E wykrytych w jednym semestrze. HR z indywidualną analizą można wykonać w ciągu czterech godzin po tej pozycji.

Inne próbki, takie jak płynna biopsja PPT, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak monitorowanie progresji raka po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się diagnostyką w terapii celowanej do zbadania różnych metod wykrywania mutacji w dziedzinie onkologii molekularnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać system przygotowania tkanek i cyfrową kroplę P-C-R-S-A dla określonego punktu, wykrywania mutacji DNA.