Modelowanie encefalopatii wcześniaków za pomocą prenatalnej hipoksji-niedokrwienia lipopolisacharydem wewnątrzowodniowym u szczurów
20 listopada 2015
Encefalopatia wcześniaków obejmuje nieprawidłowości ośrodkowego układu nerwowego związane z uszkodzeniem spowodowanym przedwczesnym porodem. W niniejszym raporcie opisano klinicznie istotny szczurzy model przejściowego ogólnoustrojowego niedotlenienia i niedokrwienia w macicy oraz podawania lipopolisacharydów owodniowych (LPS), który naśladuje zapalenie błon płodowych i związanego z tym wpływu bodźców zakaźnych i niedostatecznej perfuzji łożyska na rozwój OUN.
Ogólnym celem tej procedury chirurgicznej jest zapewnienie powtarzalnego modelu uszkodzenia mózgu związanego ze skrajnie przedwczesnym porodem, poprzez indukcję in utero, przejściowego niedotlenienia ogólnoustrojowego, niedokrwienia i zapalenia wewnątrzowodniowego w celu podsumowania niewydolności łożyska i zapalenia błony płodowej u szczurów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące patogenezy okołoporodowych uszkodzeń mózgu, które powstają w wyniku procesów wewnątrzmacicznych ułatwiających opracowanie ukierunkowanych strategii terapeutycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że indukuje ona uraz ogólnoustrojowy, który naśladuje wewnątrzmaciczne uszkodzenia spowodowane zarówno infekcją, jak i niedotlenieniem, niedokrwieniem powodującym funkcjonalne deficyty neurologiczne u dojrzałego szczura.
Model ten jest szczególnie przydatny do analizowania mechanizmów urazów związanych ze stanem zapalnym. Ponieważ niedotlenienie, niedokrwienie i bodźce zakaźne mogą być badane indywidualnie lub jako połączone urazy, demonstrując procedurę, Lindsey Chan, technik z naszego laboratorium. Przed rozpoczęciem zabiegu użyj maszynki do strzyżenia małych zwierząt, aby usunąć wszystkie włosy z dolnej części brzucha w dniu embrionalnym.
18 ciężarnych szczurów w prostokątny wzór, uważając, aby nie naciąć sutków ani nie wywołać wysypki po goleniu. Następnie, za pomocą sterylnych wacików, wyszoruj skórę trzema naprzemiennymi aplikacjami jodu powidonu i 70% etanolu. Gdy skóra jest sucha, potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia palcami u nogi, uszczypnij i udrapuj zwierzę.
Następnie za pomocą skalpela wykonaj trzycentymetrowe nacięcie w linii środkowej brzucha zwierzęcia, a następnie rozcięcie warstwy skóry z powięzi brzusznej nożyczkami. Za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych. Podnieś warstwę powięzi brzusznej i wykonaj nacięcie przez beznaczyniowy liniowy łokieć.
Gdy jama otrzewnej jest odsłonięta, umieść gazę chirurgiczną na zewnętrznej stronie nacięcia i zwilż gazę sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Następnie za pomocą kleszczy i zewnętrznego nacisku na brzuch delikatnie usuń rogi macicy z jamy otrzewnej i ułóż rogi na zwilżonej gazie. Uważając, aby uniknąć splątania i kontaktu z jelitami, do ułożenia płodów używaj tylko tkanki mięśniowej między poszczególnymi workami owodniowymi.
Następnie za pomocą rozwarstwienia odsłoń i odizoluj cztery tętnice maciczne. Uważaj, aby nie uszkodzić naczyń matczynych, gdy tętnice zostały odizolowane. Umieść klips do tętniaka szczura o rozmiarze 30 na każdym naczyniu Przed nałożeniem klipsów ważne jest, aby upewnić się, że cała otaczająca tkanka jest całkowicie czysta.
Podczas umieszczania klipsów zabezpiecz je kleszczami, a następnie umieść je równolegle. Obserwacja ustania tętna ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia całkowitego niedokrwienia niedotlenienia Po umieszczeniu wszystkich klipsów. Potwierdzić ustanie tętna bliższego i dystalnego oraz ciemnienie naczyń macicy, w tym w poszczególnych łożyskach.
Następnie przykryj całe pole operacyjne gazą i przepłucz tkankę sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Co 10 minut przez godzinę po 60 minutach usuń gazę i ponownie nawodnij pole. Gdy rogi i naczynia macicy są odpowiednio zwilżone, użyj kleszczy, aby delikatnie usunąć każdy klips tętniaka, uważając, aby nie spowodować urazu naczynia i zachować integralność tkanki.
Następnie dokładnie nawodnij rogi i pole. Po raz ostatni, uważając, aby usunąć wszelkie zabłąkane nitki gazy z worków owodniowych. Aby leczyć płody za pomocą LPS, użyj kleszczy, aby ustabilizować i obrócić każdy worek owodniowy tak, aby podstawa każdego pojedynczego worka owodniowego była widoczna.
Następnie załaduj jedną bardzo cienką strzykawkę insulinową o pojemności 0,3 mililitra z dołączoną igłą o rozmiarze 8 milimetrów i rozmiarze 31 z roztworem LPS i wstrzyknij 100 mikrolitrów roztworu tuż przed każdą płytką łożyskową. Po wyjęciu igły należy bezpośrednio uciskać worek owodniowy, aby zatrzymać wyciek płynu. Wprowadzenie bardzo cienkiej igły o rozmiarze 31 u podstawy worka owodniowego ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego dostarczania LPS bez dopuszczania do ucieczki płynu owodniowego.
Po trzykrotnym przepłukaniu rogów macicy sterylną solą fizjologiczną, za pomocą kleszczy należy przywrócić rogi do jamy otrzewnej. Następnie użyj jedwabnego szwu do biegania, aby przybliżyć krawędzie warstwy mięśniowo-powięziowej bez zszywania worka lub przez worek, a następnie zamknij skórę innym biegnącym jedwabnym szwem 3.0. Następnie użyj igły o rozmiarze 26 do podskórnie.
Wstrzyknąć jeden mililitr 0,125% bupiwakainy wokół brzegów rany. W razie potrzeby osuszyć szczura ręcznikiem, wstrzyknąć 0,1 miligrama na kilogram buprenorfiny w kark. Umieść zwierzę w czystej klatce domowej z monitorowaniem, aż do całkowitego wyzdrowienia.
Po przemijającym niedotlenieniu układowym, niedokrwieniu i podaniu LPS w 18. dniu zarodka, jak właśnie wykazano, barwienie het i eozyny ujawnia znaczne nieprawidłowości histopatologiczne zarówno w łożysku, jak i w mózgu. Rzeczywiście, łożysko badane w 19 i 21 dniu embrionalnym jest silnie emitowane z mikrokrwotokiem i martwicą w całym decidua i błędniku. Obserwuje się również znaczny naciek zapalny i zwiększone unaczynienie.
Dalsze badania mózgów w drugim dniu po urodzeniu ujawniają magalię komorową, a także utratę istoty białej i neuronów podpłytkowych w porównaniu z przejściowym niedotlenieniem układowym, niedokrwieniem i LPS również znacznie zmniejszyło ekspresję białka kotransportera chlorku potasu dwa, kotransportera chlorku A kluczowego dla rozwoju hamowania GABA-ergicznego w korze w 15. dniu po urodzeniu, co jest zgodne z upośledzoną regulacją rozwojową obserwowaną w krytycznym okresie dojrzewania obwodu po urodzeniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć solidną wiedzę, jak przeprowadzić tę operację u ciężarnych szczurów i jak wywołać prenatalne przejściowe niedotlenienie niedokrwienia poprzez niedrożność tętnicy macicznej ze stanem zapalnym w macicy poprzez doowodniowe wstrzyknięcie roztworu lipopolisacharydu. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w 90 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia model szczurzy symulujący uszkodzenie mózgu związane z ekstremalnie przedwczesnym urodzeniem, wywołane poprzez przejściową hipoksję i niedokrwienie systemowe in utero oraz wewnątrzowodniowy stan zapalny. Model ten ma na celu wyjaśnienie mechanizmów okołoporowego uszkodzenia mózgu związanego z infekcją i niewydolnością łożyska.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Medycyna okołoporodowa
Wstęp
- Encefalopatia wcześniaków obejmuje nieprawidłowości OUN wynikające z przedwczesnego urodzenia.
- Chorioamnionitis oraz niedokrwienie łożyska są istotnymi czynnikami wpływającymi na rozwój OUN.
- Zrozumienie tych czynników jest kluczowe dla opracowania strategii terapeutycznych.
- Procesy wewnątrzmaciczne mogą prowadzić do funkcjonalnych deficytów neurologicznych.
Cel badania
- Stworzenie powtarzalnego modelu uszkodzenia mózgu u skrajnie przedwcześnie urodzonych szczurów.
- Zbadanie skutków systemowego uszkodzenia naśladującego obrażenia wewnątrzmaciczne.
- Analiza patogenezy okołoporodnego uszkodzenia mózgu.
Zastosowane metody
- Indukcja przejściowej układowej hipoksji in utero.
- Indukcja niedokrwienia i stanu zapalnego w jamni i owodni.
- Wykorzystanie modelu szczura do badania skutków urazów złożonych.
- Ocena neurologicznych deficytów funkcjonalnych u dojrzałych szczurów.
Główne wyniki
- Model pomyślnie naśladuje skutki infekcji oraz niedotlenienia i niedokrwienia.
- Wykazano zdolność do testowania efektów pojedynczych i połączonych uszkodzeń.
- Uzyskano wgląd w mechanizmy uszkodzeń związanych ze stanem zapalnym.
- Ułatwiono opracowanie celowanych strategii terapeutycznych.
Wnioski
- Model ten jest cenny w badaniu mechanizmów okołoporodnych uszkodzeń mózgu.
- Może on pomóc w zrozumieniu wpływu warunków wewnątrzmacicznych na rozwój ośrodkowego układu nerwowego.
- W przyszłych badaniach można wykorzystać ten model do eksploracji interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy prenatalny model szczurzy wypełnia istotną lukę w badaniach nad encefalopatią wcześniaków, łącząc przejściową systemową hipoksję niedokrwienną z zapaleniem wewnątrzowodniowym w celu odtworzenia ludzkiego niedokrwienia łożyska oraz chorioamnionitis. Umożliwia on analizę mechanistyczną różnych typów uszkodzeń — niedokrwiennych w przeciwieństwie do infekcyjnych — co wspiera walidację celów terapeutycznych i odkrywanie biomarkerów w zakresie neuroprotekcji okołoporodowej. Zdolność modelu do wywoływania u dorosłych szczurów deficytów funkcjonalnych odzwierciedlających fenotypy kliniczne zwiększa wiarygodność prognostyczną w przedklinicznym przesiewie terapeutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację ścieżek niedotlenienia-niedokrwienia i zapalnych w modelu złożonego urazu.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez mierzalne uszkodzenia OUN, w tym utratę istoty białej, neuronów warstwy podpłytowej oraz oligodendrocytów.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez modelowanie zbieżnych patofizjologii obserwowanych u niemowląt skrajnie przedwcześnie urodzonych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie istotnych w kontekście choroby odczytów neuroanatomicznych i funkcjonalnych (zaburzenia chodu, morfologia komór, obniżona ekspresja KCC2) w celu standaryzacji testów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne i mierzalne wyniki w obrębie przedziałów łożyskowych i płodowych, co umożliwia wysokiej wierności screening związków.
- Użyteczność platformy: Pozwala na sekwencyjne testowanie pojedynczych i połączonych czynników uszkadzających, aby wyeliminować niejednoznaczność mechanistyczną w identyfikacji wiodących kandydatów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Odzwierciedla wiele kryteriów EoP — utratę neuronów/aksonów, degenerację blaszki podkorowej oraz trwałe deficyty funkcjonalne — co zwiększa trafność translacyjną.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zachowanie ciągłości od prenatalnego uszkodzenia do postnatalnego fenotypu, wspierając podłużne śledzenie biomarkerów.
- Minimalizacja ryzyka: Pozwala na podejmowanie decyzji o rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez modelowanie połączonej niewydolności łożyska i etiologii zapalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących konkretnych celów, poprzez screening fenotypowy, aż po walidację przedkliniczną, w szczególności w przypadku czynników neuroprotekcyjnych celujących w szlaki zapalne lub niedotlenieniowo- Niedokrwienne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie oddzielenia stanu zapalnego od różnych typów urazów (niedokrwiennych i infekcyjnych) wewnątrzmacicznie.
- Przesiewy: Dostarcza standaryzowanych, ilościowych wyników histopatologicznych i behawioralnych, niezbędnych dla powtarzalności testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia porównanie stopnia nasilenia urazu za pomocą histopatologii łożyska, histologii mózgu płodu oraz ponatalnych testów neurofunkcjonalnych.
- Badania translacyjne: Jest zgodne z patofizjologią kliniczną EoP, wspierając dopasowanie biomarkerów oraz ciągłość przejścia z fazy przedklinicznej do klinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do oceny monoterapii i interwencji skojarzonych w różnych modalnościach urazów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w przypadku okołoporodnego uszkodzenia mózgu poprzez modelowanie synergistycznych obrażeń łożyska i płodu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji czasu operacji (E18), rozmieszczenia klipsów oraz protokołów dawkowania LPS.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji badań (go/no-go) poprzez modelowanie wieloczynnikowych etiologii, które prowadzą do niepowodzeń w późnych fazach badań klinicznych nad neuroprotekcją.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków w oparciu o stratyfikację ryzyka, w zależności od ich skuteczności w modelach niedokrwiennych, zapalnych lub łączonych typach uszkodzeń.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikrochirurgii gryzoni, izolacji tętnicy macicznej oraz manipulacji pęcherzykiem owodniowym.
- Zależy od precyzyjnego instrumentarium: klipsów tętniaczych o rozmiarze 30 G, strzykawek insulinowych o rozmiarze 31 G oraz utrzymania sterylności pola operacyjnego.
- Wymaga standaryzacji między zespołami zajmującymi się chirurgią, histologią i analizą behawioralną w celu zapewnienia spójnego fenotypowania.
- Adaptacja do innych modeli wymaga walidacji dynamiki perfuzji łożyska oraz odpowiedzi zapalnej na dawkę.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność chirurgiczną w rozmieszczeniu klipsów oraz dyfuzji LPS, co musi być kontrolowane poprzez weryfikację ustania tętna i przemywanie solą fizjologiczną.
