Name: Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę monitorowania homeostazy wapniowej w retikulum endoplazmatycznym za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP. Technika umożliwia nieinwazyjne badanie w czasie rzeczywistym w tkance wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Intramural Research Program w National Institute on Drug Abuse. Dziękujemy Dougowi Howardowi, Chrisowi Richie, Lowelli Fortuno i Joshowi Hinkle'owi za ich wkład w rozwój tej metody.

<ol><li>Sitia, R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum+protein+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory.</a> Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).</li>
<li>Fu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+lipid+metabolism+disrupts+calcium+homeostasis+causing+liver+endoplasmic+reticulum+stress+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity.</a> Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).</li>
<li>Micaroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+intracellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in intracellular trafficking.</a> Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).</li>
<li>Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic-reticulum+calcium+depletion+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+probes+for+measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium.</a> Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).</li>
<li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2%2B+dynamics+in+high+Ca2%2B+concentration+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li>
<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li>
<li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intraorganellar+Ca2%2B+at+subcellular+resolution+using+CEPIA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nat Commun. 5, 4153(2014).</li>
<li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).</li>
<li>Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCaMP%3A+a+carboxy-terminal+protein+modification+that+enables+monitoring+of+ER+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis.</a> Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).</li>
<li>Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesencephalic+astrocyte-derived+neurotrophic+factor+%28MANF%29+secretion+and+cell+surface+binding+are+modulated+by+KDEL+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors.</a> J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).</li>
<li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+4-%282-hydroxyethyl%29-1-piperazine%C3%ABthanesulfonic+acid+%28HEPES%29+as+a+tissue+culture+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).</li>
<li>Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+cytotoxic+effects+of+light-exposed+HEPES-containing+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).</li>
<li>Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+and+toxicity+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+7%2C+8%2C+and+9+in+rat+neurons+and+glia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro.</a> Virology. 372 (1), 24-34 (2008).</li>
<li>Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+amplifies+the+platelet+procoagulant+response+caused+by+thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin.</a> Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li>
<li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li>
<li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+in+gene+therapy%3A+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten podkreśla przydatność in vitro i in vivo GLuc-SERCaMP do monitorowania wyczerpania wapnia ER. Chociaż modyfikacja białka w celu wygenerowania SERCaMP wydaje się uogólniać na inne białka reporterowe12, wybraliśmy lucyferazę Gaussia ze względu na jej solidną (200-1000 razy większą) bioluminescencję w porównaniu z innymi lucyferazy18. Wykazujemy wykrywalne uwalnianie GLuc-SERCaMP indukowane przez thapsigarginę w 100-krotnym zakresie dawek wirusa GLuc-SERCaMP dost...

Retikulum endoplazmatyczne (ER) funkcjonuje w wielu możliwościach komórkowych, w tym w fałdowaniu białek, wydzielaniu białek, homeostazie lipidów i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej1. Kluczowe dla normalnej funkcji ER jest utrzymanie stężenia wapnia w świetle na poziomie ~ 5,000 razy większym niż w cytoplazmie2-4. Ten energochłonny proces jest regulowany przez ATPazę wapniową sarko/retikulum endoplazmatycznego (SERCA), pompę, która przenosi jony wapnia do ER. Wypływ wapnia z ER odbywa się głównie za pośrednictwem receptorów ryanodyny (RyR) i trifosforanu inozytolu (IP3R). Ponieważ wiele procesów ER jest zależnych od wapnia, zakłócenie magazynowania może prowadzić do stresu ER i ostatecznej śmierci komórki.
ER zaobserwowano dysregulację wapnia w chorobach takich jak kardiomiopatia, cukrzyca, choroba Alzheimera i Parkinsona5. Ze względu na postępujący charakter tych chorób trudno było określić związek przyczynowo-skutkowy między patogenezą a zmianami w magazynie wapnia ER. Szereg technologii pozwoliło na znaczne postępy w zrozumieniu dynamiki wapnia ER, w tym barwników i genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI). Barwniki wapniowe o niskim powinowactwie, które zwiększają fluorescencję po związaniu z Ca2+, można załadować do komórek w celu zbadania przedziałów subkomórkowych o wysokim stężeniu wapnia6. GECI, takie jak D1ER i CatchER, pozwalają na monitorowanie wahań wapnia z bardziej precyzyjną kontrolą lokalizacji subkomórkowej7-9. Ostatnio opisano inną klasę GECI zwaną wskaźnikami białkowymi uwięzionymi w organellach pomiarowych wapnia (CEPIA)10. Trzecim podejściem łączącym genetykę i chemię małych cząsteczek jest ładowanie barwnikiem esterazy celowanej (TED), które wykorzystuje genetycznie kodowaną karboksyloesterazy (ukierunkowaną na ER) z barwnikiem wapniowym na bazie estrów11.
Chociaż wyżej wymienione podejścia mają swoje mocne i słabe strony, mogą dostarczyć cennych informacji na temat dynamiki wapnia w ER dzięki ostrym pomiarom fluorescencji. Nie są one jednak optymalne dla badań podłużnych, które często są wymagane do zbadania progresji choroby. Mając na celu opracowanie metody monitorowania dynamiki wapnia w dłuższych okresach czasu, zidentyfikowaliśmy i opracowaliśmy modyfikację białka w celu stworzenia wydzielanych białek monitorowania wapnia ER (SERCaMPs)12.
SERCaMP omija kilka ograniczeń związanych z innymi metodologiami, zapewniając minimalnie inwazyjne podejście do wielokrotnego przeszukiwania magazynu wapnia ER. Wcześniej wykazaliśmy, że peptyd karboksylowo-końcowy ASARTDL (alanina-seryna-alanina-arginina-treonina-kwas asparaginowy-leucyna) jest wystarczający do promowania retencji ER; jednak w warunkach, które powodują zmniejszenie stężenia wapnia ER, sekwencja peptydowa nie jest już w stanie utrzymać lokalizacji ER i białko jest wydzielane13. Podstawą technologii SERCaMP jest dołączenie ASARTDL do końca karboksylowego wydzielanego białka (np. Gaussia luciferase lub GLuc) w taki sposób, że wydzielanie jest wyzwalane przez wyczerpanie wapnia ER, tworząc w ten sposób solidny reporter dysregulacji wapnia ER12. Ekspresja GLuc-SERCaMP za pomocą metod transgenicznych umożliwia analizę płynów biologicznych, w tym pożywki do hodowli komórkowych i osocza, pod kątem zmian w aktywności GLuc jako wskaźnika homeostazy wapnia ER. Metoda ta ma zastosowanie w badaniach podłużnych postępujących zmian w magazynie wapnia ER zarówno in vitro, jak i in vivo. Poniższy protokół został napisany jako ogólny zarys korzystania z SERCaMP opartego na GLuc do badania homeostazy wapnia ER, ale protokół może służyć jako przewodnik dla alternatywnych reporterowych SERCaMP.

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór NP-40&nbsp;</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td>do wewnątrzkomórkowych testów GLuc</td></tr><tr><td>Strzykawki Luer-lok 1 ml</td><td>Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>200 mikrolitrowe końcówki filtrujące</td><td>Nici</td> chirurgiczne <td>Rainin RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0</td><td>Igły Fisher</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>30 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-821-13A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepne arkusze uszczelniające do mikropłytek</td><td>Thermo</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki nasączone alkoholem</td><td>Fisher</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>Anestezjologiczny system automatycznego przepływu</td><td>EZ Anestezjolizacja</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Komora rekonwalescencji dla zwierząt</td><td>Lyon Vet</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór betadyny</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Serum na wzrost bydła</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine, Native</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Igły do cięcia 3/8 szwów kołowych</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy ultradźwiękowy środek czyszczący</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy, GlutaMAX, pirogronian</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka masy DNA</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Lucyferazy Gaussia (białko rekombinowane)</td><td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało lucyferazy Gaussia (dla WB, ICC lub IHC)</td><td>New England Biolabs</td><td>E8023S</td><td>1:2,000 (WB)</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Płytki testowe Gluc (96 dołków, nieprzezroczyste)</td><td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Butler Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop Ściągacz w proszku</td><td>Butler Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>a452-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R Wirówka</td><td>Bekman Colter</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Fisher</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Neurobaseal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereoscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel and PCR Cleanup</td><td>Pipet Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Zestaw</td> szybkiego mianowania <td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Lenti-X</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka foliowa PCR</td><td>Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>ReFresh Kanister z filtrem węglowym</td><td>EZ Anestezjolizacja</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela, #10</td><td>Narzędzia Fine Science Inc</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Szczury SD 150-200 g</td><td>Charles River</td><td>Szczury</td><td>szczury zamówione w ilości 150-200 g.&nbsp; Zabieg chirurgiczny 5 dni po przyjeździe</td></tr><tr><td>Kolczyki dla małych zwierząt National</td><td>Band and Tag co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne serwety chirurgiczne</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 czytnik płytek</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>szkodliwy dla zdrowie ludzkie</td></tr><tr><td>Virapower lentiviral packaging mix</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Xfect Transfection</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Valley Vet</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy gaussia sercamp

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Retikulum endoplazmatyczne (ER) zawiera najwyższy poziom wewnątrzkomórkowego wapnia, o stężeniach około 5 000 razy większych niż poziomy cytoplazmatyczne. Ścisła kontrola nad wapniem ER jest niezbędna do fałdowania, modyfikacji i transportu białek. Zaburzenia wapnia w ER mogą powodować aktywację niesfałdowanej odpowiedzi białkowej, trójstronnego mechanizmu odpowiedzi na stres ER i przyczyniać się do patogenezy w różnych chorobach. Możliwość monitorowania zmian stężenia wapnia w ER podczas wystąpienia i progresji choroby jest zasadniczo ważna, ale w praktyce stanowi wyzwanie. Obecnie dostępne metody monitorowania wapnia ER, takie jak barwniki i białka fluorescencyjne zależne od wapnia, dostarczyły informacji na temat dynamiki wapnia w komórkach, jednak narzędzia te nie są dobrze przystosowane do badań in vivo. Nasze laboratorium wykazało, że modyfikacja końca karboksylowego lucyferazy Gaussia nadaje wydzielanie reportera w odpowiedzi na wyczerpanie wapnia ER. Metody stosowania opartego na lucyferazy, wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) do zastosowań in vitro i in vivo opisano w niniejszym dokumencie. Ten film przedstawia iniekcje do wątroby, farmakologiczne manipulacje GLuc-SERCaMP, pobieranie i przetwarzanie krwi oraz parametry testowe do długotrwałego monitorowania wapnia ER.

Metoda GLuc-SERCaMP umożliwia ocenę homeostazy wapnia w retikulum endoplazmatycznym (ER) poprzez pobieranie płynów pozakomórkowych. W celu usprawnienia interpretacji wyników w projekcie doświadczalnym można uwzględnić kilka kontroli. Po pierwsze, do oceny wpływu zabiegów eksperymentalnych na szlak wydzielniczy (ogólnokomórkową sekrecję) oraz ekspresję transgenu można zastosować reporter konstytutywnie wydzielany (np. GLuc bez C-końcowego fragmentu ASARTDL lub „GLuc-No Tag”). Przykładowo, wzrost pozakomórkowych p...

Homeostaza wapniowa retikulum endoplazmatycznego jest zaburzona w różnych patologiach. Reporter wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) może być używany do wykrywania zakłóceń w magazynie wapnia ER. Protokół ten opisuje zastosowanie Gaussia lucyferazy SERCaMP do badania homeostazy wapnia ER in vitro i in vivo.

Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest monitorowanie dysregulacji wapnia w siateczce śródplazmatycznej w czasie przy użyciu wydzielanego białka reporterowego. Jest to osiągane poprzez transgenezę tkanki docelowej, a konkretnie wątroby, za pomocą wektora wirusowego. W tym przykładzie z wykorzystaniem reportera lucyferazy Gai circa, pobierany jest biologiczny płyn ustrojowy, taki jak krew, w celu pomiaru ilości circa uwolnionego z tkanki, a następnie do próbek osocza dodawany jest substrat lucyferazy i mierzy się luminescencję, aby określić stopień uszczuplenia zapasów wapnia w ER.Wyniki wykazują dysregulację wapnia w ER, o czym świadczy podwyższony poziom cAMP w osoczu; homeostazę wapnia w ER można monitorować przez dłuższy czas poprzez wielokrotne pobieranie niewielkich objętości płynów ustrojowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak barwniki wapniowe o niskim powinowactwie lub genetycznie kodowane wskaźniki wapnia, jest możliwość monitorowania homeostazy wapnia w ER in vivo w czasie za pomocą małoinwazyjnej procedury. Istnieją dwie ścieżki terapeutyczne dla tej techniki.Pierwszym podejściem jest przesiewanie leków, które mogą utrzymać lub przywrócić homeostazę wapnia w ER do normalnego stanu fizjologicznego. Drugim podejściem jest modyfikacja białka terapeutycznego w celu przekształcenia go w terapeutyczne AMP, których sekrecja następuje w odpowiedzi na wyczerpanie zapasów wapnia w ER. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat dysregulacji wapnia w ER w wątrobie.Metodę tę można zastosować również w przypadku innych układów narządowych, takich jak mózg, serce, mięśnie lub trzustka. Po znieczuleniu szczura rasy Sprague Dawley, zgodnie z protokołem tekstowym, należy zastosować maść oftalmiczną i wykonać ucisk ogona w celu weryfikacji znieczulenia, ogolić obszar brzucha od miejsca nieco poniżej żeber do środkowej części brzucha oraz trzykrotnie przemyć pole operacyjne, naprzemiennie stosując Betadine i 70% etanol. Następnie szczura należy ułożyć w pozycji grzbietnej na sterylnym polu operacyjnym i przykryć sterylnymi draperiami chirurgicznymi, a następnie rozcieńczyć a v gluc samp do stężenia zoptymalizowanego przez użytkownika.W tym przypadku zastosowano 7,6 × 10⁹ genomów wirusowych na mililitr i wymieszano poprzez odwracanie probówki. Następnie 105 µL rozcieńczonego AAV pipetuje się do sterylnego naczynia, a wirusa pobiera do strzykawki za pomocą igły o rozmiarze 30 G. Za pomocą skalpela zaznacza się miejsce nacięcia w celu odsłonięcia wątroby do wykonania iniekcji.Wykonaj poziome nacięcie o długości około dwóch do trzech centymetrów poniżej klatki piersiowej. Przeprowadź rozdzielanie tępe, aby oddzielić tkankę łączną od tkanki podskórnej. Przetnij mięśnie brzucha, odsłaniając prawy płat przyśrodkowy wątroby.Następnie umieść zwierzę pod mikroskopem chirurgicznym i dostosuj obraz tak, aby prawy płat przyśrodkowy wątroby znajdował się w polu widzenia. Następnie, używając strzykawki, wstrzyknij jedną trzecią całkowitej objętości wirusa w trzy miejsca w miąższu prawego płata przyśrodkowego, pozostawiając igłę w tkance od 5 do 10 sekund po wstrzyknięciu, aby zapewnić podanie całej objętości preparatu; zaszyj mięśnie brzucha oraz nacięcie i za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką nałóż Neosporin. Umieść szczura w komorze rekonwalescencyjnej do czasu odzyskania przytomności i zdolności do utrzymania pozycji pionowej, a następnie przenieś zwierzę do indywidualnej klatki domowej.Od czterech do siedmiu dni po iniekcji. Przygotować probówki do pobierania krwi, etykietując je i ważąc przed użyciem. Następnie do każdej probówki dodać 50 µL heparyny w stężeniu 1000 units/mL.Po znieczuleniu szczura zgodnie z protokołem tekstowym, wykonaj uciśnięcie ogona w celu weryfikacji sedacji i używając sterylnych nożyczek, odetnij koniuszek ogona w odległości około jednego do dwóch milimetrów od końca. Zbierz kroplami ponad 100 µL krwi do probówki wypełnionej wcześniej heparyną, aby zatamować krwawienie.Używając zwilżonego aplikatora bawełnianego, nanieś proszek STIC na ogon. Używaj gazika nasączonego etanolem do przecierania nożyczek i sterylizacji koralika pomiędzy kolejnymi pobraniami. Próbówki z krwią przechowuj w temperaturze 4 °C.W przypadku pobierania kolejnych próbek, należy zważyć probówki do pobierania i dostosować ilość heparyny, aby uzyskać stosunek krwi do heparyny dwa do jednego. Krok ten pozwoli znormalizować ilość heparyny w każdej próbce. Następnie należy odwirować probówki przy 2000 ×g i 4 °C przez pięć minut.Przenieś nadsącz plazmy do nowej probówki i przechowuj w temperaturze 4 °C do 72 godzin lub w temperaturze -80 °C długoterminowo w celu przeprowadzenia testu lucyferazy, aby podać thaa garin jako kontrolę pozytywną. Rozcieńcz w etanolu do stężenia końcowego 2,5 mg/mL. Następnie wykonaj wtrysk w dawce 1 mg/kg drogą dosytnieniową w dolną część brzucha.Pobierz pierwszą próbkę krwi w 24. godzinie po iniekcji zgodnie z powyższym opisem. W celu pomiaru luminescencji przygotuj substrat roboczy selen ezine zgodnie z protokołem tekstowym i inkubuj w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, przez 30 minut.W międzyczasie rozmrozić wszystkie próbki na lodzie i przenieść 10 µL osocza do płytki z nieprzezroczystymi ściankami, korzystając z czytnika płytek umożliwiającego monitorowanie bioluminescencji i wyposażonego w injektor substratu. Przepłukać linie doprowadzające substratem. Wstrzyknąć 100 µL substratu do dołka.Wstrząsaj z umiarkowaną prędkością przez pięć sekund i zmierz emisję światła dla próbek in vitro. Zintegruj emisję światła w czasie 0,5 sekundy dla etapu odczytu, a dla próbek in vivo zintegruj ją w czasie pięciu sekund podczas etapu odczytu, aby ocenić homeostazę wapnia w siateczce śródplazmatycznej. Stosując metodę Gluc SAR Camp, można uwzględnić kilka kontroli, takich jak w tym przypadku konstytutywnie wydzielany reporter Gluc Noag.Wzrost pozakomórkowych poziomów zarówno GLUC SAR camp, jak i Gluc noag w odpowiedzi na warunki eksperymentalne zostałby uznany za wynik niejednoznaczny. Jednakże wzrost sekrecji gluc SAR camp przy braku odpowiedzi gluc noag potwierdza zdarzenie zależne od wapnia w retikulum endoplazmatycznym (ER). Modulatory farmakologiczne zapasów wapnia w ER mogą zostać wykorzystane do potwierdzenia udziału wapnia z ER w uwalnianiu SAR camp w nowych paradygmatach.Na przykład, jak wykazano tutaj, dantrolen, antagonista receptora INE stabilizujący wapń w ER, hamuje uwalnianie SAR camp w odpowiedzi na thic argon. W badaniach in vitro z wykorzystaniem gluc-opartego SAR camp, odpowiedź wywołaną leczeniem najlepiej oceniać w czasie. Poprzez śledzenie zmian w odpowiedzi relatywnej w obrębie jednej płytki w stosunku do kontroli, nie zaleca się porównywania surowych wartości między wieloma płytkami, gdzie rozkład substratu może prowadzić do zmian w wartościach surowych. W badaniach in vivo dane powinny być oceniane niezależnie dla każdego zwierzęcia, przy czym każde zwierzę służy jako własna kontrola przed leczeniem.Jest to niezbędne, aby uwzględnić zmienność w dostarczaniu i ekspresji transgenu pomiędzy zwierzętami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania technologii sircam do badania regulacji wapnia w siateczce śródplazmatycznej w modelach chorób wątroby u gryzoni. Należy pamiętać, że praca z wektorami wirusowymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej.

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Źródło: Bannai, H., et al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019 rok)Film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne w celu obserwacji specyficznej dla przedziałów spontanicznej dynamiki wapnia w astrocytach poprzez sekwencyjne monitorowanie wrażliwych na wapń białek zlokalizowanych na błonie plazmatycznej i retikulum endoplazmatycznym.

Spontaniczne obrazowanie wapnia dla dynamiki specyficznej dla przedziałów w astrocytach

Ładowanie barwnikiem indukowane przez esterazy celowane (TED) wspiera analizę dynamiki wewnątrzkomórkowego magazynowania wapnia za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda opiera się na ukierunkowaniu rekombinowanej karboksylesterazy na retikulum endoplazmatyczne (ER), gdzie poprawia miejscowe demaskowanie syntetycznych barwników wskaźnikowych Ca2+ o niskim powinowactwie w świetle ER.

Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Prezentujemy protokoły zastosowania naszego ukierunkowanego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI) CatchER+ do monitorowania szybkich stanów przejściowych wapnia w retikulum endoplazmatycznym/sarkoplazmatycznym (ER/SR) HEK293 i komórkach C2C12 mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Omówiono również protokół pomiaru i kalibracji in situ Kd.

Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca2+ CatchER+

Ten protokół przedstawia prostą metodę analizy sygnałów wapniowych w roślinach, generowanych przez karmienie owadów pluskwiaków, takich jak mszyce. Arabidopsis thaliana przekształcony za pomocą biosensora wapnia GCaMP3 GFP pozwala na obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym in vivo z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Rejestrowanie w czasie rzeczywistym sygnałów wapniowych Arabidopsis podczas żerowania owadów za pomocą biosensora fluorescencyjnego

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Ten protokół opisuje podejście do wykonywania obrazowania wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych i oferuje podejście do analizy.

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Ustanowiliśmy test ponownego składania lucyferazy z podziałem na monitorowanie kontaktów endoplazmatycznych retikulum-mitochondriów w żywych komórkach. Za pomocą tego testu opisujemy protokół ilościowego pomiaru poziomu tych sprzężeń między organellami w komórkach HEK293T w warunkach obróbki chemicznej.

Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

Poznaj metodę monitorowania homeostazy wapniowej w retikulum endoplazmatycznym za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP. Technika umożliwia nieinwazyjne badanie w czasie rzeczywistym w tkance wątroby.

Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

Przeglądaj więcej filmów