Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest monitorowanie dysregulacji wapnia w siateczce śródplazmatycznej w czasie przy użyciu wydzielanego białka reporterowego. Jest to osiągane poprzez transgenezę tkanki docelowej, a konkretnie wątroby, za pomocą wektora wirusowego. W tym przykładzie z wykorzystaniem reportera lucyferazy Gai circa, pobierany jest biologiczny płyn ustrojowy, taki jak krew, w celu pomiaru ilości circa uwolnionego z tkanki, a następnie do próbek osocza dodawany jest substrat lucyferazy i mierzy się luminescencję, aby określić stopień uszczuplenia zapasów wapnia w ER.

Wyniki wykazują dysregulację wapnia w ER, o czym świadczy podwyższony poziom cAMP w osoczu; homeostazę wapnia w ER można monitorować przez dłuższy czas poprzez wielokrotne pobieranie niewielkich objętości płynów ustrojowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak barwniki wapniowe o niskim powinowactwie lub genetycznie kodowane wskaźniki wapnia, jest możliwość monitorowania homeostazy wapnia w ER in vivo w czasie za pomocą małoinwazyjnej procedury. Istnieją dwie ścieżki terapeutyczne dla tej techniki.

Pierwszym podejściem jest przesiewanie leków, które mogą utrzymać lub przywrócić homeostazę wapnia w ER do normalnego stanu fizjologicznego. Drugim podejściem jest modyfikacja białka terapeutycznego w celu przekształcenia go w terapeutyczne AMP, których sekrecja następuje w odpowiedzi na wyczerpanie zapasów wapnia w ER. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat dysregulacji wapnia w ER w wątrobie.

Metodę tę można zastosować również w przypadku innych układów narządowych, takich jak mózg, serce, mięśnie lub trzustka. Po znieczuleniu szczura rasy Sprague Dawley, zgodnie z protokołem tekstowym, należy zastosować maść oftalmiczną i wykonać ucisk ogona w celu weryfikacji znieczulenia, ogolić obszar brzucha od miejsca nieco poniżej żeber do środkowej części brzucha oraz trzykrotnie przemyć pole operacyjne, naprzemiennie stosując Betadine i 70% etanol. Następnie szczura należy ułożyć w pozycji grzbietnej na sterylnym polu operacyjnym i przykryć sterylnymi draperiami chirurgicznymi, a następnie rozcieńczyć a v gluc samp do stężenia zoptymalizowanego przez użytkownika.

W tym przypadku zastosowano 7,6 × 10⁹ genomów wirusowych na mililitr i wymieszano poprzez odwracanie probówki. Następnie 105 µL rozcieńczonego AAV pipetuje się do sterylnego naczynia, a wirusa pobiera do strzykawki za pomocą igły o rozmiarze 30 G. Za pomocą skalpela zaznacza się miejsce nacięcia w celu odsłonięcia wątroby do wykonania iniekcji.

Wykonaj poziome nacięcie o długości około dwóch do trzech centymetrów poniżej klatki piersiowej. Przeprowadź rozdzielanie tępe, aby oddzielić tkankę łączną od tkanki podskórnej. Przetnij mięśnie brzucha, odsłaniając prawy płat przyśrodkowy wątroby.

Następnie umieść zwierzę pod mikroskopem chirurgicznym i dostosuj obraz tak, aby prawy płat przyśrodkowy wątroby znajdował się w polu widzenia. Następnie, używając strzykawki, wstrzyknij jedną trzecią całkowitej objętości wirusa w trzy miejsca w miąższu prawego płata przyśrodkowego, pozostawiając igłę w tkance od 5 do 10 sekund po wstrzyknięciu, aby zapewnić podanie całej objętości preparatu; zaszyj mięśnie brzucha oraz nacięcie i za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką nałóż Neosporin. Umieść szczura w komorze rekonwalescencyjnej do czasu odzyskania przytomności i zdolności do utrzymania pozycji pionowej, a następnie przenieś zwierzę do indywidualnej klatki domowej.

Od czterech do siedmiu dni po iniekcji. Przygotować probówki do pobierania krwi, etykietując je i ważąc przed użyciem. Następnie do każdej probówki dodać 50 µL heparyny w stężeniu 1000 units/mL.

Po znieczuleniu szczura zgodnie z protokołem tekstowym, wykonaj uciśnięcie ogona w celu weryfikacji sedacji i używając sterylnych nożyczek, odetnij koniuszek ogona w odległości około jednego do dwóch milimetrów od końca. Zbierz kroplami ponad 100 µL krwi do probówki wypełnionej wcześniej heparyną, aby zatamować krwawienie.

Używając zwilżonego aplikatora bawełnianego, nanieś proszek STIC na ogon. Używaj gazika nasączonego etanolem do przecierania nożyczek i sterylizacji koralika pomiędzy kolejnymi pobraniami. Próbówki z krwią przechowuj w temperaturze 4 °C.

W przypadku pobierania kolejnych próbek, należy zważyć probówki do pobierania i dostosować ilość heparyny, aby uzyskać stosunek krwi do heparyny dwa do jednego. Krok ten pozwoli znormalizować ilość heparyny w każdej próbce. Następnie należy odwirować probówki przy 2000 ×g i 4 °C przez pięć minut.

Przenieś nadsącz plazmy do nowej probówki i przechowuj w temperaturze 4 °C do 72 godzin lub w temperaturze -80 °C długoterminowo w celu przeprowadzenia testu lucyferazy, aby podać thaa garin jako kontrolę pozytywną. Rozcieńcz w etanolu do stężenia końcowego 2,5 mg/mL. Następnie wykonaj wtrysk w dawce 1 mg/kg drogą dosytnieniową w dolną część brzucha.

Pobierz pierwszą próbkę krwi w 24. godzinie po iniekcji zgodnie z powyższym opisem. W celu pomiaru luminescencji przygotuj substrat roboczy selen ezine zgodnie z protokołem tekstowym i inkubuj w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, przez 30 minut.

W międzyczasie rozmrozić wszystkie próbki na lodzie i przenieść 10 µL osocza do płytki z nieprzezroczystymi ściankami, korzystając z czytnika płytek umożliwiającego monitorowanie bioluminescencji i wyposażonego w injektor substratu. Przepłukać linie doprowadzające substratem. Wstrzyknąć 100 µL substratu do dołka.

Wstrząsaj z umiarkowaną prędkością przez pięć sekund i zmierz emisję światła dla próbek in vitro. Zintegruj emisję światła w czasie 0,5 sekundy dla etapu odczytu, a dla próbek in vivo zintegruj ją w czasie pięciu sekund podczas etapu odczytu, aby ocenić homeostazę wapnia w siateczce śródplazmatycznej. Stosując metodę Gluc SAR Camp, można uwzględnić kilka kontroli, takich jak w tym przypadku konstytutywnie wydzielany reporter Gluc Noag.

Wzrost pozakomórkowych poziomów zarówno GLUC SAR camp, jak i Gluc noag w odpowiedzi na warunki eksperymentalne zostałby uznany za wynik niejednoznaczny. Jednakże wzrost sekrecji gluc SAR camp przy braku odpowiedzi gluc noag potwierdza zdarzenie zależne od wapnia w retikulum endoplazmatycznym (ER). Modulatory farmakologiczne zapasów wapnia w ER mogą zostać wykorzystane do potwierdzenia udziału wapnia z ER w uwalnianiu SAR camp w nowych paradygmatach.

Na przykład, jak wykazano tutaj, dantrolen, antagonista receptora INE stabilizujący wapń w ER, hamuje uwalnianie SAR camp w odpowiedzi na thic argon. W badaniach in vitro z wykorzystaniem gluc-opartego SAR camp, odpowiedź wywołaną leczeniem najlepiej oceniać w czasie. Poprzez śledzenie zmian w odpowiedzi relatywnej w obrębie jednej płytki w stosunku do kontroli, nie zaleca się porównywania surowych wartości między wieloma płytkami, gdzie rozkład substratu może prowadzić do zmian w wartościach surowych. W badaniach in vivo dane powinny być oceniane niezależnie dla każdego zwierzęcia, przy czym każde zwierzę służy jako własna kontrola przed leczeniem.

Jest to niezbędne, aby uwzględnić zmienność w dostarczaniu i ekspresji transgenu pomiędzy zwierzętami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania technologii sircam do badania regulacji wapnia w siateczce śródplazmatycznej w modelach chorób wątroby u gryzoni. Należy pamiętać, że praca z wektorami wirusowymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej.