Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Ogólnym celem niniejszej procedury jest eksperymentalna dyssekcja, manipulacja oraz hodowla całych implantów siatkówki z embrionów kurczaka. Jest to realizowane poprzez najpierw pobranie obu oczu z embrionu kurczaka i umieszczenie ich w szalce Petriego. Drugim krokiem jest usunięcie twardówki oraz nabłonka pigmentowego za pomocą precyzyjnej pęsety.

Następnie cały eksplant siatkówki poddaje się elektroporacji plazmidowym DNA przy użyciu płaskich okrągłych elektrod. Ostatnim krokiem jest inkubacja eksplantu siatkówki w pożywce hodowlanej w płytce 24-dołkowej w inkubatorze.

Ostatecznie całe implanty siatkówki są utrwalane, mrożone i cięte w kriosie, a następnie analizowane za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu wizualizacji neuronów siatkówki. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak operacje elektrofizjologiczne in ovo, jest to, że jest ona szybka, łatwa do przeprowadzenia i zapewnia powtarzalne wyniki. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju ośrodkowego układu nerwowego, takie jak wpływ konkretnych odczynników chemicznych, np. inhibitorów enzymów lub produktów genowych celujących w cykl komórkowy, na neurogenezę po inkubacji.

Umieść jaja o pożądanym wieku embrionalnym w komorze z laminarnym przepływem powietrza i przetrzyj skorupki 70% etanolem, aby uniknąć kontaminacji zarodka. Mocno uderz bok jaja o twardą powierzchnię, aby rozbić skorupkę, a następnie przelej zawartość do szalki Petriego o średnicy 100 mm. Za pomocą małej łyżeczki przenieś zarodek do szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierającej uprzednio ogrzany do 37°C PBS, aby zapobiec wysychaniu tkanki.

Następnie należy odciąć głowę zarodka i umieścić 35 milimetrową szalkę Petriego zawierającą tkankę zarodkową pod stereomikroskopem binokularowym w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą precyzyjnej pincety należy wykonać nacięcie przez jamę ustną, brzusznie w stosunku do oka. Rozpoczynając od miejsca nacięcia, należy rozdarć tkankę otaczającą całe oko.

Następnie odciśnij nerw wzrokowy i wyjmij nienaruszone oko z oczodołu. Pobierz zarówno lewe, jak i prawe oko z tego samego zarodka, aby wykorzystać je odpowiednio jako oko kontrolne lub traktowane. Używając pęsety precyzyjnej, przenieś oczy za pomocą małej łyżeczki do nowej szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów zawierającej podgrzany wcześniej PBS.

Usunąć wszystkie tkanki wokół oka, w tym twardówkę. Następnie wykonać niewielkie nacięcie w nabłonku barwnowym w części grzbietowej oka, uważając, aby nie uszkodzić siatkówki nerwowej. Następnie delikatnie rozszerzyć otwór w nabłonku barwnowym, zaczynając od miejsca nacięcia.

Pozostaw soczewkę i całą siatkówkę przytwierdzone do ciała szklistego. Usuń nabłonek barwnikowy, zachowując szczególną ostrożność w obrębie ciała rzęskowego wokół źrenicy w przedniej części oka oraz wzdłuż szczeliny naczyniówkowej, ponieważ usunięcie tkanek z tych miejsc jest utrudnione. Włącz urządzenie do elektroforezy i ustaw napięcie na 15 V dla siatkówki w stadium 20–25 (hamburger i Hamilton) lub na 20 V dla siatkówki w stadium 26–27.

Następnie ustaw liczbę powtórzeń impulsu na pięć impulsów po 50 ms, z odstępami jednej sekundy między impulsami. Należy użyć generatora impulsów sterowanego pedałem nożnym, ponieważ obie ręce będą potrzebne do przytrzymania elektrod w odpowiednim miejscu. Podłącz dwie wykonane na zamówienie platynowe elektrody w kształcie łopatek do gniazda wyjściowego generatora impulsów.

Elektrody przedstawione tutaj zostały wykonane z platynowej blaszki o grubości 0,1 mm, a drut łączący o średnicy 0,8 mm był izolowany. Używając plastikowej rurki, ostrożnie przenieś cały eksplanty siatkówki do naczynia, wykorzystując pipetę z polietylenu pasterskiego z odciętym końcem. Unikaj używania końcówek do pipet, ponieważ siatkówka ma tendencję do przywierania do plastiku i rozrywania się.

Następnie, używając pipety 100 µL, ostrożnie usuń cały PBS otaczający eksplant siatkówki. Należy uważać, aby nie dotknąć siatkówki, aby uniknąć jej przerwania. Dodaj 100 µL rozcieńczonego roztworu plazmidu do QVE i upewnij się, że cały eksplant siatkówki jest pokryty roztworem.

Jeśli wypreparowany fragment siatkówki wypłynie na powierzchnię, delikatnie dociśnij go pęsetą. Za pomocą elektrod pęsetowych ustaw soczewkę tak, aby była skierowana na jedną ze ścianek naczynia vete, a nerw wzrokowy skieruj w stronę dna naczynia. Następnie umieść elektrodę dodatnią przed soczewką, a elektrodę ujemną za siatkówką, uważając, aby nie dotykać tkanki.

Przyłożyć prąd, naciskając pedał nożny, i sprawdzić, czy przy elektrodach pojawiły się pęcherzyki powietrza, co wskazuje na prawidłowy przepływ prądu. Za pomocą pipety 100 µL usunąć całą mieszaninę plazmidów z qve, uważając, aby nie uszkodzić siatkówki. Mieszaninę plazmidów można wykorzystać ponownie od trzech do pięciu razy po usunięciu plazmidu.

Napełnij vete uprzednio ogrzanym PBS. Użyj pęsety, aby delikatnie odseparować wycinek siatkówki od ścianki vete. Następnie za pomocą pipety z polietylenową końcówką przenieś cały wycinek siatkówki do płytki 24-dołkowej zawierającej jeden mililitr uprzednio ogrzanej pożywki.

W każdej studzience należy inkubować tylko jeden eksplant siatkówki. Eksplant siatkówki należy inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2 na inkubatorze obrotowym przy stałej prędkości 50 RPM. Rotacja zapewnia maksymalną ekspozycję na pożywkę i zapobiega przyleganiu siatkówki do dna płytki 24-dołkowej.

Po 24 godzinach hodowli w znacznej części nienaruszonej siatkówki widoczne były komórki dodatnie pod kątem GFP, ponieważ elektroporacja spowodowała pobranie plazmidu i ekspresję genu reporterowego w dużym obszarze siatkówki. Po wykonaniu przekrojów pojedyncze komórki dodatnie pod kątem GFP były łatwo wykrywalne wzdłuż osi podstawnej ACO siatkówki. Cały wycinek siatkówki można hodować przez około 24 godziny dłużej.

Czasy inkubacji mogą prowadzić do opóźnienia rozwojowego, malformacji morfologicznych, apoptozy, a w konsekwencji do dezintegracji siatkówki. Przekrój całego eksplantu siatkówki hodowanego przez 24 godziny został poddany immunobarwieniu na phospho histone three, widocznemu tutaj w kanale czerwonym; phospho histone three znakuje komórki w późnej fazie G2/M. Komórki dodatnie pod kątem pH three znaleziono po stronie apikalnej siatkówki, co jest zgodne z prawidłowym rozwojem siatkówki.

Jak pokazano tutaj, rozwój ten można zablokować poprzez dodanie inhibitora CDK1/2; inkubacja z inhibitorem przez cztery godziny przed obrazowaniem znacząco zmniejszyła liczbę komórek pH3-dodatnich w siatkówce po jej rozwoju. Technika ta została z sukcesem wykorzystana do badania raportowanej ekspresji genów z nowego plazmidu DNA oraz do traktowania eksplantów siatkówki odczynnikami chemicznymi, w tym regulatorami szlaku uszkodzeń DNA i cyklu komórkowego. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak elektroporacja in ovo, w celu dalszego potwierdzenia wyników.