Name: Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę izolacji i elektroporacji całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Technika ta umożliwia wprowadzanie DNA plazmidowego i badanie rozwoju siatkówki z wysoką powtarzalnością wyników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Barncancerfonden (PR2013-0104), Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond i St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.

Ten protokół jest wykonywany zgodnie z zaleceniami zawartymi w "Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych Stowarzyszenia do badań nad wzrokiem i okulistyką".
1. Obchodzenie się z jajami i zbieranie oczu
<ol>
	<li>Białe jaja Leghorn należy przechowywać w temperaturze 12-14 °C nie dłużej niż 1 tydzień. Jeśli to możliwe, użyj chłodzonej chłodziarki do wina do przechowywania zapłodnionych jaj. 
	Uwaga: Wyższe temperatury przechowywania prowadzą do nieprawidłowego rozwoju zarodków, podczas gdy niższe temperatury zwiększają śmiertelność. Wydłużony czas przechowywania zwiększa zarówno śmiertelność, jak i nieprawidłowy rozwój.</li>
	<li>Jaja należy inkubować w inkubatorze o temperaturze 37,5 °C i wilgotności 60% z delikatnym kołysaniem z częstotliwością 5 razy na 24 godziny.</li>
	<li>Wyjąć inkubowane jaja z inkubatora jaj w pożądanym wieku embrionalnym. 
	Uwaga: Wiek zarodka kurcząt określa się jako czas inkubacji i oznacza się go jako dni embrionalne (E) lub jako stadia (st), zgodnie z serią stadiów rozwojowych opisanych przez Hamburgera i Hamiltona12.</li>
	<li>Umieść wybrane jaja w okapie z przepływem laminarnym. Przetrzyj skorupkę jajka 70% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia zarodka. 
	Uwaga: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach aseptycznych, używając sterylnych roztworów <url>https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory" i </url> narzędzi.</li>
	<li>Mocno uderz bokiem jajka o twardą powierzchnię, aby je rozłupać. Umieść zawartość na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Za pomocą małej łyżeczki przenieś zarodek na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą wstępnie podgrzany (37 °C) 1x PBS, aby zapobiec wysuszeniu tkanki.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą tkankę zarodkową na dwuokularowym mikroskopie stereowizyjnym w kapturze z przepływem laminarnym. Odetnij głowę zarodkowi, ściskając szyję cienkimi kleszczami i wyrzuć ciało.</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczy, aby wykonać nacięcie przez usta, brzusznie do oka. Zaczynając od miejsca nacięcia, rozerwij tkankę otaczającą całe oko. Uszczypnij nerw wzrokowy i usuń nienaruszone oko z oczodołu. Należy pobrać zarówno lewe, jak i prawe oko z tego samego zarodka do wykorzystania jako oko kontrolne lub leczone.</li>
	<li>Za pomocą małej łyżeczki przenieś oczy na nową szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą wstępnie podgrzaną (37 °C) 1x PBS.</li>
</ol>
2. Przygotowanie całych eksplantatów siatkówki
<ol>
	<li>Użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć całą tkankę wokół oka, w tym anlagę twardówki. 
	Uwaga: Tkanka łatwo się odkleja, pozostawiając siatkówkę na ciele szklistym i soczewce z nienaruszonym nabłonkiem barwnikowym (ryc. 1A-B).</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczy, aby uszczypnąć małe nacięcie w nabłonku barwnikowym w grzbietowej części oka, nie uszkadzając siatkówki nerwowej (ryc. 1C).</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie rozerwać nabłonek barwnikowy, zaczynając od miejsca nacięcia, pozostawiając soczewkę i całą siatkówkę przyczepioną do ciała szklistego (ryc. 1D). Utrzymuj oko w cieple (37 °C) 1x PBS, aby ułatwić usunięcie nabłonka barwnikowego. 
	Uwaga: Nabłonek barwnikowy może być trudny do usunięcia, w szczególności wzdłuż ciała rzęskowego wokół źrenicy, w przedniej części oka i wzdłuż szczeliny naczyniówki. W związku z tym część nabłonka barwnikowego może pozostać na siatkówce nerwowej (ryc. 1E-F).</li>
</ol>
3. Leczenie całych eksplantatów siatkówki
<ol start="1">
	<li>Elektroporacja całych eksplantatów siatkówki 
	Uwaga: Elektroporację całych eksplantatów siatkówki można wykonać bezpośrednio po kroku 2.
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę zawierającą mieszankę składników odżywczych 1:1 DMEM:F12, 10% FBS, 10 U/ml penicyliny streptomycyny, 5 μg/ml insuliny i 2 mM L-glutaminy.</li>
		<li>Odetnij jednorazową plastikową kuwetę o pojemności 1,5 ml (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (lub dowolny mały pojemnik mogący pomieścić 300-400 μl roztworu) około 8 mm od dna za pomocą piły o cienkim ostrzu.</li>
		<li>Rozcieńczyć wybrany plazmid DNA w 1xDPBS do końcowego stężenia 0,1 μg/μl.</li>
		<li>Włącz elektroporator i ustaw parametry na 15 V dla siatkówki st20 – st25 (E3-E4) i 20 V dla siatkówki st26 – st27 (E5). Ustaw powtórzenia impulsów na 5 impulsów o długości impulsu 50 ms w odstępach 1 sekundy. Użyj generatora impulsów, który można sterować za pomocą pedału nożnego na podłodze, ponieważ do utrzymania elektrod na miejscu potrzebne będą obie ręce.</li>
		<li>Podłącz dwie platynowe elektrody w kształcie łopatek (płaskie, okrągłe o średnicy 4 mm) (Rysunek 2A) do gniazda wyjściowego w generatorze impulsów. 
		Uwaga: Elektrody platynowe użyte w tym protokole zostały wykonane przez warsztat uniwersytecki. Elektrody wykonano z platynowej płytki o grubości 0,1 mm "rondelles" (klasa platyny: 950 Pt/5 Cu). Przewód łączący 0,8 mm został zaizolowany za pomocą rurki z tworzywa sztucznego.</li>
		<li>Ostrożnie przenieś cały eksplant siatkówki z kroku 2.3 do kuwety (lub równoważnego małego pojemnika) za pomocą polietylenowej pipety Pasteura z odciętą końcówką, aby uzyskać odpowiedni rozmiar otworu końcówki dla eksplantatu siatkówki. Unikaj używania końcówek do pipet, ponieważ siatkówka ma tendencję do przyczepiania się do plastiku i rozrywania się.</li>
		<li>Użyj pipety o pojemności 100 μl, aby delikatnie usunąć cały 1x PBS otaczający eksplant siatkówki, uważając, aby nie dotknąć siatkówki, aby uniknąć rozerwania.</li>
		<li>Dodaj 100 μl roztworu plazmidu do kuwety, aby pokryć cały eksplant siatkówki. Delikatnie dociśnij eksplant siatkówki kleszczami, jeśli unosi się do góry. Użyj kleszczyków lub elektrod, aby ustawić soczewkę tak, aby była skierowana w stronę dowolnej strony kuwety, a nerw wzrokowy do dna kuwety.</li>
		<li>Umieść elektrodę dodatnią przed soczewką, a elektrodę ujemną za siatkówką (rysunek 2A), nie dotykając tkanki.</li>
		<li>Zastosuj prąd, naciskając pedał nożny. Sprawdź, czy na elektrodach nie ma pęcherzyków wskazujących na pomyślne rozładowanie.</li>
		<li>Użyj pipety o pojemności 100 μl, aby usunąć całą mieszaninę plazmidu z kuwety bez uszkadzania siatkówki. Mieszanina plazmidów może być ponownie użyta od trzech do pięciu razy.</li>
		<li>Napełnij kuwetę wstępnie podgrzanym (37 °C) 1x PBS. Użyj kleszczyków, aby delikatnie odłączyć eksplant siatkówki od ścianki kuwety. Po elektroporacji siatkówka bywa pokryta pęcherzykami, co sprawia, że przylega do ścianki kuwety.</li>
		<li>Za pomocą pipety Pasteura z polietylenu przenieść cały eksplant siatkówki do 24-dołkowej płytki zawierającej 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej na dołek. Inkubować jeden eksplant siatkówki na studzienkę.</li>
		<li>Inkubować eksplant siatkówki w temperaturze 37 °C na wytrząsarce rotatorowej, ze stałą prędkością 50 obr./min, w inkubatorze komórkowym z 5% CO2 przez 24 godziny. Rotacja ma na celu zapewnienie maksymalnej ekspozycji na podłoże i zapobieżenie przyleganiu siatkówki do dna płytki 24-dołkowej.</li>
		<li>Przejdź do kroku 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Traktowanie całych eksplantatów siatkówki odczynnikami chemicznymi 
	Uwaga: Obróbkę chemiczną całych eksplantatów siatkówki można przeprowadzić bezpośrednio po kroku 2.
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę zawierającą mieszankę składników odżywczych 1:1 DMEM:F12, 10% FBS, 10 U/ml penicyliny streptomycyny, 5 μg/ml insuliny i 2 mM L-glutaminy.</li>
		<li>Za pomocą małej łyżki przenieś eksplant siatkówki z kroku 2.3 do 24-dołkowej płytki zawierającej 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej na dołek. Inkubować jeden eksplant siatkówki na studzienkę.</li>
		<li>Inkubować cały eksplant siatkówki przez 60 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce rotatorowej, ze stałą prędkością 50 obr./min, w inkubatorze komórkowym z 5% stężeniem CO2 przed dodaniem odczynnika chemicznego lub nośnika.</li>
		<li>Przygotować roztwór chemiczny, na przykład Cdk1/2 inhibitor III, inhibitor progresji M-fazy13, o końcowym stężeniu 30 μM w DMSO.</li>
		<li>Wyjąć 24-dołkową płytkę zawierającą cały eksplant siatkówki z inkubatora komórkowego. Dodać 10 μl odczynnika chemicznego lub nośnika (DMSO) bezpośrednio do podłoża siatkówkowego, uzyskując końcowe stężenie 300 nM inhibitora Cdk1/2 III w 0,01% DMSO. Ręcznie obróć płytkę 24-dołkową, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie odczynnika chemicznego lub nośnika w roztworze.</li>
		<li>Inkubować eksplantaty siatkówki w temperaturze 37 °C na wytrząsarce rotatorowej, ze stałą prędkością 50 obr./min, w inkubatorze z 5% CO2 przez żądany czas (do 24 godzin).</li>
		<li>Przejdź do kroku 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Utrwalanie i zamrażanie całych eksplantatów siatkówki
<ol>
	<li>Wyjąć z inkubatora komórkowego 24-dołkową płytkę zawierającą cały eksplant siatkówki poddany działaniu środka.</li>
	<li>Użyj małej łyżeczki, aby przenieść eksplant siatkówki na 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml / studzienkę lodowato zimnego 4% paraformaldehydu w 1xPBS. Inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
	<li>Użyj małej łyżeczki, aby przenieść cały eksplant siatkówki na 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml / studzienkę lodowato 1xPBS w celu umycia siatkówki. Inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Użyj małej łyżeczki, aby przenieść cały eksplant siatkówki na 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml / studzienkę lodowato 30% sacharozy w 1xPBS. Inkubować na lodzie przez 1-3 godziny w zależności od dnia embrionalnego siatkówki. W przypadku siatkówek st20 – st25 (E3) inkubować przez 1 godzinę, starsze siatkówki wymagają dłuższego czasu inkubacji w sacharozy.</li>
	<li>Za pomocą małej łyżki przenieś cały eksplant siatkówki na folię parafinową zawierającą około 500 μl kriostatu do zamrażania. Usuń jak najwięcej sacharozy, delikatnie przesuwając eksplant siatkówki w pożywce zamrażającej za pomocą małej łyżki.</li>
	<li>Przenieś eksplant siatkówki do formy do zatapiania zawierającej medium zamrażające. Ustaw oko, aby ułatwić przyszłe sekcje. Umieść formę do osadzania zawierającą cały eksplant siatkówki na suchym lodzie, aż podłoże zamarznie w stanie stałym. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commu%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li>
<li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res+Dev+brain+re%22%5BJournal%5D)">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li>
<li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro%22%5BJournal%5D)">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+US%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+eye+re%22%5BJournal%5D)">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li>
<li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycl%22%5BJournal%5D)">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li>
<li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycl%22%5BJournal%5D)">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li>
<li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li>
<li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W pracy przedstawiono szczegółowy protokół preparacji, elektroporacji lub obróbki chemicznej oraz hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaków. Protokół ten jest łatwy, szybki i pozwala zarówno na wysoki wskaźnik sukcesu, jak i powtarzalne wyniki.
Elektroporacja całych eksplantatów siatkówki wytwarza duże obszary komórek, które wyrażają interesujący nas konstrukt genu. Łatwo jest prawidłowo ustawić elektrody i wystawić określoną część siatkówki na działanie okreś...

Siatkówka jest częścią ośrodkowego układu nerwowego i jest, dzięki swojej względnej prostocie i dobrze scharakteryzowanej architekturze komórkowej, popularnym modelem do badania rozwoju ośrodkowego układu nerwowego. Oko zarodka kurczaka jest stosunkowo duże w porównaniu z resztą zarodka. Dzięki temu jest łatwo dostępny in ovo do manipulacji eksperymentalnych, takich jak zastrzyki lub elektroporacja, i służy jako doskonałe narzędzie do zdobywania wiedzy na temat komórek siatkówki i biologii rozwoju in vivo. Pomimo tych głównych zalet, przeżywalność zarodków może być niska, gdy eksperymenty są inwazyjne, takie jak elektroporacja, wielokrotne wstrzyknięcia lub połączone manipulacje eksperymentalne.
Elektroporacja plazmidów DNA do zarodka kurczaka in ovo jest ważną i dobrze znaną techniką1. Pozwala na znakowanie neuronów, śledzenie losów komórek, a także dróg neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym i pozwala na ektopową ekspresję genów w celu analizy funkcji białek in vivo. Technika ta została wykorzystana do badań cewy nerwowej2, tyłomózgowia3 i siatkówki4. Elektroporacja siatkówki zarodkowej in ovo wiąże się z pewnymi trudnościami eksperymentalnymi, które są związane z sytuacją in vivo. Położenie oka, ze względu na fałdowanie czaszki zarodka, jest stosunkowo blisko serca. Ta bliskość zwiększa ryzyko zatrzymania krążenia po elektroporacji, a ryzyko to wzrasta wraz z wiekiem zarodka. Ponadto, aby uzyskać dostęp do oka, konieczne jest otwarcie błon embrionalnych, zwiększając w ten sposób ryzyko krwawienia, wad rozwojowych i późniejszego zmniejszenia żywotności. Podczas testowania i optymalizacji nowego plazmidu DNA, często bez znanego wyniku fenotypowego, ograniczenia te mogą zmniejszyć skuteczność i moc metody nawet dla doświadczonego eksperymentatora. Jak przedstawiono w niniejszym protokole, hodowla całego eksplantatu siatkówki, zdefiniowanego jako cała siatkówka nerwowa z usuniętym nabłonkiem barwnikowym, jest skuteczną metodą, która uzupełnia podejście in ovo.
Wewnątrzgałkowe wstrzyknięcia odczynników chemicznych są stosunkowo łatwe do wykonania w ovo. Jednak skuteczne i dokładne stężenie wstrzykiwanych odczynników w siatkówce nerwowej może być trudne do pełnej kontroli. Objętość wstrzykniętego odczynnika może się różnić ze względu na nieszczelność, a dokładne miejsce wstrzyknięcia może wpływać zarówno na rozprowadzanie odczynnika w oku, jak i na dyfuzję przez ciało szkliste. Zmienność będzie miała poważne implikacje dla interpretacji wyników, gdy np. zostanie określona krzywa dawka-odpowiedź dla inhibitora enzymu; Zwłaszcza, jeśli efekt jest niewielki, a okno czasowe efektu jest wąskie. Co więcej, podczas przeprowadzania eksperymentów in ovo można użyć tylko jednego oka z każdego zarodka ze względu na potencjalne skutki ogólnoustrojowe poprzez przepływ krwi na oko przeciwległe. Dopasowanie wieku jest ważne podczas badania rozwoju, a indywidualna zmienność między zarodkami poddanymi działaniu substancji i kontrolnych może prowadzić do dodatkowej zmienności eksperymentalnej.
Z tych powodów opracowano metodę ex ovo opartą na eksplantatach siatkówki z zarodków kurczaka, w której siatkówka nerwowa może być wystawiona na działanie jednolitych i kontrolowanych warunków eksperymentalnych in vitro. Niniejszy protokół został opracowany w oparciu o poprzednie protokoły5-9. Eksplantaty siatkówki od stadium (st) 20 (dni embrionalne [E] 3) do st31 (E7) zarodki kurczaków wypreparowano, wyhodowano i elektroporowano z określonym stężeniem plazmidu DNA lub wystawiono na działanie pożywki zawierającej określone stężenie odczynnika chemicznego. Przedstawiony tutaj protokół został z powodzeniem wdrożony w ostatnich publikacjach, przy użyciu kilku różnych odczynników chemicznych, w tym regulatorów szlaku uszkodzenia DNA, takich jak KU55933, SB 218078 i NSC 109555 ditosylat, oraz cyklu komórkowego, takiego jak inhibitor Cdk1/2 III10,11.

<table><tbody><tr><td>1xPBS (tablet)</td><td>Life technologies</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14080-048</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>734-0006</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>613-0798</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml jednorazowa plastikowa kuweta</td><td>Thomas Scientific</td><td>8495V01</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D7039</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>391-1998</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Solveco</td><td>1054</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/2 inhibitor III</td><td>217714</td><td>Calbiochem</td><td>300 nM w 0,01% DMSO</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Mikroskop</td> preparacyjny Thermo Forma <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody</td><td></td><td></td><td>Platina, wykonane na zamówienie</td></tr><tr><td>Electro square porator ECM 830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12 Mieszanka składników odżywczych</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>AgnThos</td><td>0108-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>Medium zamrażające NEG50</td><td>Cellab, Szwecja</td><td>6502</td><td></td></tr><tr><td>GFP z ekspresją plazmidu DNA (pZG)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nawilżany inkubator</td><td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Niemcy</td><td>8204</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe ProLong Gold z DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Folia parafinowa</td><td>VWR</td><td>291-1214P</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania Peel-A-Way&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6032</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfohiston 3 (PH3)&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>06-570</td><td>Rozcieńczenie 1/4 000</td></tr><tr><td>Elektrody platynowe (wykonane na zamówienie z "rondelles")</td><td>Sargenta</td><td>390-R (rondeller)</td><td>Średnica: 4 mm, grubość 0,1 mm</td></tr><tr><td>Elektrody Platimun&nbsp;</td><td>Sonidel</td><td>CUY700P4L</td><td>Średnica: 4 mm</td></tr><tr><td>Pipeta pasteura z polietylenu</td><td>VWR</td><td>612-2853</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka rotatorowa</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>Mała łyżka</td><td>VWR</td><td>231-2151</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>VWR</td><td>443815S</td><td></td></tr><tr><td>Białe jaja</td><td></td><td></td> Leghorn <td>Lokalny dostawca</td></tr><tr><td>Chłodziarka do wina</td><td>WineMaster 24, Caso, Berlin, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Siatkówka jest dobrym modelem dla rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego. Duży rozmiar oka, a co najważniejsze, dostępność do eksperymentalnych manipulacji in vo/in vivo sprawia, że siatkówka embrionalna kurczaka jest wszechstronnym i bardzo wydajnym modelem eksperymentalnym. Chociaż siatkówka kurczaka jest łatwa do namierzenia in ovo za pomocą wstrzyknięć wewnątrzgałkowych lub elektroporacji, skuteczne i dokładne stężenie odczynników w siatkówce może być trudne do pełnego kontrolowania. Może to być spowodowane zmianami w dokładnym miejscu wstrzyknięcia, wyciekiem z oka lub nierównomierną dyfuzją substancji. Co więcej, częstość wad rozwojowych i śmiertelności po inwazyjnych manipulacjach, takich jak elektroporacja, jest dość wysoka.
Ten protokół opisuje technikę ex ovo hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka i dostarcza metodę kontrolowanej ekspozycji siatkówki na odczynniki. Protokół opisuje, jak preparować, eksperymentalnie manipulować i hodować całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka. Eksplantaty można hodować przez około 24 godziny i poddawać różnym manipulacjom, takim jak elektroporacja. Główną zaletą jest to, że eksperyment nie jest zależny od przeżycia zarodka oraz że stężenie wprowadzonego odczynnika może być zmieniane i kontrolowane w celu określenia i optymalizacji skutecznego stężenia. Co więcej, technika ta jest szybka, tania, a w połączeniu z wysokim wskaźnikiem sukcesu eksperymentalnego zapewnia powtarzalne wyniki. Należy podkreślić, że stanowi ona doskonałe uzupełnienie eksperymentów przeprowadzanych in ovo.

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie (Rycina 1A-F) oraz hodowlę całych eksplantów siatkówki z embrionów kurczaka. Protokół ten został z sukcesem zastosowany w przypadku całych eksplantów siatkówki z embrionów od stadiów st20 (E3) do st31 (E7).
Elektroporacja plazmidów DNA do całych eksplantów siatkówki umożliwia znakowanie i śledzenie komórek progenitorowych siatkówki lub nadekspresję różnych produktów genowych. W eksperymentach z elektroporacją nabłonek pigmentowy został ...

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest eksperymentalna dyssekcja, manipulacja oraz hodowla całych implantów siatkówki z embrionów kurczaka. Jest to realizowane poprzez najpierw pobranie obu oczu z embrionu kurczaka i umieszczenie ich w szalce Petriego. Drugim krokiem jest usunięcie twardówki oraz nabłonka pigmentowego za pomocą precyzyjnej pęsety.Następnie cały eksplant siatkówki poddaje się elektroporacji plazmidowym DNA przy użyciu płaskich okrągłych elektrod. Ostatnim krokiem jest inkubacja eksplantu siatkówki w pożywce hodowlanej w płytce 24-dołkowej w inkubatorze.Ostatecznie całe implanty siatkówki są utrwalane, mrożone i cięte w kriosie, a następnie analizowane za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu wizualizacji neuronów siatkówki. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak operacje elektrofizjologiczne in ovo, jest to, że jest ona szybka, łatwa do przeprowadzenia i zapewnia powtarzalne wyniki. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju ośrodkowego układu nerwowego, takie jak wpływ konkretnych odczynników chemicznych, np. inhibitorów enzymów lub produktów genowych celujących w cykl komórkowy, na neurogenezę po inkubacji.Umieść jaja o pożądanym wieku embrionalnym w komorze z laminarnym przepływem powietrza i przetrzyj skorupki 70% etanolem, aby uniknąć kontaminacji zarodka. Mocno uderz bok jaja o twardą powierzchnię, aby rozbić skorupkę, a następnie przelej zawartość do szalki Petriego o średnicy 100 mm. Za pomocą małej łyżeczki przenieś zarodek do szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierającej uprzednio ogrzany do 37°C PBS, aby zapobiec wysychaniu tkanki.Następnie należy odciąć głowę zarodka i umieścić 35 milimetrową szalkę Petriego zawierającą tkankę zarodkową pod stereomikroskopem binokularowym w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą precyzyjnej pincety należy wykonać nacięcie przez jamę ustną, brzusznie w stosunku do oka. Rozpoczynając od miejsca nacięcia, należy rozdarć tkankę otaczającą całe oko.Następnie odciśnij nerw wzrokowy i wyjmij nienaruszone oko z oczodołu. Pobierz zarówno lewe, jak i prawe oko z tego samego zarodka, aby wykorzystać je odpowiednio jako oko kontrolne lub traktowane. Używając pęsety precyzyjnej, przenieś oczy za pomocą małej łyżeczki do nowej szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów zawierającej podgrzany wcześniej PBS.Usunąć wszystkie tkanki wokół oka, w tym twardówkę. Następnie wykonać niewielkie nacięcie w nabłonku barwnowym w części grzbietowej oka, uważając, aby nie uszkodzić siatkówki nerwowej. Następnie delikatnie rozszerzyć otwór w nabłonku barwnowym, zaczynając od miejsca nacięcia.Pozostaw soczewkę i całą siatkówkę przytwierdzone do ciała szklistego. Usuń nabłonek barwnikowy, zachowując szczególną ostrożność w obrębie ciała rzęskowego wokół źrenicy w przedniej części oka oraz wzdłuż szczeliny naczyniówkowej, ponieważ usunięcie tkanek z tych miejsc jest utrudnione. Włącz urządzenie do elektroforezy i ustaw napięcie na 15 V dla siatkówki w stadium 20–25 (hamburger i Hamilton) lub na 20 V dla siatkówki w stadium 26–27.Następnie ustaw liczbę powtórzeń impulsu na pięć impulsów po 50 ms, z odstępami jednej sekundy między impulsami. Należy użyć generatora impulsów sterowanego pedałem nożnym, ponieważ obie ręce będą potrzebne do przytrzymania elektrod w odpowiednim miejscu. Podłącz dwie wykonane na zamówienie platynowe elektrody w kształcie łopatek do gniazda wyjściowego generatora impulsów.Elektrody przedstawione tutaj zostały wykonane z platynowej blaszki o grubości 0,1 mm, a drut łączący o średnicy 0,8 mm był izolowany. Używając plastikowej rurki, ostrożnie przenieś cały eksplanty siatkówki do naczynia, wykorzystując pipetę z polietylenu pasterskiego z odciętym końcem. Unikaj używania końcówek do pipet, ponieważ siatkówka ma tendencję do przywierania do plastiku i rozrywania się.Następnie, używając pipety 100 µL, ostrożnie usuń cały PBS otaczający eksplant siatkówki. Należy uważać, aby nie dotknąć siatkówki, aby uniknąć jej przerwania. Dodaj 100 µL rozcieńczonego roztworu plazmidu do QVE i upewnij się, że cały eksplant siatkówki jest pokryty roztworem.Jeśli wypreparowany fragment siatkówki wypłynie na powierzchnię, delikatnie dociśnij go pęsetą. Za pomocą elektrod pęsetowych ustaw soczewkę tak, aby była skierowana na jedną ze ścianek naczynia vete, a nerw wzrokowy skieruj w stronę dna naczynia. Następnie umieść elektrodę dodatnią przed soczewką, a elektrodę ujemną za siatkówką, uważając, aby nie dotykać tkanki.Przyłożyć prąd, naciskając pedał nożny, i sprawdzić, czy przy elektrodach pojawiły się pęcherzyki powietrza, co wskazuje na prawidłowy przepływ prądu. Za pomocą pipety 100 µL usunąć całą mieszaninę plazmidów z qve, uważając, aby nie uszkodzić siatkówki. Mieszaninę plazmidów można wykorzystać ponownie od trzech do pięciu razy po usunięciu plazmidu.Napełnij vete uprzednio ogrzanym PBS. Użyj pęsety, aby delikatnie odseparować wycinek siatkówki od ścianki vete. Następnie za pomocą pipety z polietylenową końcówką przenieś cały wycinek siatkówki do płytki 24-dołkowej zawierającej jeden mililitr uprzednio ogrzanej pożywki.W każdej studzience należy inkubować tylko jeden eksplant siatkówki. Eksplant siatkówki należy inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2 na inkubatorze obrotowym przy stałej prędkości 50 RPM. Rotacja zapewnia maksymalną ekspozycję na pożywkę i zapobiega przyleganiu siatkówki do dna płytki 24-dołkowej.Po 24 godzinach hodowli w znacznej części nienaruszonej siatkówki widoczne były komórki dodatnie pod kątem GFP, ponieważ elektroporacja spowodowała pobranie plazmidu i ekspresję genu reporterowego w dużym obszarze siatkówki. Po wykonaniu przekrojów pojedyncze komórki dodatnie pod kątem GFP były łatwo wykrywalne wzdłuż osi podstawnej ACO siatkówki. Cały wycinek siatkówki można hodować przez około 24 godziny dłużej.Czasy inkubacji mogą prowadzić do opóźnienia rozwojowego, malformacji morfologicznych, apoptozy, a w konsekwencji do dezintegracji siatkówki. Przekrój całego eksplantu siatkówki hodowanego przez 24 godziny został poddany immunobarwieniu na phospho histone three, widocznemu tutaj w kanale czerwonym; phospho histone three znakuje komórki w późnej fazie G2/M. Komórki dodatnie pod kątem pH three znaleziono po stronie apikalnej siatkówki, co jest zgodne z prawidłowym rozwojem siatkówki.Jak pokazano tutaj, rozwój ten można zablokować poprzez dodanie inhibitora CDK1/2; inkubacja z inhibitorem przez cztery godziny przed obrazowaniem znacząco zmniejszyła liczbę komórek pH3-dodatnich w siatkówce po jej rozwoju. Technika ta została z sukcesem wykorzystana do badania raportowanej ekspresji genów z nowego plazmidu DNA oraz do traktowania eksplantów siatkówki odczynnikami chemicznymi, w tym regulatorami szlaku uszkodzeń DNA i cyklu komórkowego. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak elektroporacja in ovo, w celu dalszego potwierdzenia wyników.

whole-retinal-explants-from-chicken-embryos-for-electroporation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Opisano metodę transferu genów do embrionów kurcz uklutych na późniejszych etapach inkubacji (starszych niż stadium Hamburgera i Hamiltona (HH) 22). Metoda ta eliminuje wady elektroporacji in ovo stosowanej u starszych embrionów kurczych i stanowi przydatną technikę badania funkcji i regulacji genów na późniejszych etapach rozwoju.

Transfer genów do starszych zarodków kur w metodzie elektroporacji ex ovo

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Opisujemy metody fluorescencyjnego znakowania stycznie migrujących komórek za pomocą elektroporacji, oraz obrazowania poklatkowego ruchu oznaczonej komórki w hodowli płaskiej w celu wizualizacji zachowania migrujących komórek w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt.

Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt

Opisujemy metodę uzyskiwania pierwotnych kultur fotoreceptorów czopków z siatkówki zarodków kurczaków i jej wykorzystanie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości.

Hodowle wzbogacone w stożki z siatkówki zarodków kurczaka w celu zbadania interakcji komórkowych między pręcikami a czopkami

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Ten artykuł o protokole opisuje metodologię mikroiniekcji retrowirusa RCAS(A) do embrionalnej soczewki kurczaka jako narzędzia do badania funkcji in situ i ekspresji białek podczas rozwoju soczewki.

Mikroiniekcja rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka

Poznaj metodę izolacji i elektroporacji całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Technika ta umożliwia wprowadzanie DNA plazmidowego i badanie rozwoju siatkówki z wysoką powtarzalnością wyników.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Przeglądaj więcej filmów