Nowy model hodowli do namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie w pożywkach kondycjonowanych łożyskiem

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opisanie sposobu masowej produkcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu prostej i opłacalnej powłoki żelatynowej. Osiąga się to poprzez wyizolowanie kosmówki VII z tkanek ludzkiego łożyska, a następnie rozdrobnienie willi na małe kawałki tkanki w drugim kroku. Fragmenty tkanek są hodowane na płytkach pokrytych żelatyną, gdzie w ciągu pięciu do siedmiu dni tworzą kolonie przylegających fibroblastów, takich jak komórki, a następnie są wykorzystywane do produkcji kondycjonowanych pożywek do hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Następnie 80 do 100 kępek ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych jest wysiewanych pokrytych ludzkimi komórkami pochodzącymi z łożyska, kondycjonowanych, pożywki i subkultury raz na cztery do pięciu dni. Wyniki wskazują na podobne różnicowanie i przyłączanie komórek wyhodowanych w warunkach złotego standardu w porównaniu z opisaną tutaj metodą komórek hodowanych na płytkach pokrytych żelatyną w pożywce kondycjonowanej ludzkim łożyskiem. Główną przewagą tej techniki nad metodą dostępową jest to, że wykorzystuje ona składniki wydzielane z komórek ludzkich bez konieczności dodatkowej suplementacji egzogennej i syntetycznej cechy miękkiej.

Aby rozpocząć powlekanie naczyń hodowlanych T 25 pięcioma mililitrami 0,1% roztworu żelatyny przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, następnie wysterylizuj 500 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, parę kleszczy, nożyczki chirurgiczne, mikroprobówki wirówkowe i gazę przez autoklawowanie ich w 121 stopniach Celsjusza poniżej 15 funtów PSI przez ponad 15 minut. Następnie wstępnie ogrzany sterylny filtrowany DMEM zawierający 20% płodowej surowicy bydlęcej. 100 jednostek na mililitr penicyliny i 100 gramów na mililitr.

Streptomycyna otrzymuje chirurgicznie oddzielone płytki kosmówkowe ludzkiego łożyska pobrane od zdrowych kobiet w ciąży w siódmym do 32 tygodniu ciąży. Po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody umyj płytki pięcioma mililitrami PBS za pomocą nożyczek. Odizoluj kosmówkę VII od płytki kosmówkowej ludzkiego łożyska i zmiel tkankę na drobne kawałki.

Następnie umyj kawałki tkanki trzy razy, używając jednego mililitra PBS na każde płukanie, umieść zmielony VII w mikroprobówce wirówkowej i za pomocą pipety przemyj próbki 500 mikrolitrami PBS, delikatnie pipetując w górę iw dół. Następnie odwiruj probówkę o sile 120 g przez trzy minuty, aby ściągnąć zmielone oko vi. Przemyć tkankę jeszcze dwukrotnie 500 mikrolitrami wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej, powtarzając wirówkę.

Pomiędzy każdą kulturą mycia, tkanką mieloną i podłożem należy umieścić na wcześniej przygotowanych płytkach pokrytych żelatyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po około pięciu do siedmiu dniach hodowli w tym samym podłożu, po siedmiu dniach można zaobserwować tworzenie się fibroblastów, takich jak kolonie podlegające przylegającemu wzrostowi. W wymianie kulturowej.

Pożywka podczas hodowli usuwa wszelkie pływające resztki komórek, gdy rosnący fibroblast łożyskowy przyczepi się do płytki, kontynuuj wymianę pożywki co dwa do trzech dni, aż do trzeciej hodowli pasażowej. Komórki podobne do fibroblastów pochodzące z płytki kosmówkowej ludzkiego łożyska do 10. pasażu. Następnie zbierz je z trypsyną, aby wykorzystać je jako próbki podstawowe do hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych po wykluczeniu zanieczyszczenia, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym, jednorazowo od 10 do siódmych komórek na płytce i hodowli T 75, komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż osiągną 85 do 90% zlewania się.

Potraktuj przyczepione komórki 10 mikrogramami na mililitr mitomycyny C przez dwie i pół godziny, a następnie umyj komórki trzy razy 10 mililitrami wstępnie podgrzanego PBS. Następnie inkubować komórki w podgrzanym podłożu bez mitomycyny C przez 24 godziny jednego dnia po zabiegu. Zastąp pożywkę na ogniwach 10 mililitrami Dmf.

12 pożywek uzupełnionych 20% zamiennikiem surowicy, 0,1 milimolowym beta merkaptoetanolem, 1% NEAA i 1% penicyliny streptomycyny. Po 24 godzinach inkubacji zebrać pożywkę kondycyjną w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i przefiltrować ją za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości 0,22 mikrona. Następnie dodaj kolejne 10 mililitrów świeżej pożywki do komórek i kontynuuj ich inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Zbieraj wszystkie supernatanty z kultur codziennie przez tydzień przez tydzień i zamrażaj zebrane podłoże w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Za każdym razem zamrażaj pożywkę w nowym pojemniku. Aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, należy uzyskać linię ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, taką jak linia H one, i rozpocząć ich hodowlę, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi hodowli w grupach eksperymentalnych.

Te same komórki na 0,1% płytkach pokrytych żelatyną w hodowli komórkowej pochodzącej z łożyska. Podłoże, rutynowe pakowanie należy wykonywać raz na pięć dni przy użyciu standardowych metod pakowania mechanicznego. Przejdź przez komórki kontrolne od jednego do czterech, a grupę eksperymentalną od jednego do sześciu i od jednego do 10.

Codziennie wymieniaj pożywkę na świeżą, pożywkę. Początek drugiego dnia. Ludzkie pluripotencjalne linie komórek macierzystych mogą być utrzymywane na 0,1% płytkach pokrytych żelatyną w hodowli komórek pochodzących z ludzkiego łożyska, na poziomie podobnym do obserwowanego dla komórek utrzymywanych w typowej hodowli komórek macierzystych.

Pożywka na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej w celu potwierdzenia, że pożywka do hodowli komórek pochodzących z ludzkiego łożyska uzyskała dostęp do innych matryc. Komórki macierzyste zostały wyhodowane na nin in lamina in vitro i naczyniach niepowlekanych. Komórki przyczepiły się i rosły na laminacie i naczyniach pokrytych in vitro nin.

Jednak po kilku przejściach wiele kolonii zostało zróżnicowanych. W przeciwieństwie do tych z grupy pokrytej żelatyną. Po przeniesieniu do niepowlekanych naczyń nie zaobserwowano przyczepienia komórek macierzystych.

Pokazane tutaj linie komórkowe H one i IPSE hodowano przez 10 pasaży w warunkach eksperymentalnych. Po dwóch tygodniach utworzyły ciała zarodka, które zawierały mezodermę, ektodermę i endodermę, mierzone za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią ludzkich komórek macierzystych do zbadania zastosowań klinicznych.

Od czasu tej metody, jajowate nie są zanieczyszczone produktem zwierzęcym.