Name: Nowy model hodowli do namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie w pożywkach kondycjonowanych łożyskiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Naucz się hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie z użyciem pożywek kondycjonowanych łożyskiem. Ta metoda eliminuje potrzebę stosowania syntetycznych substratów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Soon-Cheol Hong (M.D., Ph.D., Associate Professor, Wydział Położnictwa i Ginekologii, Medical College Korea University) za dostarczenie tkanki łożyska. Prace te były częściowo wspierane przez granty (R1211902) z Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) z Republiki Korei.

Oświadczenie etyczne: Badanie ludzkiego łożyska zostało przeprowadzone prospektywnie, za zgodą Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej ds. badań na ludziach Uniwersytetu Koreańskiego (AN09085-001). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w pomieszczeniu Clean Germ-Free w Centrum Medycznym Uniwersytetu Koreańskiego. Projekt eksperymentu i procedury z wykorzystaniem hPSC zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of the Korea University Medical Center (AN12277-003).
1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw
<ol>
	<li>Posmaruj wszystkie szalki hodowlane 0,1% żelatyną. Autoklaw z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i kleszcze. Sterylizuj nożyczki chirurgiczne, probówki do mikrowirówek i gazę w temperaturze 121 °C poniżej 15 funtów psi przez ponad 15 minut.</li>
	<li>Przygotowany wstępnie podgrzany 0,25% kwas tetraoctowy trypsynoaminoaminowy (trypsyna-EDTA) i wstępnie podgrzane przefiltrowane podłoże hodowlane (DMEM) zawierające 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 g/ml streptomycyny przed rozpoczęciem procedur.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek z ludzkiego łożyska
<ol>
	<li>Pobranie tkanki łożyska po cesarskim cięciu od zdrowych kobiet w ciąży poddawanych aborcji normalnej lub terapeutycznej w 7–32 tygodniu ciąży po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody.</li>
	<li>Zleć specjaliście położnictwa chirurgiczne oddzielenie ludzkich płytek kosmówkowych łożyska (HPC) od łożyska; inkubować je w 0,25% trypsyno-EDTA w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie przemyć 5 ml PBS.</li>
	<li>Wyizolować kosmki kosmówkowe od HPC za pomocą nożyczek; zmielić kosmki i umyć je trzykrotnie 1 ml PBS. Po rozdrobnieniu umieść kosmki kosmówkowe w probówce do mikrofugi za pomocą końcówki pipety; przepłukać próbki 500 μl PBS, pipetując w górę i w dół, a następnie odwirować probówki o masie 120 x g przez 3 minuty. Umyć tkanki dwukrotnie 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Hodowla komórek w pożywce na płytkach pokrytych żelatyną w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 i przy wilgotności 95%. Wstępnie pokryj wszystkie płytki 0,1% żelatyną przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Kolonie komórek podobnych do fibroblastów utworzą się i zaczną przylegać do wzrostu około 5-7 dni po rozpoczęciu hodowli w tym samym podłożu.</li>
	<li>Wymieniaj pożywkę co 2-3 dni, aż do trzeciego przejścia. Podczas hodowli, usuwanie resztek komórkowych unoszących się w pożywce hodowlanej; Rosnące fibroblasty łożyska przyczepią się do płytki. Hodowla komórek podobnych do fibroblastów pochodzących z HPC do 10. pasażu, a następnie pobranie ich do kultur hESC po trypsynizacji i podaniu mitomycyny-C (10 μg/ml) charakteryzacji.</li>
	<li>Przed zamrożeniem HPC jako próbek podstawowych należy zastosować reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) w celu potwierdzenia, że HPC nie są zanieczyszczone patogenami, które powszechnie infekują łożysko, w tym mykoplazmami (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginina, M. orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae i M. capricolum) oraz gatunkami bakterii, Ureaplasmaurealyticum, przy użyciu zestawu do wykrywania mykoplazmy.
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wykonać RT-PCR, użyj wszystkich starterów i mieszanin dostarczonych w zestawie. Do wykrywania mykoplazmy należy użyć supernatantów komórek, które były hodowane przez 36 dni. Dodać 3 μl tych próbek do mieszanin PCR i przeprowadzić procedurę 1st PCR przez 35 cykli, z których każdy składa się z 94 °C przez 30 sekund, 55 °C przez 2 min i 72 °C przez 1 min.</li>
		<li>Ostrożnie dodać 0,5 μl 1. produktu PCR do mieszaniny PCR i wykonać procedurę 2. sesji PCR przez 30 cykli w tych samych warunkach, co poprzednio. Analizować amplifikowane produkty za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym; nanieść 10 μl każdego z 1. i 2. produktu PCR na żele.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli okaże się, że HPC są skażone patogenami, należy je wyeliminować za pomocą kombinacji antybiotyków (BM-Cyclin), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać nową pożywkę zawierającą 10 μg/ml BM-Cykliny 1 przez 3 dni, a następnie traktować komórki 5 μg/ml BM-Cykliny 2 przez kolejne 4 dni. Powtórz ten cykl dwukrotnie, a następnie ponownie sprawdź, czy nie ma zanieczyszczenia mykoplazmą.</li>
</ol>
3. Zbieranie pożywki kondycjonowanej komórkami pochodzącymi z ludzkiego łożyska (hPCCM)
<ol>
	<li>Po wykluczeniu zanieczyszczenia należy potraktować przyczepione komórki (85-90% zbiegu; (1,5 × 107 komórek/kolbę) mitomycyną-C (10 μg/ml) przez 2 godziny i 30 minut, a następnie przemyć komórki trzykrotnie 10 ml PBS. Inkubować komórki z podgrzaną pożywką bez mitomycyny-C przez 24 godziny.</li>
	<li>Jednego dnia po leczeniu inkubować komórki w 10 ml pożywki (DMEM-F12 uzupełniony 20% zamiennikiem surowicy nokautującej [KOSR], 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 1% NEAA i 1% penicyliny-streptomycyny). Po 24 godzinach inkubacji zebrać CM do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przefiltrować CM za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.</li>
	<li>Dodać kolejne 10 ml nowej pożywki i inkubować. Zebrać wszystkie supernatanty z kultur codziennie przez 1 tydzień i zamrozić zebrane podłoże w temperaturze –80 °C. Unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
4. Hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukcja pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)
<ol>
	<li>Pozyskać linie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, komórki H1 i H9 (wymienione w rejestrze NIH hESC odpowiednio pod nazwą WA01 i WA09) oraz indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste iPSC-1: iPS (napletek)-1 i iPSC-2 (IISH1i-BM) z Instytutu Badawczego WiCell (Madison, WI, USA). Komórki należy rozmrozić i wyhodować zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Dla grupy kontrolnej, komórki hodowlane na szalkach pokrytych matrycą błony podstawnej w powszechnie stosowanej pożywce hodowlanej bez karmnika i surowicy w temperaturze 37 °C i w 5% CO2 . Początkowo wysiewa się 80-100 kęp hPSC w szalkach o średnicy 35 mm. Hoduj komórki w tych naczyniach do 70-80% zbiegu i rutynowo pasażuj komórki do podhodowli raz na 5-6 dni, stosując metody mechaniczne lub enzymatyczne (Dispase). Umyj komórki dwukrotnie pożywką i pokryj je płytką w stosunku 1:4. Codziennie wymieniaj pożywkę na świeżą.</li>
	<li>W przypadku grup eksperymentalnych hoduje się komórki w hPCCM na szalkach wstępnie pokrytych 0,1% żelatyną i przeprowadza rutynowe pasażowanie raz na 5 dni, mechanicznie lub enzymatycznie. Płytki komórkowe w proporcjach w zakresie 1:6–1:10. Komórki komórkowe łączą się z żelatyną w ciągu 2 dni po przeniesieniu. Codziennie zastępuj pożywkę świeżą pożywką.</li>
</ol>
5. Charakterystyka ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
UWAGA: Scharakteryzuj hPSC za pomocą kilku metod, takich jak barwienie fosfatazą alkaliczną, immunocytochemia, ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i western blotting.
<ol>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne
	<ol>
		<li>W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego należy wyhodować hPSC i utrwalić komórki w 8-dołkowych komorach szkiełkowych z 4% (w/v) paraformaldehydem przez 10 minut; następnie przesiąknąć komórki 0,1% (v/v) Triton-X100 przez 15 minut i zablokować komórki na 1 godzinę 3% (v/v) normalnej surowicy końskiej w PBS zawierającej 0,1% (v/v) Tween-20. Umyj PBS dwa razy przez 5 minut między każdym krokiem.</li>
		<li>Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym (OCT-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, rozcieńczenie 1:1 000) O/N w temperaturze 4 °C i z przeciwciałem drugorzędowym.</li>
		<li>Przed zamontowaniem inkubować komórki z 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) przez 5 minut w ciemności. Umyj komórki dokładnie trzy razy przez 5 minut każde i całkowicie wysusz komórki w ciemności. Zachowaj komórki w pożywce do montażu fluorescencji i obserwuj je pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>qRT-PCR (Badanie qRT-PCR)
	<ol>
		<li>Wyizoluj całkowite RNA z komórek za pomocą mini zestawu RNeasy zgodnie ze specyfikacją producenta i określ ilościowo wyekstrahowane RNA za pomocą spektrofotometru Nano Drop.</li>
		<li>Zsyntetyzować cDNA, dodając 2 μg całkowitego RNA do 20-μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej startery oligo(dT) i odwrotną transkryptazę indeksu górnego II; postępować zgodnie z instrukcjami producenta w tej procedurze.</li>
		<li>Amplifikować zsyntetyzowany cDNA za pomocą systemu Bio-Rad iCycler iQ, przy użyciu iQ SYBR Green qPCR Master Mix i sekwencji starterów opisanych w tabeli uzupełniającej S1. Znormalizuj wartości progowe cyklu genów będących przedmiotem zainteresowania do wartości dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie fosfatazą alkaliczną (AP)
	<ol>
		<li>Wykrywanie aktywności AP za pomocą zestawu do charakteryzacji komórek ES, zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>W 5 dniu odessać pożywkę i utrwalić hPSC za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 12 minut. Nie przesadzaj; Utrwalanie komórek na dłużej niż 2 minuty spowoduje inaktywację fosfatazy alkalicznej. Odessać utrwalacz i spłukać 1x buforem do płukania. Nie pozwól, aby studzienki wyschły między stopniami.</li>
		<li>Dodać tyle roztworu barwiącego, aby pokryć każdą studzienkę (1 ml na dołek naczynia o średnicy 35 mm). Inkubować płytki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Po inkubacji umyj naczynia 1x buforem do płukania. Przykryj komórki 1x PBS, aby zapobiec wysuszeniu, a następnie zbadaj i zobrazuj wybarwione komórki za pomocą mikroskopu Olympus.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western Blot (Zachodnia plama)
	<ol>
		<li>Wykonaj analizę western blot zgodnie z wcześniejszym opisem wpunkcie 9. Krótko mówiąc, określ stężenia białek w lizatach komórkowych. Rozpuść równe ilości białka w żelu do elektroforezy w żelu z dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE) i przenieś białka na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF).</li>
		<li>Zablokować blot i zbadać go O/N różnymi pierwszorzędowymi przeciwciałami w temperaturze 4 °C; następnie inkubować blot z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z HRP przez 1 godzinę. Przemyć błonę trzy razy przez 10 minut za każdym razem między inkubacjami. Wykrywanie sygnałów za pomocą odczynnika ECL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza krótkich powtórzeń tandemowych (STR)
	<ol>
		<li>hPSC pobrano z grupy kontrolnej i eksperymentalnej w tym samym przejściu. Genomowe DNA zostało wyekstrahowane przy użyciu zestawu DNA Micro, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Amplifikacja genomowego DNA dla 16 różnych loci genetycznych za pomocą zestawu do amplifikacji AmpF/STR PCR, zgodnie ze specyfikacją producenta, a elektroforezę kapilarną przeprowadzono przy użyciu analizatora genetycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).</li>
<li>Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itskovitz-Eldor+Feeder+layer+and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).</li>
<li>Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+pluripotent+stem+cells+using+completely+defined+conditions+on+a+recombinant+E-cadherin+substratum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum.</a> BMC Dev Biol. 10, 60(2010).</li>
<li>Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic%2C+xeno-free+peptide+surface+for+expansion+and+directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (11), e50880(2012).</li>
<li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+supports+undifferentiated+human+embryonic+stem+cell+growth+without+conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium.</a> Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).</li>
<li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cells+can+support+the+undifferentiated+growth+of+human+and+mouse+embryonic+stem+cells+using+their+own+basic+fibroblast+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors.</a> Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+human+placenta+as+a+source+of+the+universal+feeder+in+human+and+mouse+pluripotent+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture.</a> Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undifferentiated+propagation+of+the+human+embryonic+stem+cell+lines%2C+H1+and+HSF6%2C+on+human+placenta-derived+feeder+cells+without+basic+fibroblast+growth+factor+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation.</a> Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).</li>
<li>Seok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+placenta-derived+feeders+support+prolonged+undifferentiated+propagation+of+a+human+embryonic+stem+cell+line%2C+SNUhES3%3A+comparison+with+human+bone+marrow-derived+feeders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders.</a> Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).</li>
<li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li>
<li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).</li>
<li>Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+differentiation+of+stem+cells+mesenchymal+progenitors+by+inhibition+of+TGF-beta%2Factivin%2Fnodal+using+SB-431542%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542.</a> J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).</li>
</ol>

Autorzy wskazują na brak konfliktu interesów.

Model ten został opracowany w celu pomyślnego rozmnażania hPSC, przy jednoczesnym zachowaniu ich cech, w humanizowanych warunkach hodowli bez karmienia bez dodatku egzogennych rekombinowanych czynników wzrostu, takich jak bFGF lub insulina, umożliwiając manipulację hPSC w humanizowanym mikrośrodowisku. Egzogenna suplementacja bFGF jest powszechna, a stosowanie substratów, takich jak Matrigel lub laminina, jest niezbędne do hodowli hPSC bez karmienia14.
Ten protokół jest prosty i łat...

Celem tego protokołu jest rozmnażanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), w tym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w pełni humanizowanych warunkach ex vivo, bez konieczności dodatkowej suplementacji egzogennej i syntetycznych substratów. Do tej pory opracowanie modeli hodowli hPSC ex vivo, które umożliwiają wprowadzenie produktów hodowlanych do praktyki klinicznej, było głównym problemem w badaniach nad komórkami macierzystymi. W szczególności należy zająć się dwoma krytycznymi problemami. Po pierwsze, potrzebny jest humanizowany system hodowli ex vivo do namnażania hPSC, który eliminuje ryzyko zanieczyszczenia produktami z komórek zwierzęcych. Po drugie, potrzebny jest model hodowli bez karmowania, aby ułatwić łatwą i ekonomiczną masową produkcję hPSC. Do zastosowań terapeutycznych hPSC konieczne jest zidentyfikowanie czynników regulujących ich samoodnawianie i różnicowanie.
Ponieważ Xu i in. początkowo podawali możliwość użycia kondycjonowanych pożywek (CM) pochodzących z mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) do hodowli hESC na Matrigel1, wiele badań analizowało optymalne metody rozmnażania ex vivo dla hPSCs2-4. Jednak idealny, humanizowany, wolny od karmienia system rozmnażania hPSC ex vivo nie został opracowany, ponieważ obecne metody wymagają dodatkowych substratów egzogennych, w tym bFGF i insuliny, dobrze znanych czynników podtrzymujących hPSC, w pożywkach hodowlanych5-7. Ponadto podłoża syntetyczne, takie jak Matrigel lub laminina, są stosowane we wszystkich kulturach bezkarmowych.
Uzasadnienie dla rozwoju i stosowania tego protokołu opiera się na naszych poprzednich badaniach, które wykazały, że ludzkie komórki kosmówkowe łożyska doskonale wspierają propagację hPSC bez suplementacji bFGF8-11. Protokół ten ma wiele zalet, w tym prostotę obsługi i opłacalność, a także jest to niemal idealna humanizowana kultura, która umożliwia rozmnażanie hPSC bez egzogennych substratów syntetycznych. Zastosowanie CM pochodzącego z ludzkiego łożyska (hPCCM) w przypadku hPSC obejmuje 3 etapy. Najpierw komórki kosmówki są izolowane z ludzkiego łożyska i hodowane. Po drugie, hPCCM jest wytwarzany z hodowanych komórek. Po trzecie, hPSC są hodowane przy użyciu hPCCM i potwierdza się ich charakterystykę. 
Ten protokół ułatwi kliniczne zastosowania hPSC oraz badania mechanizmów proliferacji i przyłączania hPSC. W artykule przedstawiono protokół pomyślnej namnażania hPSC w hPCCM na szalce pokrytej żelatyną.

<table><tbody><tr><td>Mitomycyna-C</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>M4287</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>zestaw do wykrywania mykoplazmy</td><td>TaKaRa Bio Inc.</td><td>#6601</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>#354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>#05850</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02100</td><td>1 mg / ml</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>G2500</td><td>0,10%</td></tr> <tr><td>BM-Cyklina</td><td>Roche</td><td>799 050</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy mini&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nano Drop</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>#170-8882AP</td><td></td></tr><tr><td>ES Zestaw do charakteryzacji komórek</td><td>Chemicon International, Inc.,</td><td>SCR001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA Power&nbsp;</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>25011</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp&reg; Mikrozestaw DNA</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>AmpF/STR&reg; Identifiler&reg; Zestaw do amplifikacji PCR</td><td>Applied Biosystems Inc.</td><td></td><td></td>4322288</tr><tr><td>Biosystems Stosowane&reg; Analizator genetyczny 3130xl&nbsp;</td><td>Applied Biosystems Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nowy model hodowli do namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie w pożywkach kondycjonowanych łożyskiem

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

Interesujące było rozmnażanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w kondycjonowanej pożywce pochodzącej z komórek ludzkich w warunkach hodowli bez karmienia. Niemniej jednak nie opracowano idealnej, humanizowanej, bezkarmowej metody rozmnażania hPSC ex vivo; Obecnie dodatkowe substraty egzogenne, w tym zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), główny czynnik podtrzymujący hPSC, są dodawane do wszystkich pożywek hodowlanych, a substraty syntetyczne, takie jak Matrigel lub laminina, są stosowane we wszystkich kulturach niekarmionych. Niedawno nasza grupa opracowała prosty i skuteczny protokół namnażania hPSC przy użyciu wyłącznie kondycjonowanych pożywek pochodzących z ludzkiego łożyska na szalce pokrytej żelatyną, bez dodatkowej suplementacji egzogennej lub syntetycznych substratów specyficznych dla hPSC. Protokół ten nie został wcześniej opisany i może umożliwić naukowcom skuteczne rozmnażanie hPSC w humanizowanych warunkach hodowli. Ponadto model ten eliminuje ryzyko zanieczyszczenia hPSC produktami pochodzenia zwierzęcego, takimi jak wirusy lub nieznane białka. Co więcej, system ten ułatwia masową produkcję hPSC za pomocą powłoki żelatynowej, która jest prosta w obsłudze, co znacznie obniża ogólne koszty utrzymania hPSC ex vivo.

Jedną z zalet tej metody propagacji hPSC jest wykorzystanie składników wydzielanych przez ludzkie komórki. Najbardziej krytycznym krokiem w protokole jest izolacja i hodowla komórek pochodzących z ludzkiej łożyska. Wymaga to dokładnej dyssekcji precyzyjnie określonej części kosmków łożyska. Rysunek 1 przedstawia procedurę izolacji komórek pochodzących z ludzkiej łożyska. Proces ten jest prosty i wygodny w izolacji komórek i może zostać łatwo wykonany w ciągu 1 hr. Jak opisano na Rysunku 2</strong...

Ten protokół zapewnia prosty i skuteczny sposób namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) przy użyciu wyłącznie kondycjonowanych pożywek pochodzących z ludzkiego łożyska w naczyniu pokrytym żelatyną, bez dodatkowej suplementacji egzogennej lub syntetycznych substratów specyficznych dla hPSC.

Nowy model hodowli do namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie w pożywkach kondycjonowanych łożyskiem

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opisanie sposobu masowej produkcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem prostej i kosztowo efektywnej powłoki z żelatyny. Osiąga się to poprzez wstępne wyizolowanie chorion villi z tkanek ludzkiej łożyska, a następnie, w drugim kroku, poprzez posiekanie villi na małe fragmenty tkanki. Fragmenty tkanki są hodowane na płytkach pokrytych żelatyną, gdzie w ciągu pięciu do siedmiu dni tworzą kolonie adherentnych komórek przypominających fibroblasty, a następnie są wykorzystywane do przygotowania pożywki kondycjonowanej do hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.Następnie od 80 do 100 skupisk ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych wysiewa się, pokrywając je pożywką warunkowaną komórkami pochodzącymi z ludzkiej łożyska, a następnie poddaje subkulturze raz na cztery do pięciu dni. Wyniki wykazują podobny stopień różnicowania i adhezji komórek hodowanych w warunkach uznawanych za złoty standard w porównaniu z opisaną tutaj metodą hodowli komórek na płytkach pokrytych żelatyną w pożywce warunkowanej ludzkim łożyskiem. Główną zaletą tej techniki nad metodami konwencjonalnymi jest wykorzystanie składników wydzielanych przez ludzkie komórki bez konieczności stosowania dodatkowej suplementacji egzogennej i syntetycznych substratów.Aby rozpocząć, pokryj naczynia hodowlane T 25 pięcioma mililitrami 0,1% roztworu żelatyny i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37°C, a następnie wysterylizuj 500 mililitrów soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), pęsetę, nożyczki chirurgiczne, probówki do mikrocentryfugi oraz gazę, autoklawując je w temperaturze 121°C pod ciśnieniem 15 psi przez ponad 15 minut. Następnie podgrzej sterylnie przefiltrowane medium DMEM zawierające 20% płodowej surowicy bydlęcej, 100 jednostek na mililitr penicyliny oraz 100 g na mililitr.Streptomycynę pozyskano z chirurgicznie oddzielonych blaszek jamniczych ludzkiej łożyska, pobranych od zdrowych kobiet w ciąży w 7. do 32. tygodnia gestacji. Po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody, należy przemyć blaszki 5 ml PBS, używając nożyczek. Wyizoluj chorion z blaszek jamniczych ludzkiego łożyska, a następnie posiekaj tkankę na bardzo małe kawałki.Następnie przemyć kawałki tkanki trzykrotnie, używając jednego mililitra PBS do każdego płukania, umieść rozdrobnione VII w probówce do mikrocentryfugi i za pomocą pipety przemyj próbki 500 mikrolitrami PBS, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół. Następnie odwiruj probówkę z prędkością 120 Gs przez trzy minuty, aby osadzić rozdrobnione vi eye. Przemyj tkankę jeszcze dwukrotnie 500 mikrolitrami podgrzanej pożywki hodowlanej, powtarzając wirowanie.Po każdym przemyciu hodowli, rozdrobnioną tkankę i pożywkę nanosi się na wcześniej przygotowane płytki pokryte żelatyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po około pięciu do siedmiu dniach hodowli w tym samym pożywce można zaobserwować tworzenie się kolonii przypominających fibroblasty wykazujących wzrost adherentny po siedmiu dniach. Następnie przeprowadza się wymianę pożywki.Podczas hodowli usuwamy pożywkę wraz z wszelkimi pływającymi fragmentami komórek, ponieważ rosnące fibroblasty łożyskowe będą przylegać do płytki; należy kontynuować wymianę pożywki co dwa do trzech dni aż do trzeciego pasażu hodowli. Komórki o fenotypie fibroblastów pochodzące z płyt chorionicznych ludzkiego łożyska hoduje się do 10. pasażu. Następnie zbiera się je za pomocą trypsyny, aby posłużyły jako próbki stokowe do hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych po wykluczeniu kontaminacji, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, w zagęszczeniu 1×10⁷ komórek w płytce hodowlanej T 75 i inkubuje komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do osiągnięcia 85–90% konfluencji.Poddać przylegające komórki działaniu mitomycyny C w stężeniu 10 µg/mL przez dwie i pół godziny, a następnie trzykrotnie przemyć komórki 10 mL podgrzanego PBS. Następnie inkubować komórki w podgrzanym medium bez mitomycyny C przez 24 godziny w dniu następującym po traktowaniu. Wymienić medium hodowlane na 10 mL Dmf.12 pożywek uzupełnionych o 20% zamiennika surowicy, 0,1 mM beta-merkaptoetanolu, 1% NEAA oraz 1% penicyliny-streptomycyny. Po 24 godzinach inkubacji zebrać pożywkę kondycjonowaną do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i przefiltrować ją za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 µm. Następnie dodać do komórek kolejne 10 ml świeżej pożywki i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Przez tydzień codziennie zbieraj wszystkie nadsączki z kultur i zamrażaj pobrane pożywki w temperaturze -80 °C. Każdorazowo zamrażaj pożywkę w nowym pojemniku. Aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, uzyskaj linię ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, taką jak linia H1, i rozpocznij ich hodowlę zgodnie z instrukcjami producenta dla kultur grup eksperymentalnych.Te same komórki na płytkach powlekanych 0,1% żelatyną w hodowli komórek pochodzących z łożyska. W pożywce przeprowadzać rutynowe pasażowanie raz na pięć dni, stosując standardowe mechaniczne metody pasażowania. Pasażować komórki kontrolne od pierwszego do czwartego, a grupę eksperymentalną od pierwszego do szóstego oraz od pierwszego do dziesiątego.Codziennie wymieniaj medium na świeże. Rozpocznij od drugiego dnia. Ludzkie linie pluripotentnych komórek macierzystych mogą być utrzymywane na płytkach powlekanych 0,1% żelatyną w medium do hodowli komórek pochodzących z ludzkiej łożyska na poziomie zbliżonym do obserwowanego w przypadku komórek utrzymywanych w typowej hodowli komórek macierzystych.Pożywka na płytkach powlekanych macierzą błony podstawnej w celu potwierdzenia, że pożywka do hodowli komórek pochodzących z ludzkiej łożyska przenika do innych macierzy. Komórki macierzyste pod hodowano na naczyniach powlekanych lamininą oraz naczyniach niepowlekanych. Komórki przytwierdziły się i rosły na naczyniach powlekanych lamininą.Jednak po kilku pasażach zróżnicowało się wiele kolonii. W przeciwieństwie do tych z grupy powlekanej żelatyną. Po przeniesieniu na nienaniesione powłoki nie zaobserwowano przylegania komórek macierzystych.Przedstawione tutaj linie komórkowe H1 oraz IPSE były hodowane przez 10 pasaży w warunkach eksperymentalnych. Po dwóch tygodniach utworzyły one ciała embrionalne zawierające mezodermę, ektodermę i endodermę, co potwierdzono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii ludzkich komórek macierzystych do eksploracji zastosowań klinicznych.Dzięki zastosowaniu tej metody uniknięto zanieczyszczenia produktami pochodzenia zwierzęcego.

a-novel-culture-model-for-human-pluripotent-stem-cell-propagation-on

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Tradycyjne, dwuwymiarowe techniki hodowli komórkowej często prowadzą do zmian w charakterystyce markerów różnicowania, cytokin i czynników wzrostu. Trójwymiarowa hodowla komórkowa w rotacyjnym systemie hodowli komórkowej (RCCS) przywraca ekspresję wielu z tych czynników, co zaprezentowano tutaj na przykładzie linii komórkowej trofoblastu pozawillousowego.

Rotacyjne systemy hodowli komórkowych dla hodowli ludzkich komórek: ludzkie komórki trofoblastyczne jako model

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), oparte na wzroście pojedynczych komórek bez typu kolonijnego (NCM) zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ta nowa metoda, wykorzystująca inhibitory kinaz związane z Rho lub izoformę lamininy 521 (LN-521), jest odpowiednia do wytwarzania dużych ilości jednorodnych hPSC, manipulacji genetycznych i odkrywania leków.

Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnych ludzkich hodowli łożyskowych (kosmków) i narządów dziesiętnych. Hodowle kosmków i narządów dziesiętnych są nieocenionymi narzędziami do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem. Wykazano zakażenie fakultatywną bakterią wewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes.

Ludzkie posiewy łożyska i narządów dziesiętnych w celu zbadania zakażeń na granicy matczyno-płodowej

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego generowania ludzkich komórek trofoblastycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków aktywinowych/węzłowych. Metoda ta jest odpowiednia do skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i może generować duże ilości komórek do manipulacji genetycznej.

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

Przedstawiono protokół przygotowania hydrożeli z polialkoholu winylowego i kwasu ko-itakonowego o różnej sztywności, które zostały zaszczepione z oligopeptydami i bez nich, w celu zbadania wpływu sztywności biomateriałów na różnicowanie i proliferację komórek macierzystych. Sztywność hydrożeli była kontrolowana przez czas sieciowania.

Ludzka pluripotencjalna hodowla komórek macierzystych na hydrożelach z polialkoholem winylowym i kwasem ko-itakonowym o różnej sztywności w warunkach wolnych od ksenotypów

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Tutaj prezentujemy protokół dla zautomatyzowanego systemu hodowli komórek. Ten zautomatyzowany system hodowli zmniejsza nakład pracy i przynosi korzyści użytkownikom, w tym naukowcom niezaznajomionym z obsługą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), od utrzymania komórek iPS po różnicowanie w różne typy komórek.

Zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Organoidy stały się cennymi narzędziami do modelowania chorób. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) kieruje losem komórki podczas generowania organoidów, a użycie systemu, który przypomina tkankę natywną, może poprawić dokładność modelu. W badaniu tym porównano wytwarzanie indukowanych organoidów jelitowych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w hydrożelach ECM pochodzenia zwierzęcego i bezksenowęglowych.

Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych

Protokół pokazuje nowatorski model eksperymentalny in vitro, który może podsumować biologię dwóch rodzajów przylegających linii komórkowych za pomocą trójwymiarowego (3D) wydrukowanego rusztowania. Opisano budowę tego modelu i procedury operacyjne, od przygotowania komórek i hodowli komórek po analizę i ocenę.

Model kohodowli z wykorzystaniem dwóch typów przylegających linii komórkowych

Ustaliliśmy metodę kapsułkowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek PS) w kapsułkach hydrożelowych alginianowych za pomocą dyszy współosiowej.  Zapobiega to nadmiernej agregacji komórek i ogranicza naprężenia ścinające doświadczane przez komórki w hodowli zawiesinowej.  Technika ta ma zastosowanie do masowej produkcji komórek PS, a także do badań nad niszą komórek macierzystych.

Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Naucz się hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie z użyciem pożywek kondycjonowanych łożyskiem. Ta metoda eliminuje potrzebę stosowania syntetycznych substratów.

Nowy model hodowli do namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie w pożywkach kondycjonowanych łożyskiem (Wideo) | JoVE Journal

Nowy model hodowli do namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie w pożywkach kondycjonowanych łożyskiem

Przeglądaj więcej filmów