Name: Czułe wykrywanie proteopatycznej aktywności wysiewu za pomocą cytometrii przepływowej FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Poznaj metodę FRET cytometrii przepływowej do wykrywania proteopatycznej aktywności wysiewu w próbkach biologicznych. Technika ta umożliwia czułą detekcję agregatów białkowych w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Konsorcjum Tau (M.I.D); Grant Narodowych Instytutów Zdrowia 1R01NS071835 (M.I.D.), grant Departamentu Obrony PT110816 (dla M.I.D.), 1F32NS087805 (dla J.L.F.) i 1F31NS079039 (dla B.B.H.).

UWAGA: Protokół ten kładzie nacisk na zastosowanie cytometrii przepływowej FRET do wykrywania aktywności wysiewu z próbek biologicznych myszy. Jest również kompatybilny z rekombinowanymi włókienkami i ludzkimi próbkami biologicznymi. Eutanazja myszy i pobieranie próbek mózgów przeprowadzono zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez IACUC.
1. Ekstrakcja mózgu
<ol>
	<li>Po głębokim znieczuleniu izofluranem (2%) należy przeprowadzić fuzję myszy za pomocą lodowatego PBS zawierającego 0,03% heparyny i wyekstrahować mózg zgodnie ze szczegółami opisanymi w Gage i wsp.Rozdział 18</li>
	<li>Umieść wyekstrahowaną tkankę w kriofiolce i błyskawicznie zamroź, umieszczając w ciekłym azocie. Alternatywnie zamroź tkankę na suchym lodzie. Po zamrożeniu przenieść tkankę do temperatury -80 °C i przechowywać przez dłuższy czas, jeśli to konieczne. 
	UWAGA: Ten protokół jest kompatybilny z homogenatami całego mózgu lub mikropreparowanymi obszarami mózgu. Zobacz Hagihara i wsp., aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem mikropreparacji19.</li>
</ol>
2. Przygotowanie biologicznego materiału siewnego
<ol>
	<li>Przygotować bufor homogenizacyjny, rozpuszczając inhibitory proteazy (wolne od EDTA) w 1x TBS (1 tabletka na 10 ml). Energicznie wirować i przechowywać na lodzie. Inhibitory proteazy muszą być wolne od EDTA, aby zachować żywotność komórek biosensorów.</li>
	<li>Zważ zamrożoną tkankę mózgową w jednorazowej łódce do ważenia i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 5 ml. Dodać lodowaty bufor homogenizacyjny tak, aby końcowy roztwór miał 10% masy/objętości. Tymczasowo przechowywać na lodzie. Masa tkankowa i późniejsza objętość buforu homogenizacyjnego będą się różnić w zależności od wielkości mózgu i/lub użytych regionów. W tym przypadku dorosły półmózg myszy o wadze 0,2 g jest zawieszony w 2 ml w celu uzyskania 10% w/vol roztworu.</li>
	<li>Przenieś próbki do chłodni i dostosuj sonograf sondy do odpowiednich ustawień. W przypadku sonizacji sondy za pomocą Omni Ruptor (pokazanego tutaj), ustaw moc na 20%, co odpowiada około 75 W. Użyj trybu pulsacyjnego, aby upewnić się, że próbki nie są nadmiernie przegrzane podczas sonikacji. Ustaw impulser na 30%, co odpowiada około 500 ms.</li>
	<li>Oczyść końcówkę sonikatora sondy, spłukując ją wodą, izopropanolem i ponownie wodą, wycierając sondę pomiędzy każdym roztworem. Pamiętaj, aby wypłukać i wytrzeć zarówno boki, jak i spód sondy chusteczkami laboratoryjnymi.</li>
	<li>Pracując z jedną próbką na raz, zanurz końcówkę sondy w buforze homogenizacyjnym i uruchom sonikatór. Korzystając z opisanych powyżej ustawień mocy i pulsera, dostarcz łącznie 25 impulsów. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie w zawiesinie. Na tym etapie należy uważać, aby uniknąć spienienia próbki. 
	UWAGA: Próbki są podatne na pienienie, jeśli a) całkowita objętość jest mała lub b) homogenat się nagrzeje. Za pomocą tego konkretnego przyrządu nie należy wykonywać sonikacji o objętościach mniejszych niż 250 μl. Aby zapewnić schłodzenie próbek, na tym etapie probówki mogą być przechowywane na lodzie.</li>
	<li>Wyczyść sondę, wycierając resztki lizatu, a następnie wprowadź 10 impulsów do zlewki z czystą wodą. Opłucz boki i spód sondy wodą, izopropanolem i ponownie wodą (jak w kroku 2.4), wycierając do sucha między każdym krokiem. Aby uniknąć zanieczyszczenia, dokładnie przepłucz sondę między próbkami. 
	UWAGA: W przypadku kruszyw tau nie stwierdziliśmy, aby konieczne było stosowanie bardziej rygorystycznych metod czyszczenia, aby zapobiec zanieczyszczeniu między próbkami. Inne amyloidy mogą jednak wymagać dodatkowej opieki, która została obszernie opisana w literaturze20,21.</li>
	<li>Przechowywać homogenaty na lodzie do czasu, aż wszystkie próbki zostaną przetworzone.</li>
	<li>Wirować homogenaty w temperaturze 21 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Wyrzuć granulkę. Podzielić supernatant na porcje i przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania. Należy jednak unikać cykli zamrażania/rozmrażania homogenatów, ponieważ zmniejsza to wydajność wysiewu.</li>
</ol>
3. Odtwarzanie komórek biosensora
UWAGA: Użyj czterech linii komórkowych do tego testu: HEK 293T (linia komórkowa #1), RD-P301S-CFP (linia komórkowa #2), RD-P301S-YFP (linia komórkowa #3) i RD-P301S-CFP/YFP (linia komórkowa #4). Proszę zapoznać się z tabelą 1 dla wkładu każdej linii komórkowej w teście.
<ol>
	<li>W sterylnym środowisku odessać pożywkę hodowlaną. Przepłucz komórki ciepłym PBS i aspiruj. Trypsynizować komórki (3 ml trypsyny-EDTA (0,05%)) przez 3 minuty, schłodzić ciepłą pożywką hodowlaną (9 ml DMEM, 10% FBS, 1% pen/strep, 1% GlutaMax) i natychmiast przenieść komórki do stożkowej probówki.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w ciepłym pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Za pomocą hemocytometru określ gęstość komórek dla każdej linii komórkowej. Gęstość komórek będzie się różnić w zależności od konfluencji w czasie zbioru i objętości ponownego zawieszenia. Ponownie zawiesić komórki zebrane z 10-centymetrowego naczynia przy 90% zbiegu w pożywce o objętości 10 ml, aby gęstość komórek wynosiła około 1 miliona komórek/ml.</li>
	<li>Wykonaj główną mieszankę komórek + pożywki w taki sposób, aby każda studzienka na płytce 96-dołkowej zawierała 35 000 komórek w pożywce 130 μl (np. Aby uzyskać mieszankę wzorcową na 100 dołków, ponownie zawieś 3,5 miliona komórek w pożywce 13 ml). Zmodyfikuj numer komórki, aby dopasować go do indywidualnych projektów eksperymentalnych i osi czasu. W przypadku leczenia komórek ~ 18 godzin po posianiu dodaj 35 000 komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Używając pipety wielokanałowej, powoli odpipetować 130 μl zawiesiny komórek mieszania głównego do każdego dołka na płaskiej dnie, 96-dołkowej płytki poddanej kulturze tkankowej. Podczas powlekania umieść końcówkę pipety na środku dołka, nie dotykając dna płytki. 
	UWAGA: Chociaż format posiewu można modyfikować, zaleca się wykonanie n = 4 dołków dla każdej linii komórkowej 1-3 na płytkę. Pozostała część płytki (n = 84) jest zarezerwowana dla linii komórkowej #4 (komórki biosensora).</li>
	<li>Pozwól komórkom osiąść, pozostawiając płytkę w spokoju przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności względnej ≥80%.</li>
</ol>
4. Leczenie komórek
UWAGA: Następnego dnia, gdy komórki biosensora tau są w 60-65% zlewne, przygotuj kompleksy transdukcji nasion w następujący sposób:
<ol>
	<li>W jednej probówce połącz odczynnik do transfekcji, taki jak Lipofectamina, z pożywką o zredukowanej surowicy, taką jak Opti-MEM, aby uzyskać mieszankę wzorcową. Do każdego dołka dodać 1,25 μl odczynnika do transfekcji i 8,75 μl pożywki o zredukowanej surowicy. Delikatnie przesuń rurkę, aby wymieszać, krótko odwiruj i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W innej probówce połączyć materiał siewny (podwielokrotność lizatu z kroku 2.9) z pożywką o zredukowanej surowicy. 
	UWAGA: Objętość materiału siewnego będzie się różnić w zależności od indywidualnego eksperymentu. Wybierając objętość nasion, należy wziąć pod uwagę: obfitość nasion w próbce i potencjalną toksyczność. Surowe homogenaty mogą być toksyczne dla komórek. W związku z tym użyj najniższej możliwej głośności, aby monitorować pożądany efekt. Wcześniej badane objętości lizatu/studzienki wahają się od 1-5 μl, co odpowiada 5-20 μg białka całkowitego. Upewnij się, że całkowita objętość na studzienkę (nasiona + pożywka o obniżonej surowicy) wynosi 10 μl.</li>
	<li>Połączyć zawartość z dwóch probówek opisanych w ppkt 4.1 i 4.2, delikatnie strzepnąć do wymieszania, krótko odwirować (1 000 x g, 5 s) i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut i do 2 godzin.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować 20 μl kompleksu transdukcyjnego na boku poszczególnych studzienek biosensora. Jeśli to możliwe, należy użyć trzech powtórzeń technicznych. Umieść potraktowane komórki z powrotem w inkubatorze na 24-48 godzin. Inkubować w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 3.6. 
	UWAGA: Odpowiednim warunkiem kontroli ujemnej dla tej konfiguracji są komórki biosensora potraktowane pustymi liposomami (tj. odczynnikiem liposomowym + pożywką o zmniejszonej surowicy), ponieważ zastosowanie fosfolipidów wprowadza niewielkie przesunięcie profilu fluorescencji w stosunku do komórek biosensorów niewystawionych na działanie odczynnika liposomowego.</li>
</ol>
5. Pobieranie komórek do cytometrii przepływowej FRET
UWAGA: Przed pobraniem komórek - zazwyczaj 24-48 godzin po zabiegu - możliwe jest uzyskanie wstępnego odczytu aktywności wysiewu za pomocą filtra GFP na standardowym odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym. Komórki traktowane bez materiału siewnego (tj. Puste liposomy) będą wykazywać rozproszoną fluorescencję, podczas gdy komórki traktowane materiałem siewnym będą wykazywać intensywne punktowe i siatkowate wtrącenia wewnątrzkomórkowe (ryc. 1A-B).
<ol>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej odessać pożywkę komórkową (150 μl). Trypsynizować (50 μl) komórki przez 5 minut i schłodzić 150 μl schłodzonej pożywki hodowlanej. Na tym etapie nie należy włączać płukania PBS przed trypsynizacją, ponieważ może to spowodować podnoszenie komórek, a następnie ich utratę. Wyklucz wszelkie zanieczyszczające martwe komórki i zanieczyszczenia podczas cytometrii przepływowej za pomocą strategii bramkowania.</li>
	<li>Natychmiast po schłodzeniu przenieść komórki na 96-dołkową okrągłą płytkę denną i odwirować przy 1,000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
	<li>Delikatnie, ale dokładnie, ponownie zawieś osad komórkowy w 50 μl 2% paraformaldehydu i inkubuj przez 10 minut. Alternatywnie, uruchom komórki na żywo, chociaż utrwalenie zapewnia czystsze i bardziej spójne wyniki.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i wyrzucić paraformaldehyd, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
	<li>Delikatnie, ale dokładnie, ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl schłodzonego buforu cytometrii przepływowej (HBSS, 1% FBS, 1 mM EDTA) i uruchomić płytkę tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zbrylania się komórek.</li>
</ol>
6. Cytometria przepływowa FRET
UWAGA: Użyj cytometru przepływowego, takiego jak MACSQuant VYB, który jest wyposażony w linie laserowe kompatybilne z FRET i zestawy filtrów (Tabela 2). Dla każdego kroku w tej sekcji kliknij interesującą Cię studnię, korzystając z szablonu 96 studni oprogramowania, a następnie kliknij "odtwórz", aby rozpocząć pobieranie i przepływ próbki. Twórz wykresy lub tabele statystyczne, klikając ikonę "nowe okno analizy". Parametry osi na poszczególnych wykresach dwuwymiarowych można zmienić, klikając tytuł na osi X lub Y i wybierając odpowiedni filtr. Aby przesunąć populacje komórek lub sygnały fluorescencyjne, zwiększ lub zmniejsz napięcia związane z odpowiednimi filtrami. Za pomocą tego urządzenia można uruchomić <1 000 zdarzeń na sekundę, aby zapewnić dokładne monitorowanie pojedynczej komórki.
<ol>
	<li>Wykonaj wykres dwóch zmiennych Side Scatter Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Area (FSC-A) i przy uruchomionej linii komórkowej #1 dostosuj napięcia SSC i FSC, aż populacja komórek znajdzie się w lewym dolnym kwadrancie. Kliknij narzędzie wielokąta i zdefiniuj populację komórek (Bramka P1). Aby zapoznać się ze wszystkimi parametrami bramkowania, patrz rysunek 2.</li>
	<li>Utwórz wykres dwuwymiarowy FSC-H (wysokość) i FSC-A i zastosuj bramkę P1 do tego wykresu, klikając "na żywo" nad wykresem i wybierając P1. Gdy uruchomiona jest linia komórkowa #1, kliknij narzędzie wielokąta i zdefiniuj pojedyncze komórki (bramka P2).</li>
	<li>Wykonaj 3 wykresy histogramu, po jednym dla każdego z interesujących filtrów: CFP, YFP i FRET. Zastosuj bramkę P2 do wszystkich tych działek, klikając "na żywo" nad działkami i wybierając P2. Przy uruchomionej linii komórkowej #1 dostosuj napięcia tak, aby mediana populacji komórek w histogramach CFP, YFP i FRET mieściła się w zakresie od 0 do 1. Aby zmierzyć CFP i FRET, należy wzbudzić komórki za pomocą lasera 405 nm i wychwycić fluorescencję za pomocą filtra odpowiednio 450/50 nm i 525/50 nm. Aby zmierzyć YFP, wzbudz komórki laserem o długości 488 nm i wychwyć fluorescencję za pomocą filtra 525/50 nm. Ustawienia lasera i filtra są bardziej szczegółowo opisane w tabeli 2.</li>
	<li>Wykonaj kompensację rozlania się CFP na kanały FRET i YFP. 
	UWAGA: Kompensacja to proces korekcji rozlewu fluorescencji. Rozlanie się fluorescencji występuje, gdy emisja fluorescencji jednego fluorochromu zostanie wykryta w filtrze przeznaczonym do pomiaru sygnału z innego fluorochromu. Przy odpowiedniej kompensacji fluorescencja rozlewowa CFP może zostać usunięta z kanałów FRET i YFP. 
	UWAGA: Kompensacja wymaga obecności zarówno komórek fluorescencyjnych -dodatnich, jak i -ujemnych. Tak więc, aby skompensować na komórkach CFP-dodatnich (linia komórkowa #2), komórki ujemne (linia komórkowa #1) muszą zostać dodane do próbki przed serią.
	<ol>
		<li>Skok 30 μl zawiesiny linii komórkowej #1 z pojedynczego dołka do 200 μl zawiesiny linii komórkowej #2 bezpośrednio przed kompensacją.</li>
		<li>Kliknij ikonę "Ustawienia instrumentu", a następnie zakładkę "kompensacja" i zaznacz "matryca", aby otworzyć tabelę wynagrodzeń.</li>
		<li>Utwórz wykres dwuwymiarowy FRET-A i CFP-A i zastosuj bramkę P2, jak opisano w kroku 6.3. Przy uruchomionych liniach komórkowych 1 + 2 kliknij ikonę "kwadrantu" i narysuj ćwiartki tak, aby populacje fluorescencji -ujemne i -dodatnie były oddzielone dwoma dolnymi kwadrantami (odpowiednio Gates LL3 i LR3).</li>
		<li>Utwórz tabelę statystyk, która wyświetla medianę intensywności fluorescencji (MFI) FRET dla bramek LL3 i LR3. Dostosuj parametr FRET w macierzy kompensacji, aż MFI sygnału FRET będzie równoważne między LL3 i LR3. Po tym kroku MFI sygnału FRET jest równe między komórkami niebarwionymi a komórkami CFP-dodatnimi, co sugeruje brak rozlewania się CFP do kanału FRET.</li>
		<li>Utwórz wykres dwuwymiarowy YFP-A i CFP-A i zastosuj bramkę P2, zgodnie z opisem w kroku 6.3. Narysuj ćwiartki (LL4 i LR4) podobnie jak w kroku 6.4.3.</li>
		<li>Utwórz tabelę statystyczną, która wyświetla MIF YFP dla LL4 i LR4. Dostosuj parametr YFP w macierzy kompensacji, aż MFI sygnału YFP będzie równoważne między LL4 i LR4. Po tym kroku MFI sygnału YFP jest równy między komórkami niebarwionymi a komórkami dodatnimi CFP, co sugeruje brak rozlania się CFP do kanału YFP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ustawieniu bramki i kompensacji zaznacz interesujące Cię studnie i uruchom pozostałą część płytki.</li>
	<li>Po uruchomieniu wszystkich próbek wyeksportuj pliki danych, klikając "plik", a następnie "kopiuj". Wybierz zakładkę "pliki danych", zaznacz folder eksperymentu i kliknij "kopiuj".</li>
</ol>
7. Analiza danych
UWAGA: Zmień parametry osi na poszczególnych wykresach dwuwymiarowych, klikając tytuł na osi X lub Y i wybierając odpowiedni filtr.
<ol>
	<li>Otwórz pliki FCS w programie do analizy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Opierając się na właściwościach rozproszenia, użyj bramki wielokątnej, aby zdefiniować populację komórek (SSC vs FSC) i populację singletów (FSC-H vs FSC-A) z komórek potraktowanych pustymi liposomami, podobnie jak opisano w sekcji 6.</li>
	<li>Jeśli kompensacja CFP została wykonana podczas konfiguracji, nie należy dalej dostosowywać CFP.</li>
	<li>Utwórz wykres dwóch zmiennych FRET i YFP. Korzystając z linii komórkowej #3, zdefiniuj fałszywą bramkę FRET, rysując bramkę wielokątną, która biegnie wzdłuż zbocza populacji komórek FRET-dodatnich. Ta bramka wyklucza pojedyncze dodatnie komórki YFP, które emitują sygnał w filtrze FRET i jest rysowana podobnie jak wcześniej pokazana przez Banninga i wsp.22 Rozdział 22</li>
	<li>Zdefiniuj bramkę FRET, wykreślając puste komórki CFP/YFP poddane działaniu liposomów na wykresie dwuwymiarowym FRET vs CFP. Wprowadź wielokątną bramę wzdłuż nachylenia populacji, która rozciąga się w górę i w lewo od populacji. Ta bramka powinna wykluczyć większość komórek (~99%), tak aby tło FRET stanowiło ≥1% komórek. Wszystkie zdarzenia, które przesuwają się do tej bramki, są uważane za FRET-dodatnie. 
	UWAGA: Każda pojedyncza bramka opisana powyżej jest nakładana na wszystkie próbki przed skonstruowaniem kolejnych bramek. Po analizie definiowane są cztery indywidualne bramki (Populacja komórek; singlet; fałszywy FRET; FRET).</li>
	<li>Rejestruj interesujące parametry analizy, w tym: procentową dodatniość FRET i MFI komórek FRET-dodatnich. Ręcznie oblicz zintegrowaną gęstość FRET, mierząc iloczyn procentu dodatniości i MFI. 
	UWAGA: Jeśli jako miara wyniku używana jest zintegrowana gęstość FRET, należy ustawić tło FRET (zgodnie z definicją w kroku 7.5) i MIF na wartość większą lub równą 1, aby uniknąć obliczania iloczynu, który jest mniejszy niż jego dwa indywidualne czynniki.</li>
</ol>

<ol><li>Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases+target+large-scale+human+brain+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks.</a> Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+Regional+Neurodegeneration+from+the+Healthy+Brain+Functional+Connectome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome.</a> Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).</li>
<li>Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Network+Diffusion+Model+of+Disease+Progression+in+Dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia.</a> Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+Alzheimer%27s+disease-related+neurofibrillary+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes.</a> Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).</li>
<li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).</li>
<li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+protein+aggregate+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of protein aggregate propagation.</a> Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).</li>
<li>Kaufman, S. K., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+protein+aggregation+and+related+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies.</a> Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).</li>
<li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+properties+of+Tau+protein%3A+the+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li>
<li>Guo, J. L., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+transmission+of+pathogenic+proteins+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).</li>
<li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).</li>
<li>Guo, J. L., Lee, V. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+normal+tau+by+pathological+tau+conformers+drives+pathogenesis+of+Alzheimer-like+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2011).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+internalization+and+propagation+of+specific+proteopathic+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).</li>
<li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Tau+Pathology+in+a+Model+of+Early+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-Synaptic+Spread+of+Tau+Pathology+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31302(2012).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.</li>
<li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. 65 (65), (2012).</li>
<li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li>
<li>Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires%3A+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li>
<li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning%2C+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hosp+Infect%22%5BJournal%5D)">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li>
<li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344(2010).</li>
<li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer%27s+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537(2015).</li>
</ol>

Ten test został licencjonowany przez Janssen Pharmaceuticals.

Opisany tutaj system cytometrii przepływowej FRET jest potężnym narzędziem do szybkiej i ilościowej oceny aktywności wysiewu tau. Wymaga jedynie umiarkowanego doświadczenia w hodowli komórkowej i praktycznej wiedzy na temat FRET i cytometrii przepływowej. Inne testy wysiewu, takie jak tioflawina T - która wykazuje zwiększoną fluorescencję po związaniu ze strukturą arkusza beta - są pracochłonne i wymagają czystego, rekombinowanego substratu białkowego. Dodatkowo, testy wysiewu in vitro dla tau są tylko półilości...

Nagromadzenie wewnątrzkomórkowych amyloidów tau definiuje tauopatie takie jak choroba Alzheimera. We wczesnych stadiach choroby patologia jest na ogół zlokalizowana w dyskretnych obszarach mózgu, ale wraz z postępem choroby patologia niezmiennie rozprzestrzenia się wzdłuż odrębnych sieci neuronowych1-5. Coraz więcej dowodów sugeruje, że transkomórkowa propagacja toksycznych agregatów białkowych leży u podstaw tej patologii (przegląd w 6-10). W tym modelu nasiona proteopatyczne (np. tau) są uwalniane z komórek dawcy i dostają się do sąsiednich komórek, przekształcając natywne białko tau w nieprawidłowo sfałdowaną formę poprzez szablonową zmianę konformacyjną11-15. Opisany tutaj test został opracowany w celu czułego wykrywania takiej aktywności wysiewu. Jest kompatybilny z rekombinowanymi próbkami białkowymi i biologicznymi oraz umożliwia ilościowe określenie niewielkich poziomów proteopatycznej aktywności siewu16.
Komórki 293T HEK, które stabilnie wyrażają domenę powtórzeń tau (RD) zawierającą związaną z chorobą mutację P301S połączoną z CFP lub YFP (dalej nazywaną komórkami tau-RD-CFP/YFP) służą jako stabilny bioczujnik aktywności wysiewu. W przypadku braku nasion proteopatycznych komórki utrzymują tau jako rozpuszczalny monomer i nie mają znaczącego tła FRET. Spontaniczny wychwyt lub transdukcja nasion tau do komórek za pośrednictwem liposomów powoduje jednak agregację RD-CFP i RD-YFP, która wytwarza sygnał FRET, który jest mierzony w pojedynczych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.
Wiele elementów tego testu zostało zaprojektowanych w celu zwiększenia czułości i zmniejszenia zmienności. Wybrano monoklonalną linię komórkową o stosunku ekspresji 1:1 RD-CFP/YFP, ponieważ zapewnia ona optymalny stosunek sygnału do szumu. Aby zwiększyć wrażliwość, fosfolipidy są używane do wprowadzania nasion bezpośrednio do komórek (chociaż w celu zbadania biologicznych mechanizmów wychwytu można to pominąć). Wreszcie, cytometria przepływowa monitoruje FRET na poziomie populacji i na poziomie pojedynczej komórki, w przeciwieństwie do innych testów agregacji białek. Miara końcowego wyniku, zintegrowana gęstość FRET, jest wysoce ilościowa i uwzględnia zarówno liczbę komórek z agregacją, jak i stopień, w jakim agregacja zaszła w każdej komórce. Wszystkie te zoptymalizowane parametry zwiększają czułość i zapewniają odtwarzalność.
Ten system został ostatnio wykorzystany w kompleksowym badaniu na transgenicznych myszach z tauopatią P301S17, które oceniało czasowy początek i progresję aktywności wysiewu tau w stosunku do innych powszechnie stosowanych markerów patologicznych tau (np. MC1, AT8, PG5 i Tioflawiny). Aktywność wysiewu jest zdecydowanie najwcześniejszym i najmocniejszym ocenianym markerem patologii tau, poprzedzającym wykrycie histologiczne o co najmniej 6 tygodni. Aktywność wysiewu pojawia się po 1,5 miesiąca i wzrasta stopniowo wraz z wiekiem, co sugeruje przyczynową rolę nasion proteopatycznych w wystąpieniu i/lub progresji neurodegeneracji16.
Precyzyjne oznaczanie ilościowe drobnych poziomów materiału siewnego z próbek biologicznych może ułatwić badania, które monitorują wczesny postęp choroby. Skracając czas trwania badań i umożliwiając wykorzystanie młodszych zwierząt, może to zwiększyć wydajność i dokładność badań przedklinicznych na zwierzętach. Na przykład u wcześniej opisanej myszy P301S związki ołowiu mogły być dostarczane już po 4-6 tygodniach (bezpośrednio przed lub na początku aktywności wysiewu) i monitorowane pod kątem skuteczności 2-4 tygodnie później. Test powinien dokładnie określić ilościowo wszelkie zmniejszenia aktywności wysiewu. Cytometria przepływowa FRET ma również zastosowanie w badaniach przesiewowych in vitro. Na przykład odczynniki anty-tau (np. przeciwciała, małe cząsteczki itp.) można szybko przetestować pod kątem ich zdolności do blokowania indukcji wysiewu bezpośrednio w hodowli, przy użyciu rekombinowanych agregatów tau lub lizatów pochodzących z mózgu jako źródła nasion (ryc. 5). Dzięki tej konfiguracji, po przygotowaniu materiału siewnego, eksperyment trwa zaledwie trzy dni, łącznie z analizą danych. Szybkie określenie ilościowe aktywności siewu proteopatycznego może zatem ułatwić wiele badań nad neurodegeneracją.

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cOmcomplete Inhibitory proteazy (wolne od EDTA)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Kriofiolki</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Łodzie wagowe Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>15 ml rurka stożkowa</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator ultradźwiękowy Omni Sonic Ruptor</td><td>Omni International</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokońcówka do homogenizatora ultradźwiękowego</td><td>Omni International</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>Nauszniki przeciwhałasowe z redukcją szumów</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon płodowej surowicy bydlęcej</td><td></td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki stożkowe</td><td>Phenix Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25 ml odczynniki</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>Pikulator wielokanałowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płaskie płytki</td><td>denne Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 dołkowe okrągłe płytki denne</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall ST 40</td><td>Thermo Scientific 75004509</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner Wahadłowy wirnik kubełkowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy Flow Jo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 1 ml</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l końcówki do pipet</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipeta serologiczna</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta serologiczna</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipeta serologiczna</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

czułe wykrywanie proteopatycznej aktywności wysiewu za pomocą cytometrii przepływowej fret

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Coraz więcej dowodów potwierdza transkomórkową propagację toksycznych agregatów białkowych, czyli nasion proteopatycznych, jako mechanizm inicjacji i postępu patologii w kilku chorobach neurodegeneracyjnych, w tym w chorobie Alzheimera i pokrewnych tauopatiach. Potencjalnie krytyczna rola nasion tau w progresji choroby zdecydowanie potwierdza potrzebę stosowania czułego testu, który z łatwością wykrywa aktywność wysiewu w próbkach biologicznych. 
Łącząc specyfikę transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET), czułość cytometrii przepływowej i stabilność monoklonalnej linii komórkowej, opracowano ultraczuły test wysiewu, który jest kompatybilny z wykrywaniem nasion z próbek rekombinowanych lub biologicznych, w tym homogenatów mózgu ludzkiego i myszy. Test wykorzystuje monoklonalne komórki HEK 293T, które stabilnie wyrażają podatną na agregację domenę powtórzeń (RD) tau, w której znajduje się związana z chorobą mutacja P301S połączona z CFP lub YFP, które wytwarzają sygnał FRET po agregacji białka. Wychwyt proteopatycznych nasion tau (ale nie innych białek) do komórek biosensora stymuluje agregację RD-CFP i RD-YFP, a cytometria przepływowa z czułością i ilościowo monitoruje ten wywołany agregacją FRET. Test wykrywa stężenia femtomolowe (ekwiwalent monomeru) rekombinowanych nasion tau, ma zakres dynamiczny obejmujący trzy rzędy wielkości i jest zgodny z homogenatami mózgu myszy transgenicznych z tauopatią i osób badanych tauopatią. Po niewielkich modyfikacjach test może również wykrywać aktywność wysiewu innych nasion proteopatycznych, takich jak α-synukleina, a także jest zgodny z pierwotnymi hodowlami neuronów. Łatwość, czułość i szerokie zastosowanie cytometrii przepływowej FRET sprawia, że jest ona przydatna do badania szerokiego zakresu zaburzeń agregacji białek.

Cytometria przepływowa FRET umożliwia czułą, ilościową i szybką detekcję aktywności zarodkowania w próbkach rekombinowanych lub biologicznych. Konfiguracja testu jest prosta: stabilne linie komórkowe pochodzące z przeciwciał monoklonalnych, wykazujące ekspresję tau-RD-CFP/YFP, są transdukowane materiałem zarodkującym, inkubowane przez 24-48 hr, a następnie poddawane analizie cytometrii przepływowej (Rysunek 1A). W przypadku braku zarodników komórki biosensora utrzymują tau w rozpuszczalnej formie monomer...

Transfer agregatów białkowych, czyli nasion proteopatycznych z komórki do komórki, może leżeć u podstaw postępu patologii w chorobach neurodegeneracyjnych. W tym miejscu opisano nowatorski test cytometrii przepływowej FRET, który umożliwia specyficzne i czułe wykrywanie aktywności wysiewu z próbek rekombinowanych lub biologicznych.

Czułe wykrywanie proteopatycznej aktywności wysiewu za pomocą cytometrii przepływowej FRET

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie aktywności zasiewania patologicznego białek z materiałów rekombinowanych lub biologicznych, co umożliwia czułą detekcję białek i agregatów w próbce. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurodegeneracji. Na przykład: w jaki sposób można ilościowo ocenić zmiany w aktywności zasiewania po interwencji terapeutycznej w zwierzęcych modelach choroby?Zalety tej techniki obejmują wysoką specyficzność w wykrywaniu niskich poziomów agregatów białkowych, wyjątkową precyzję, łatwość użycia oraz wysoką przepustowość. Procedurę tę zaprezentuję dzisiaj wraz ze współautorem, Brandonem Holmesem.Aby przygotować biologiczny materiał wyjściowy, należy rozpocząć od odważenia zamrożonej tkanki mózgowej w jednorazowej łódce wazowej. Następnie przenieść tkankę do probówki stożkowej, dodać lodowaty bufor do homogenizacji w taki sposób, aby końcowa objętość roztworu wynosiła 10%, i przenieść próbki na lód do pomieszczenia chłodniczego. Następnie należy ustawić sondę wskaźnika zgodnie z odpowiednimi parametrami i wypłukać boki oraz dno sondy.Przepłucz końcówkę sondy trzykrotnie zgodnie z instrukcją, wycierając sondę pomiędzy każdym roztworem. Gdy sonda będzie gotowa, zanurz jej końcówkę w buforze do homogenizacji jednej próbki i rozpocznij sonikację, dostarczając łącznie 25 impulsów. Gdy tkanka zostanie całkowicie zawieszona, odwiruj homogenizat i przenieś nadsącz do czystej probówki.Należy uważać, aby nie uszkodzić podniebienia. Choć dostępnych jest wiele innych technik homogenizacji, probacja jest lepsza do izolowania niewielkich ilości nasion protio patyckich z próbek biologicznych. Dysocjacja mechaniczna umożliwia spójny i wydajny rozkład tkanki oraz późniejszą ekstrakcję nasion.Następnie należy podzielić nadnadkład na aalikwoty i przechowywać lizaty w temperaturze -80°C. Aby zregenerować komórki biosensora w warunkach sterylnych, należy wypłukać każdą linię komórkową ciepłym PBS, a następnie inkubować przez trzy minuty z trypsyną EDTA. Po odklejeniu się komórek należy zatrzymać reakcję ciepłą pożywką hodowlaną i niezwłocznie przenieść komórki do probówki stożkowej.Odwiruj zawiesinę komórek, resuspendując osad w świeżej pożywce. Następnie policz komórki i przygotuj główny roztwór (master mix) z rozcieńczeniem komórek w stężeniu 3 500 000 komórek na 13 mililitrów pożywki. Używając pipety wielokanałowej, powoli przenieś 130 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studni płytki 96-dołkowej z płaskim dnem, przeznaczonej do hodowli tkanek, dbając o to, aby końcówki pipety znajdowały się w centrum studni i nie dotykały dna płytki.Po wysianiu komórek należy pozostawić je w spokoju na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C, przy 5% carbon dioxide i wilgotności względnej większej niż lub równej 80%. Następnego dnia, gdy komórki biosensora osiągną 60 do 65% konfluencji, należy połączyć medium z obniżoną zawartością surowicy, odczynnik liposomalny oraz biologiczne źródło materiału siewnego w celu przygotowania kompleksów transdukcyjnych. Następnie za pomocą pipety należy nanieść 20 µL kompleksu transdukcyjnego po ściance każdego poszczególnego dołka biosensora i ponownie umieścić potraktowane komórki w inkubatorze na kolejne 24 do 48 godzin przed zbiorami.Nieleczone komórki wykażą jedynie fluorescencję rozproszoną. Jednak komórki poddane działaniu materiału nasiennego białka tau wykażą jasne agregaty. Po jednym lub dwóch dniach, w celu zebrania komórek, należy zastąpić pożywkę hodowlaną 50 µL trypsyny z EDTA, aby zatrzymać reakcję. Po pięciu minutach, dodając 150 µL schłodzonej pożywki hodowlanej, należy niezwłocznie przenieść komórki do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem i odwirować komórki, odessać nadnadmiary cieczy, nie naruszając osadu, a następnie delikatnie, lecz dokładnie resuspender komórki w 50 µL 2% paraformaldehydu na 10 minut.Następnie ponownie odwiruj komórki i jak najszybciej resuspenduj osady w 200 µL schłodzonego buforu do cytometrii przepływowej. Po fixacji umieść płytkę w kompatybilnym cytometrze przepływowym i wygeneruj wykres bivariantny przedstawiający pole rozproszenia bocznego (side scatter area) względem pola rozproszenia przedniego (forward scatter area). Następnie, przy uruchomionej linii komórkowej numer jeden, dostosuj napięcia rozproszenia bocznego i przedniego, aż populacja komórek znajdzie się w dolnym lewym kwadrancie.Następnie za pomocą narzędzia wielokąta wyznacz populację komórek jako bramkę P1. Teraz stwórz wykres bivariant wysokości rozproszenia przedniego (forward scatter height) względem powierzchni rozproszenia przedniego (forward scatter area) i zastosuj bramkę P1. Następnie wyznacz pojedyncze komórki jako bramkę P2 i wygeneruj dla każdej z nich jeden histogram.W przypadku filtrów C-F-P-Y-F-P oraz fret, zastosuj bramkę P do dwóch lub trzech różnych histogramów, po jednym dla filtrów C-F-P-Y-F-P i fret w celu kompensacji. Dodaj 30 µL zawiesiny linii komórkowej jeden do 200 µL zawiesiny linii komórkowej dwa. Następnie kliknij ikonę ustawień instrumentu, a następnie kartę kompensacji i zaznacz pole matryca, aby otworzyć tabelę kompensacji.Wygeneruj wykres obszaru FRET względem obszaru CFP w zależności od zmiennej i zastosuj bramkę P2. Następnie, przy aktywnych liniach komórkowych cell line one i cell line two, kliknij ikonę ćwiartek i narysuj ćwiartki w taki sposób, aby populacje fluorescencyjnie negatywne i pozytywne zostały rozdzielone przez dwa dolne ćwiadry. Teraz utwórz tabelę statystyk wyświetlającą medianę intensywności fluorescencji lub MFI dla FRET w bramkach LL3 i LR3, a następnie dostosuj parametr FRET w macierzy kompensacji tak długo, aż MFI sygnału FRET będzie w przybliżeniu równa dla LL3 i LR3.Następnie utwórz wykres korelacyjny obszaru YFP względem obszaru CFP z podziałem na kwadranty. Dostosuj parametr YFP w macierzy kompensacji, aż MFI sygnału YFP będzie w przybliżeniu równy w obu kwadrantach. Postępuj analogicznie do metody przedstawionej wcześniej dla cytometrii przepływowej FRET.Podstawowe przenikanie fluorescencji (spillover) występuje z CFP do kanału detekcji FRET, co można skorygować poprzez kompensację fluorescencji z wykorzystaniem komórek dodatniej kontroli jednobarwnej. Po ustawieniu wszystkich bram i przeprowadzeniu kompensacji sygnału CFP, zaznacz interesujące studnia i uruchom analizę pozostałej części płytki w celu analizy danych. W pierwszej kolejności zdefiniuj komórki oraz pojedyncze komórki, stosując te same parametry, które ustawiamy podczas analizy przepływowej.Następnie, korzystając z linii komórkowej numer trzy, nanieś komórki pojedynczo dodatnie dla YFP na wykres FRET względem YFP według wariantu. Narysuj bramkę wielokątną biegnącą wzdłuż i z dala od nachylenia populacji komórek dodatnich dla FRET, aby zdefiniować bramkę fałszywego FRET, która wyklucza przenikanie sygnału YFP do filtra FRET. Po zastosowaniu bramki fałszywego FRET do wszystkich próbek, nanieś komórki C-F-P-Y-F-P traktowane pustymi liposomami na wykres FRET względem CFP według wariantu i wprowadź bramkę wielokątną wzdłuż nachylenia populacji, która rozciąga się w górę i w lewo, oddalając się od tej populacji.Wszystkie zdarzenia przesunięte do tej bramki uznaje się za fret dodatnie, a procent komórek będzie korelował z mianem nasion użytych podczas zabiegu. Na koniec zapisz interesujące parametry analizy, w tym procent pozytywności fret oraz medianę intensywności fluorescencji (MFI) komórek fret dodatnich. Następnie oblicz iloczyn procentu pozytywności i MFI, aby ręcznie wyznaczyć zintegrowaną gęstość fret.W przypadku braku agregatów lub zarodników tau, białko tau pozostaje w rozpuszczalnym stanie monomerowym, co przejawia się stałym, rozproszonym i negatywnym sygnałem fluorescencyjnym FRET. Po wprowadzeniu zarodników tau do komórek biosensora, endogenne białko tau zostaje przekształcone w stan zagregowany i pozytywny pod kątem FRET, co potwierdza ilościowe oznaczenie FRET. Analiza przepływowa (cytometria przepływowa) potwierdza, że femtomolarne stężenia rekombinowanego białka tau są wystarczające do detekcji.Tkanka pnia mózgu myszy z tauopatią, uśpionych w różnym wieku, służy jako reprezentatywny obszar mózgu wykazujący spójną aktywność zasiewu we wszystkich zwierzętach już w wieku 1,5 miesiąca. W tym eksperymencie homogenaty mózgowe osób z chorobą Alzheimera wykazywały silną aktywność zasiewu, podczas gdy grupa kontrolna w tym samym wieku oraz osoby z chorobą Huntingtona nie wykazywały takiej aktywności, co potwierdza specyficzność testu wobec agregatów białka tau. Nieprzetworzone pierwotne hodowle neuronalne transdukowane lentiwirusem niosącym konstrukty tau-CFP i tau-YFP wykazywały rozproszony sygnał fluorescencyjny po podaniu rekombinowanych nasion tau.Jednakże endogenna białko tau tworzy duże agregaty wykrywalne za pomocą cytometrii przepływowej FRET nawet w przypadku braku transdukcji zapśredniczonej przez liposomy. Gdy źródła zarodników są inkubowane z lekami hamującymi pobieranie białka tau, takimi jak heparyna, i poddane działaniu w nieobecności liposomów, aktywność zarodnikowania zawarta zarówno w próbkach rekombinowanych fis, jak i w próbkach mózgu myszy z taupatią, może zostać zablokowana. Po opanowaniu techniki.Technikę tę można przeprowadzić w ciągu trzech dni, przy czym każdego dnia praca przy stole laboratoryjnym zajmuje od jednej do dwóch godzin. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że niektóre kroki będą wymagały optymalizacji wewnątrz laboratorium. Dotyczy to na przykład określania skutecznych mian z nasion protio-patogennych pochodzących z różnych źródeł biologicznych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować, przeprowadzić i przeanalizować eksperymenty cytometrii przepływowej FRET w celu wykrywania aktywności siewnej białek patologicznych pochodzących ze źródeł rekombinowanych i biologicznych.

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Film demonstruje immunologiczną metodę monitorowania in vivo indukowanej adiuwantem produkcji cytotoksycznych limfocytów T lub CTL. Myszowi wstępnie wstrzykuje się genetycznie zmodyfikowane, proliferacyjne, barwione barwnikiem limfocyty T CD8 + dawcy. Podskórne wstrzyknięcie albuminy jaja kurzego z adiuwantami generuje cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, które są identyfikowane po zbiorze za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Immunologiczna technika monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T za pośrednictwem adiuwantów

Wideo demonstruje test cytometrii przepływowej rezonansu fluorescencji (FRET) w celu wykrycia aktywności wysiewu agregatów białkowych wyizolowanych z próbek biologicznych. Komórki ssaków wykazujące ekspresję białek reporterowych tau są inkubowane z kompleksami transdukcji liposomów zawierającymi nasiona tau. Nasiona te pośredniczą w agregacji białek reporterowych, prowadząc do generowania dodatniego sygnału FRET w cytometrze przepływowym.

Technika cytometrii przepływowej FRET do wykrywania agregacji białek reporterowych indukowanej nasionami Tau

Opisana tutaj jest metoda wykrywania i ilościowego oznaczania białek zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez immunoznakowanie mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być rozszerzona o ocenę funkcjonalnych aspektów subpopulacji mitochondrialnych.

Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Istnieje wiele różnych metod pomiaru pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Przy określaniu najodpowiedniejszej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono dwa protokoły pomiaru EV, wykorzystujące albo indywidualną detekcję, albo podejście oparte na kulkach.

Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.

Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Prezentowany tutaj jest protokół pomiaru proliferacji limfocytów T CD4+ w odpowiedzi na antygenowe białka lub peptydy za pomocą rozcieńczenia barwnika. Test ten jest szczególnie czuły w przypadku rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu i może być modyfikowany w celu ułatwienia klonowania komórek specyficznych dla antygenu.

Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Koniecznym krokiem w rozwoju aptameru przeciwnowotworowego jest przetestowanie jego wiązania z celem. Demonstrujemy test oparty na cytometrii przepływowej w celu zbadania tego wiązania, podkreślając znaczenie włączenia aptameru kontroli ujemnej i komórek rakowych, które są dodatnie lub ujemne dla tego konkretnego białka.

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

Ten protokół opisuje opartą na cytometrii przepływowej, wysokoprzepustową metodę przesiewową w celu identyfikacji małocząsteczkowych leków, które hamują aktywację integryny β2 na ludzkich neutrofilach.

Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Poznaj metodę FRET cytometrii przepływowej do wykrywania proteopatycznej aktywności wysiewu w próbkach biologicznych. Technika ta umożliwia czułą detekcję agregatów białkowych w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

Czułe wykrywanie proteopatycznej aktywności wysiewu za pomocą cytometrii przepływowej FRET

Przeglądaj więcej filmów