Czułe wykrywanie proteopatycznej aktywności wysiewu za pomocą cytometrii przepływowej FRET

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie protiopatycznej aktywności wysiewu ze źródeł rekombinowanych lub biologicznych, co umożliwi czułe wykrywanie białka, agregatów i próbki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurodegeneracji. Na przykład, w jaki sposób możemy ilościowo ocenić zmiany w aktywności wysiewu po interwencji terapeutycznej w zwierzęcych modelach choroby?

Do zalet tej techniki należy jej wysoka specyficzność w stosunku do niskich poziomów agregatów białkowych. Jego wyjątkowa specyfika, łatwość użycia i wysoka przepustowość. Dzisiaj zademonstruję tę procedurę wraz ze współautorem Brandonem Holmesem.

Aby przygotować biologiczny materiał siewny, zacznij od zważenia zamrożonej tkanki mózgowej w jednorazowej łódce serwatkowej. Następnie przenieś tkankę do stożkowej probówki, dodaj lodowaty bufor homogenizacyjny, tak aby końcowy roztwór wynosił 10%, aby poczekać na objętość i przenieść próbki do zimnego pomieszczenia na lodzie. Następnie ustaw wskaźnik sondy na odpowiednie ustawienia i spłucz bok i spód sondy.

Tak więc końcówka wskaźnika trzy razy zgodnie ze wskazaniami, wycierając sondę między każdym roztworem. Gdy sonda jest gotowa, zanurz końcówkę w buforze homogenizacyjnym jednej próbki i uruchom sonikat dostarczając łącznie 25 impulsów. Gdy tkanka jest całkowicie w zawiesinie, odwirować homogenat i przenieść supinat do czystej probówki.

Uważając, aby nie przeszkadzać podniebieniu. Chociaż dostępnych jest wiele innych technik homogenizacji, probacja jest lepsza w przypadku izolowania niewielkich ilości nasion protio pathic z próbek biologicznych. Dysocjacja mechaniczna umożliwia konsekwentny i wydajny rozkład tkanki, a następnie ekstrakcję nasion.

Następnie podwielokrotnić leżąc na wznak i przechowywać lizaty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby odtworzyć komórki biosensora w sterylnych warunkach, przepłucz każdą linię komórkową ciepłym PBS, a następnie wykonaj trzyminutową inkubację z trypsyną EDTA. Gdy komórki się odłączą, przerwij reakcję z ciepłą pożywką hodowlaną i natychmiast przenieś komórki do stożkowej probówki.

Odwirować resztki komórek, zawieszając osad w świeżym podłożu. Następnie policz komórki i wykonaj rozcieńczenie komórek mieszanki głównej 3 500 000 komórek na 13 mililitrów pożywki. Za pomocą pipety wielokanałowej powoli przenieś 130 mikrolitrów komórek do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce z płaskim dnem i hodowli tkankowej, uważając, aby umieścić końcówki pipet na środku studzienek, nie dotykając dna płytki.

Po pokryciu komórek pozostaw je na spokojne spoczynek przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności względnej większej lub równej 80%. Następnego dnia, gdy komórki biosensora są w 60 do 65% zlewne, połącz zredukowany odczynnik liposomowy pożywki surowicy i biologiczne źródło nasion, aby utworzyć kompleksy transdukcyjne. Następnie pipetować 20 mikrolitrów kompleksu transdukcyjnego wzdłuż boku każdego pojedynczego biosensora i zwrócić leczone komórki do inkubatora na kolejne 24 do 48 godzin przed pobraniem.

Nieleczone komórki będą wykazywać tylko rozproszoną fluorescencję. Jednak komórki potraktowane materiałem siewnym tau będą wykazywać jasne agregaty Po jednym do dwóch dni na zebranie komórek zastąp pożywkę do hodowli komórkowej 50 mikrolitrami tryin EDTA, zatrzymując reakcję. Po pięciu minutach ze 150 mikrolitrami schłodzonej hodowli, pożywki, natychmiast przenieś komórki na 96-dołkową okrągłą płytkę dolną i zagnieźdź komórki, odessaj supernatanty S bez naruszania osadów, a następnie delikatnie, ale dokładnie zresusuj komórki w 50 mikrolitrach 2% paraldehydu na 10 minut.

Następnie ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach schłodzonego buforu cytometrii przepływowej tak szybko, jak to możliwe. Po utrwaleniu załaduj płytkę na cytometr przepływowy kompatybilny z progami i wygeneruj obszar rozproszenia bocznego w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu na wykresie wariantowym. Następnie, gdy uruchomiona jest pierwsza linia komórkowa, dostosuj napięcia rozpraszania bocznego i przewodzenia, aż populacja komórek znajdzie się w lewym dolnym kwadrancie.

Następnie za pomocą narzędzia wielokąta zdefiniuj populację komórek jako chód P jeden. Teraz utwórz wysokość rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu według wykresu wariantu i zastosuj bramkę P one. Następnie zdefiniuj pojedyncze komórki jako chód P dwa i wygeneruj po jednym histogramie każda.

W przypadku filtrów C-F-P-Y-F-P i progów zastosuj bramkę P od dwóch do trzech różnych histogramów, po jednym dla C-F-P-Y-F-P i filtrów progowych w celu kompensacji. Skok w 30 mikrolitrach jednej zawiesiny linii komórkowej do 200 mikrolitrów zawiesiny drugiej linii komórkowej. Następnie kliknij ikonę ustawień przyrządu, a następnie zakładkę kompensacji i sprawdź matrycę, aby otworzyć tabelę kompensacji.

Wygeneruj obszar progów w funkcji obszaru CFP za pomocą wykresu wariacyjnego i zastosuj bramkę P dwa. Następnie, gdy uruchomiona jest pierwsza linia komórkowa i linia komórkowa druga, kliknij ikonę kwadrantu i narysuj ćwiartki, takie jak fluorescencyjne populacje ujemne i dodatnie, które są oddzielone dwoma dolnymi kwadrantami. Teraz utwórz tabelę statystyk, która wyświetla medianę intensywności fluorescencji lub MFI progu dla trzech bramek LL i LR trzy i dostosuj parametr progu w macierzy kompensacji, aż MFI sygnału progu będzie w przybliżeniu równe między LL trzy a LR trzy.

Następnie utwórz obszar YFP w stosunku do obszaru CFP na wykresie wariacyjnym z kwadrantami. Dostosuj parametr YFP w macierzy kompensacji, aż MFI sygnału YFP będzie w przybliżeniu równy między kwadrantami. Podobny do pokazanego wcześniej dla cytometrii przepływu fretowego.

Pierwotne rozlanie się fluorescencji następuje z CFP emitowanego do kanału detekcji progów, który można skorygować poprzez kompensację fluorescencji za pomocą jednokolorowych dodatnich komórek kontrolnych, gdy wszystkie bramki zostały ustawione, a sygnał CFP został skompensowany. Podświetl interesujące Cię studnie i uruchom pozostałą część płytki, aby przeanalizować dane. Najpierw zdefiniuj komórki i pojedyncze komórki przy użyciu tych samych parametrów, które konfigurujemy analizę przepływu.

Następnie, używając trzeciej linii komórkowej, wykreśl pojedyncze dodatnie komórki YFP w progu w porównaniu z YFP według wykresu wariantowego. Narysuj wielokątną bramkę biegnącą wzdłuż i od nachylenia populacji komórek z dodatnim progiem, aby zdefiniować fałszywy chód progowy, który wyklucza rozlanie się YFP do filtra progowego. Po zastosowaniu chodu fałszywego progu do wszystkich próbek, wykreśl puste komórki C-F-P-Y-F-P poddane działaniu liposomów na progu w stosunku do CFP na wykresie zmiennym i wprowadź wielokątną ga wzdłuż nachylenia populacji, która rozciąga się w górę i w lewo od populacji.

Wszelkie zdarzenia, które przesuwają się do tej bramki, są uważane za progowo-dodatnie, a procent komórek będzie skorelowany z mianem nasion użytym podczas zabiegu. Na koniec zapisz interesujące Cię parametry analizy, w tym procent dodatniej fret dodatniej i medianę intensywności fluorescencji komórek fret dodatnich. Następnie zmierz iloczyn procentu dodatniości i MFI, aby ręcznie obliczyć zintegrowaną gęstość progów.

W przypadku braku agregatów lub zarodków tau, tau jest utrzymywane w rozpuszczalnym stanie monomerycznym, reprezentowanym przez stały rozproszony i progowy ujemny sygnał fluorescencyjny. Po wprowadzeniu nasion tau do komórek biosensora, endogenne tau jest przekształcane w zagregowaną i dodatnią kwantyfikację progów w stanie dodatnim. Analiza przeprowadzona za pomocą cytometrii przepływowej potwierdza, że stężenia femtomolowe rekombinowanego tau są wystarczające do wykrycia. Tu.

Tkanka pnia mózgu myszy z tauopatią uśmierconych w różnym wieku służy jako reprezentatywny obszar mózgu, wykazując konsekwentne wykrywanie aktywności siewu u zwierząt już w wieku 1,5 miesiąca. W tym eksperymencie mózg jednorodny od osób z chorobą Alzheimera wykazywał silną aktywność wysiewu, podczas gdy osoby z grupą kontrolną i chorobą Huntingtona w tym samym wieku nie wykazały swoistości testu dla agregacji tau w nieleczonych pierwotnych kulturach neuronalnych transdukowanych tau, CFP i tau. Konstrukty lentiwirusowe YFP wykazywały rozproszony sygnał fluorescencyjny po potraktowaniu rekombinowanymi nasionami tau.

Jednak endogenne tau tworzy duże agregaty wykrywalne za pomocą cytometrii przepływu fretowego nawet przy braku transdukcji za pośrednictwem liposomów. Gdy źródła nasion są wstępnie inkubowane z lekami, które hamują wychwyt tau, takimi jak heparyna, i są traktowane przy braku liposomów, aktywność wysiewu zawarta zarówno w rekombinowanych fis, jak i próbkach mózgu myszy tauopatii może zostać zablokowana. Raz opanowane.

Technikę tę można wykonać w ciągu trzech dni, przy czym każdego dnia wystarczy jedna do dwóch godzin pracy na stole. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że w przypadku niektórych kroków wymagana będzie wewnętrzna optymalizacja. Na przykład przy określaniu efektywnych mian z nasion protio pathic z różnych źródeł biologicznych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak konfigurować, uruchamiać i analizować eksperymenty cytometrii przepływu fret w celu wykrycia protiopatyczna aktywność wysiewu ze źródeł rekombinowanych i biologicznych.