Aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura mierzona spektrofluorometrią po zawale mięśnia sercowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar aktywności kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura po zawale mięśnia sercowego z wykorzystaniem spektrofluorometrii. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuronauki behawioralnej, takie jak skutki zawału mięśnia sercowego dla funkcji poznawczych, zdrowia psychicznego, procesu starzenia się oraz snu. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota, szybkość i niezawodność.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wymaga ona zręczności niezbędnej do przeprowadzenia operacji i pobrania próbek tkanek. Procedurę zaprezentuje Kim Gilbert, asystent naukowy w naszym laboratorium. Po wprowadzeniu w stan znieczulenia zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi, należy potwierdzić prawidłowy przebieg znieczulenia poprzez sprawdzenie braku odruchu uciskania łapy.

Wykonaj intubację szczura za pomocą rurki endotrachealnej i ułóż zwierzę w pozycji brzusznej na podgrzewaczce w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie 37 °C. Podłącz rurkę endotrachealną do aparatu do znieczulania podającego 2% isofluranu. Następnie przygotuj pole operacyjne, odkażając je glukonianem chlorheksydyny i alkoholem izopropylowym.

Następnie należy nałożyć maść oftalmiczną do obu oczu, aby zapobiec ich wysychaniu. Przykryj zwierzę jałowym polem operacyjnym, aby stworzyć sterylną strefę wokół miejsca operacji. Wymagane jałowe instrumenty chirurgiczne umieść na innym jałowym polu obok zwierzęcia.

Następnie należy naciąć skórę za pomocą ostrza skalpela nr 10 lub nożyczek. Za pomocą nożyczek lub kleszczyków hemostatycznych należy odwarstwić tkankę mięśniową. Następnie używając nożyczek lub kleszczyków hemostatycznych, należy otworzyć ścianę klatki piersiowej i umieścić rozwierak klatki piersiowej, a następnie otworzyć osierdzie za pomocą kleszczyków hemostatycznych.

Aby wywołać zamknięcie tętnicy wieńcowej, najpierw załóż pętlę z nici jedwabnej o rozmiarze 4-0 i długości 360 millimeter wokół zstępującej tętnicy wieńcowej oraz przez przyległą tkankę mięśnia sercowego. Wprowadź oba końce nici jedwabnej do plastikowej rurki o rozmiarze 14-gauge i długości 1.25 centimeter. Pociągnij oba końce nici jedwabnej i dociśnij rurkę do tętnicy, aby doprowadzić do jej zamknięcia.

Zabezpiecz okluzję, zaciskając plastikową rurkę kleszczykami hemostatycznymi, i utrzymuj okluzję przez 40 minut. Po 40 minutach zwolnij okluzję, usuwając kleszczyki hemostatyczne, a następnie elastyczny dren oraz szew jedwabny. Zamknij klatkę piersiową szwem 2-0, wprowadź elastyczny cewnik do jamy klatki piersiowej i odessij powietrze z klatki piersiowej za pomocą strzykawki 10 ml, aby zapobiec odmie opłucnowej.

Zaszyj mięśnie nicią jedwabną 4-0, a skórę nicią jedwabną 3-0. Przed zawiązaniem ostatniego szwu skórnego ponownie odsysaj powietrze z klatki piersiowej, używając strzykawki 10 ml i cewnika. Zakończ zszywanie skóry, a następnie odstaw izofluran.

Umieść szczura w czystej klatce i monitoruj go podczas wybudzania z narkozy. Podawaj leki przeciwbólowe w dawkach powtarzanych co osiem godzin. Po humanitarnym ścięciu głowy zwierzęcia zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, umieść głowę szczura na szalce postawionej na kruszonym lodzie.

Za pomocą nożyczek otwórz czaszkę. Następnie użyj kleszczy kostnych, aby oddzielić pochewki kostne, pociągając je do góry, uważając, by nie uszkodzić leżącej poniżej tkanki. Następnie umieść płaskie ostrze szpatułki między dnem czaszki a tylną powierzchnią brzuszną mózgu i oddziel mózg od czaszki, delikatnie przesuwając ostrze do przodu i wyjmując mózg z czaszki.

Umieść mózg powierzchnią grzbietową do dołu. Zlokalizuj podwzgórze przed móżdżkiem i wykonaj cięcia koronalne mózgu przed tylnym końcem podwzgórza oraz za jego przednim końcem. Zidentyfikuj obustronne ciała migdałowate jako dwie małe sfery znajdujące się pod płatami skroniowymi, tuż obok podwzgórza.

Następnie należy położyć mózg płasko na przedniej części, tak aby powierzchnia grzbietowa była odwrócona od eksperymentatora. Kolejnym krokiem jest rozdzielenie półkul i usunięcie kory z obszaru ciągłego ciała migdałowatego. Po odsłonięciu ciała migdałowatego należy wyciąć je za pomocą skalpela.

Przetnij wzdłuż ciemnego szwu przebiegającego przez ciało migdałowate, aby oddzielić części boczno-podstawną i środkową centralną, a następnie umieść obie części w oddzielnych, oznakowanych probówkach w lodzie. Krok ten należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec degradacji enzymów. Po powtórzeniu procedury sekcji w drugiej półkuli, zanurz wszystkie cztery probówki w ciekłym azocie na jedną minutę, a następnie przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

Zacznij od dodania 150 µL buforu do lizy do każdych 5–10 mg próbki w warunkach chłodzenia na lodzie. Sonicuj każdą próbkę na lodzie z maksymalną intensywnością przez 5 sekund. Następnie inkubuj na lodzie przez 30 minut.

Podczas inkubacji mieszaj próbkę w wirówce typu vortex przez pięć sekund co pięć minut. Następnie przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania, umieszczając próbki naprzemiennie w ciekłym azocie oraz na płycie grzewczej z termostatem ustawionym na 37 °C. Po ostatnim cyklu zamrażania i rozmrażania odwiruj próbki tkanki z prędkością 1300 Gs w temperaturze 4 °C przez 10 minut.

Następnie ostrożnie odessaj nadsącz i przenieś go do nowej probówki umieszczonej w lodzie. Po oznaczeniu ilości białka zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym, dodaj 25 µg białka do probówki reakcyjnej zawierającej 0,8 µL 10 mM Ac-DEVD-AMC oraz bufor reakcyjny do uzyskania końcowej objętości 200 µL. W przypadku próbek kontrolnych ujemnych, połącz 25 µg białka z 1 µL 800 µM Ac-DEVD-CHO oraz 0,8 µL 10 mM Ac-DEVD-AMC.

Inkubować wszystkie próbki i kontrole w ciemności przez trzy godziny w temperaturze 37°C. Po upływie czasu inkubacji zatrzymać reakcję, dodając do każdej próbki i kontroli 600 µL 0,4 M glicyny i 0,4 M wodorotlenku sodu o pH 10. Do każdej reakcji w kuwecie szklanej dodać dwa mililitry wody destylowanej.

Ilościowo określ fluorescencję za pomocą spektrofluorometrii. Odczytaj wartości dla kontroli i próbek przez 10 s, wykonując jeden pomiar w każdej sekundzie. Na koniec oblicz aktywność właściwą w każdej próbce zgodnie z formułą wyświetloną teraz na ekranie.

Ten histogram przedstawia aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczurów, u których wystąpił zawał mięśnia sercowego. Dane wyrażono jako procent średniej aktywności w grupie kontrolnej (operacja pozorowana), przyjętej jako 100%. Każda grupa składała się z ośmiu szczurów. Gwiazdka oznacza istotną różnicę między grupami przy wartości p mniejszej niż 0,05.

Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu siedmiu godzin, z wyłączeniem odstępu czasu między operacją zawału mięśnia sercowego a pobraniem tkanek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wywołać zawał mięśnia sercowego u szczura oraz jak zmierzyć aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura przy użyciu spektrofluorometrii.