Name: Aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura mierzona spektrofluorometrią po zawale mięśnia sercowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura po zawale mięśnia sercowego przy użyciu spektrofluorometrii. Ta technika pozwala badać apoptozę w neuronauki i kardiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z Kanadyjskiej Rady Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych. Kim Gilbert jest stypendystką Fonds de la recherche du Québec - Santé.

Ze zwierzętami obchodzimy się zgodnie z przepisami lokalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami, zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Szczury są trzymane pojedynczo w stałych warunkach (temperatura 21-22 ºC i wilgotność 40-50%), w tym 12-godzinny cykl ciemnego światła, rozpoczynający się o godzinie 08:00. Granulki z chow i woda z kranu są dostępne ad libitum przez cały czas trwania badania. Przed eksperymentem dopuszczalny jest okres aklimatyzacji wynoszący 3 dni po dostawie przez dostawcę. Samce szczurów Sprague-Dawley o wadze od 300 do 800 g były rutynowo wykorzystywane z tym protokołem.
1. Chirurgia mięśnia sercowego
<ol>
	<li>Wywołać znieczulenie za pomocą dootrzewnowych wstrzyknięć ketaminy 60 mg/kg i ksylazyny 10 mg/kg. Potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez brak odruchu, gdy łapy są ściśnięte.</li>
	<li>Ogolić miejsce operacji. Zaintubuj szczura rurką dotchawiczą: cewnik (16 G 1,77 cala) i umieść zwierzę w bocznej pozycji odleżynowa. Umieść zwierzęta na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę około 37 °C. Podłącz rurkę dotchawiczą do izofluranu 2%.</li>
	<li>Przygotować miejsce operacji za pomocą glukonianu chlorheksydyny i alkoholu izopropylowego. Podczas zabiegu należy używać sterylnych rękawiczek i wysterylizowanych narzędzi. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Umieść sterylne pole na zwierzęciu, a narzędzia na innym sterylnym polu obok zwierzęcia.</li>
	<li>Naciąć skórę ostrzem skalpela #10. Oderwij tkankę mięśniową za pomocą zacisku hemostatycznego. Umieść zwierzę w brzusznej pozycji odleżynowej. Otwórz ścianę klatki piersiowej za pomocą hemostatycznego zacisku i pozycyjnego zwijacza klatki piersiowej. Otwórz osierdzie za pomocą zacisku hemostatycznego.</li>
	<li>Aby wywołać niedrożność naczyń wieńcowych, owiń jedwabny szew 4-0 o długości 360 mm wokół zstępującej tętnicy wieńcowej, przechodząc przez przylegającą tkankę mięśnia sercowego. Włóż oba końce jedwabnego szwu do plastikowej rurki o długości 14 g i 1,25 cm.</li>
	<li>Pociągnij oba końce jedwabnego szwu i dociśnij rurkę do tętnicy, aby ją zatkać, przez 40 minut. Zabezpiecz okluzję, zaciskając plastikową rurkę za pomocą hemostatycznego zacisku.</li>
	<li>Po 40 minutach zwolnij okluzję, zwalniając zacisk hemostatyczny, a następnie usuń elastyczną rurkę i szew jedwabny. 
	Uwaga: Szczury z grupy kontrolnej przechodzą ten sam zabieg chirurgiczny bez niedrożności tętnicy wieńcowej.</li>
	<li>Przed zamknięciem ściany klatki piersiowej należy umieścić elastyczny cewnik (18 G, 4,5 cm) przez jamę klatki piersiowej, aby wyciągnąć powietrze z klatki piersiowej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml, aby zapobiec odmie opłucnowej.</li>
	<li>Zamknij jamę klatki piersiowej szwem 2-0, zszyj mięsień szwem jedwabnym 4-0, a skórę szwem jedwabnym 3-0.</li>
	<li>Przed zamknięciem ostatniego punktu skórnego należy ponownie pobrać powietrze z klatki piersiowej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml przez cewnik umieszczony wcześniej w jamie klatki piersiowej.</li>
	<li>Zszyj ostatni punkt skóry. Zatrzymać wentylację izofluranem.</li>
	<li>Monitoruj budzenie się szczurów. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.</li>
	<li>Szczura należy leczyć co 8 godzin przez 24 godziny lekiem przeciwbólowym (buprenorfina, 0,05 mg/kg i.p.) i antybiotykiem (pojedyncza dawka duplocyliny, 0,2 mg/kg i.p.).</li>
	<li>Po zabiegu szczury domowe są pojedynczo do czasu złożenia ofiary, tj. 3 dni po zawale mięśnia sercowego.</li>
	<li>Wielkość zawału, głównie martwicy, jest wyrażona jako odsetek tkanki zawału w obszarze zagrożonym lewą komorą. Można to zmierzyć za pomocą zabarwienia trifenylotetrazolium11.</li>
</ol>
2. Izolacja ciała migdałowatego
<ol>
	<li>Umieść głowę zwierzęcia najpierw w torbie w kształcie stożka, z nosem wystającym z wąskiego otworu końcowego. Zabezpiecz szczura, aby uniknąć jakiegokolwiek ruchu. Ustaw jego głowę odpowiednio na gilotynie, między ostrzami nożyczek. Odetnij głowę zwierzęcia.</li>
	<li>Umieść głowę szczura w naczyniu trzymanym na pokruszonym lodzie. Wszystkie procedury izolacji tkanek należy wykonać na kruszonym lodzie (4 °C).</li>
	<li>Rozetnij czaszkę nożyczkami, ostrożnie odłącz pochewki kostne za pomocą kostnych rongeurów, podciągając i unikając okaleczania tkanki pod spodem.</li>
	<li>Umieść płaskie ostrze szpatułki między dnem czaszki a tylną brzuszną powierzchnią mózgu i ostrożnie odłącz mózg od czaszki, delikatnie popychając ostrze do przodu wzdłuż dna czaszki, aż mózg będzie mógł być powoli wynoszony z czaszki. Wyrzuć czaszkę.</li>
	<li>Umieść mózg na jego grzbietowej powierzchni. Zidentyfikuj podwzgórze (strukturę przed móżdżkiem) i przetnij mózg koronalnie przed jego przednim końcem i za tylnym końcem; Wyrzuć przednią i tylną część mózgu, jeśli nie jest potrzebna do innych zastosowań.</li>
	<li>Wyobraź sobie ciało migdałowate jako małe kulki pod płatami skroniowymi, obustronnie, tuż obok podwzgórza.</li>
	<li>Odwróć mózg płasko na jego przednim końcu, na powierzchni grzbietowej od eksperymentatora.</li>
	<li>Zacznij od lewej lub prawej półkuli mózgu. Oddziel półkule, a następnie korę mózgową od przyległego ciała migdałowatego. Wytnij około 8 mm tej luźnej kory, aby umożliwić izolację ciała migdałowatego. Odetnij ciało migdałowate skalpelem.</li>
	<li>Odizoluj podstawno-boczną część ciała migdałowatego od jego części środkowo-przyśrodkowej, przecinając wzdłuż ciemnego szwu, który biegnie w poprzek, prawie pół na pół. Struktura ta nie zawsze jest łatwa do zidentyfikowania.</li>
	<li>Umieścić części ciała migdałowatego w oddzielnych zidentyfikowanych fiolkach i trzymać na rozdrobnionym lodzie.</li>
	<li>Powtórz procedurę preparacji z drugą półkulą.</li>
	<li>Zanurzyć fiolki w ciekłym azocie na 1 minutę. Fiolkę należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80°C do czasu, gdy będzie potrzebna.</li>
</ol>
3. Aktywność kaspazy-3
<ol>
	<li>Przygotować bufor do lizy z 0,32 M sacharozy, 1% Triton-X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego, 2 mM ditiotreitolu, 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 10 μg/μl leupeptyny, 10 μg/μl pepstatyny A i 10 μg/μl aprotyniny.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 150 μl buforu do lizy (5-10 mg). Trzymaj na lodzie. Poddaj sonikę każdej próbce na lodzie przez 5 sekund z maksymalną intensywnością (40 W). Inkubować tkankę w buforze do lizy na lodzie przez 30 minut. Wirować każdą próbkę przez 5 minut.</li>
	<li>Wykonać 3 cykle zamrażania/rozmrażania, umieszczając próbki na przemian w ciekłym azocie i na termostatycznie sterowanej płycie grzewczej ustawionej na 37 °C. Odwirować tkankę w temperaturze 13 000 g (4 °C) przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i przechowywać w probówce na lodzie.</li>
	<li>Przygotować wzorcowe stężenia białka między 0 a 10 μg/ml z albuminą surowicy bydlęcej. Przygotować półfabrykaty tylko z buforem.</li>
	<li>Do każdego wzorca dodać 200 μl odczynnika Bradford. Odczyt standardowy przy długości fali 595 nm. Aby uzyskać poziom białka, dodaj 5 μl supernatantu próbki do 795 μl wody destylowanej i 200 μl odczynnika Bradford. Odczytać każdą próbkę przy długości fali 595 nm i określić ilościowo białko za pomocą krzywej wzorcowej.</li>
	<li>Przygotować bufor reakcyjny z 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM MgCl2, 1 mM glikolu etylenowego kwasu tetraoctowego, 0,1% 3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonianu i 1 mM ditiotreitolu.</li>
	<li>Dodać 25 μg białka do buforu reakcyjnego i substratów kaspazy-3, aby uzyskać dodatnie i ujemne próbki reaktywne. W przypadku próbek ujemnych dodać bufor reakcyjny, 25 μg białka, 0,4 μl Ac-DEVD-CHO 800 μM i 0,8 μl Ac-DEVD-AMC 10 mM. W przypadku próbek dodatnich należy dodać 25 μg białka do buforu reakcyjnego i 0,8 μl Ac-DEVD-AMC 10 mM. Wszystkie próbki ujemne i dodatnie należy przetworzyć trzykrotnie. Uzupełnić końcową objętość każdej próbki do 200 μl, dodając bufor reakcyjny.</li>
	<li>Uzyskać kontrole ujemne, dodając 188,7 μl buforu reakcyjnego do 0,5 μl Ac-DEVD-CHO 800 μM, 0,8 μl Ac-DEVD-AMC 10 mM i 10 μl buforu do lizy. W przypadku kontroli dodatnich dodać 189,2 μl buforu reakcyjnego, 0,8 μl Ac-DEVD-AMC 10 mM i 10 μl buforu do lizy.</li>
	<li>Inkubować próbki i próby kontrolne w ciemności przez 3 godziny w temperaturze 37oC.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję z 600 μl glicyny 0,4 M i NaOH 0,4 M (pH 10) w każdej próbce i kontroli.</li>
	<li>Określić ilościowo fluorescencję za pomocą spektrofluorometrii przy długości fali wzbudzenia 365 nm i długości fali emisji 465 nm. Dodaj 2 ml wody destylowanej do reakcji w szklanej kuwecie. Odczytywanie danych kontrolnych i próbek przez 10 sekund z 1 punktem na każdą sekundę.</li>
	<li>Określić ilościowo aktywność właściwą w każdej próbce: ((fluorescencja próbek ujemnych minus fluorescencja próbek dodatnich) x objętość 2,8 ml) podzielone przez (czas inkubacji 3 godziny x ilość białka 25 mg).</li>
</ol>

<ol><li>Denault, J. B., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+keys+in+the+ignition+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Caspases: keys in the ignition of cell death.</a> Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).</li>
<li>Boucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-ischemic+cardioprotection+by+A2A+adenosine+receptors%3A+dependent+of+phosphatidylinositol+3-kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).</li>
<li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celecoxib+after+the+onset+of+reperfusion+reduces+apoptosis+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala.</a> Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).</li>
<li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+time+course+in+the+limbic+system+after+myocardial+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat.</a> Brain Research. 1216, 87-91 (2008).</li>
<li>Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R. Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRousseau%2C+G+%22Novel+Strategies+in+Ischemic+Heart+Disease+%22">Novel Strategies in Ischemic Heart Disease </a>. Lakshmanadoss, U. , 333-362 (2012).</li>
<li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+detected+in+the+amygdala+following+myocardial+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat.</a> Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).</li>
<li>Arseneault-Breard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Lactobacillus+helveticus+R0052+and+Bifidobacterium+longum+R0175+reduces+post-myocardial+infarction+depression+symptoms+and+restores+intestinal+permeability+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model.</a> British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).</li>
<li>Bah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escitalopram+reduces+circulating+pro-inflammatory+cytokines+and+improves+depressive+behavior+without+affecting+sleep+in+a+rat+model+of+post-cardiac+infarct+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression.</a> Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).</li>
<li>Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li>
<li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li>
<li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D1%2C+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid%2C+decreases+post-myocardial+infarct+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li>
<li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction%3A+effects+of+sertraline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, Oxford, England. 451-459 (2009).</li>
<li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+re-visited%3A+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%3A+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li>
<li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Killing+the+blues%27%3A+a+role+for+cellular+suicide+%28apoptosis%29+in+depression+and+the+antidepressant+response%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response.</a> Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+paper+wraps+stone+blunts+scissors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors.</a> Cell. 102, 1-4 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasze doświadczenia z tym protokołem w ciągu ostatnich 10 lat doprowadziły do zidentyfikowania krytycznych problemów metodologicznych. Po pierwsze, szybka sekcja mózgu na szalce Petriego na kruszonym lodzie jest ważna dla utrzymania jakości przygotowania. Po drugie, należy zdać sobie sprawę, że sonikacja tkanek jest krótsza w przypadku ciała migdałowatego mózgu w porównaniu z innymi typami tkanek, takimi jak serce (10 sekund) lub nerki (20 sekund). Po trzecie, należy zachować szczególną ostrożność, aby dokładnie wymieszać podłoże przed dodaniem go do próbek. Napotkaliśmy zmienne sygnały, gdy sekwencja mieszania była nieodpowiednia. Po czwarte, podczas odczytu próbek w komórce kwarcowej nie powinno być żadnych pęcherzyków. W przeciwnym razie sygnał może zostać zmieniony.
W ciągu ostatnich kilku lat wprowadziliśmy zmianę, aby zwiększyć powtarzalność wyników: zwiększyliśmy objętość substratu, aby uniknąć objętości mniejszej niż 1 μl. Mimo to mogą wystąpić niewielkie różnice między kolejnymi testami, a do kontroli zmian należy użyć co najmniej 3 próbek kontrolnych. Pomiary fluorescencji tych kontroli są uśredniane, a średnia jest ustalana na 100%. Pomiary fluorescencji w próbkach eksperymentalnych są przekształcane w procentach próbek kontrolnych.
Innym ograniczeniem tej techniki jest to, że wykorzystywana jest tylko część tkanki, a zatem aktywność kaspazy-3 może być niedoszacowana. Rzeczywiście, okno czasowe apoptozy jest krótkie w każdej komórce i może zostać pominięte, nawet jeśli występuje w sąsiednich obszarach w momencie pobieraniapróbek 1,4,15. Możliwa jest również sytuacja odwrotna: apoptoza może być szczególnie intensywna w częściach tkanki, powodując przeszacowanie aktywności kaspazy-3. Zalecamy wykorzystanie pozostałych tkanek (ciała migdałowatego) do technik uzupełniających, takich jak testy TUNEL lub stosunek Bax/Bcl2 (patrz Wprowadzenie).
Spektrofluorometria ma co najmniej dwie zalety w porównaniu z Western blot. Po pierwsze, bezpośrednio generuje dane ilościowe. Po drugie, mierzy samą aktywność enzymatyczną, a nie ekspresję białka lub RNA, które mogą być niepowiązane, i wiadomo, że ekspresja białka może być zwiększona bez żadnych zmian w aktywności enzymatycznej. Co więcej, spektrofluorometria może być wykonywana na innych tkankach lub na różnych gatunkach zwierząt i może być dostosowana do innych podtypów kaspazy, z różnymi substratami, dzięki czemu można dokonać bezpiecznych porównań.
Podsumowując, dokument ten demonstruje zastosowanie spektrofluorometrii do pomiaru aktywności kaspazy-3 w ciele migdałowatym, dostarczając dowodów na to, że apoptoza występuje w tym regionie układu limbicznego 3 dni po zawale mięśnia sercowego.

Kaspazy lub zależne od cysteiny proteazy kierowane asparaginianem to rodzina enzymów, które biorą udział w różnych procesach homeostazy1. Kaspazy można ogólnie sklasyfikować ze względu na ich rolę w apoptozie lub zapaleniu. Kaspaza-1, -4, -5 i -12 są zaangażowane w stan zapalny, podczas gdy te zaangażowane w apoptozę można podzielić na kaspazy inicjujące (kaspaza-8 i -9) i kaspazy katowskie (kaspaza-3, -6 i -7).
Kaspazy odgrywają znaczącą rolę w wielu patologiach, głównie w zaburzeniach, gdzie apoptoza może być nadmierna, co obserwuje się po zawale mięśnia sercowego (MI) lub niedokrwieniu mózgu.
W szczurzym modelu zespołu post-MI używanym w naszym laboratorium, ustalono, że kaspaza-3 jest aktywowana nie tylko w mięśniu sercowym2, ale także w układzie limbicznym, który jest zaangażowany w kontrolę nastroju i emocji3-6. Obserwuje się również, że kaspaza-3 jest aktywowana w różnych regionach układu limbicznego, takich jak ciało migdałowate i hipokamp, a aktywacja ta osiąga szczyt około 3 dni po urazie niedokrwiennym4. Co ciekawe, aktywność kaspazy-3 koreluje z zaburzeniami zachowania po zawale mięśnia sercowego, a jej tłumienie poprzez interwencje farmakologiczne i żywieniowe zmniejsza te urazy, co sugeruje możliwy związek między kaspazą-3 a depresją po zawale mięśnia sercowego7-12.
Aktywacja kaspazy-3 może być mierzona różnymi technikami. Western blotting ustala właściwości enzymatyczne kaspaz i może wykryć aktywne enzymy, a także ich formy proenzymatyczne. Western blot jest jednak częściowo ilościowy, a niewielkie różnice mogą zostać utracone z powodu słabych stosunków sygnału do szumu13. Lepsza technika opiera się na rozszczepieniu substratu (DEVD-AMC) przez kaspazę-3, która uwalnia związek fluorogenny i może być mierzona za pomocą spektrofluorometrii. Aktywacja kaspazy-3 jest wiarygodnym markerem apoptozy. Pomiar apoptozy może być niestabilny, ponieważ okno czasowe występowania jest krótkie, a sąsiednie komórki mogą fagocytować ciała apoptotyczne lub komórki14. Apoptozę można dodatkowo potwierdzić za pomocą innych technik, takich jak test znakowania końca nicka końca deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL), który wykrywa fragmentację DNA wynikającą z apoptotycznych kaskad sygnalizacyjnych6 lub stosunek białek pro-/antyapoptotycznych, takich jak Bax / Bcl26.

<table><tbody><tr><td>Spektroflurometr</td><td>Instrument do technologii fotonowej (obecnie Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>z DeltaRAM&nbsp; Monochromator o dostępie swobodnym&nbsp;</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Aparat Harvard</td><td>683</td><td>wentylacja małych zwierząt</td></tr><tr><td>Kuweta szklana</td><td>Precyzyjne ogniwa NSG</td><td>3G10</td><td>Szkło optyczne (340-2,500 nm) Ścieżka 10 mm</td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>Cole Parmer</td><td>Spektrometr serii</td><td></td>4710&nbsp</tr><tr><td></td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura mierzona spektrofluorometrią po zawale mięśnia sercowego

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Zawał mięśnia sercowego (MI) ma dramatyczne średnio- i długoterminowe konsekwencje na poziomie fizjologicznym i behawioralnym, ale mechanizmy z nim związane są nadal niejasne. Nasze laboratorium opracowało szczurzy model zespołu post-MIG, który objawia się upośledzonymi funkcjami serca, utratą neuronów w układzie limbicznym, deficytami poznawczymi i behawioralnymi objawami depresji. Na poziomie neuronalnym aktywacja kaspazy-3 pośredniczy w apoptozie po zawale mięśnia sercowego w różnych regionach limbicznych, takich jak ciało migdałowate – osiągając szczyt po 3 dniach po zawale mięśnia sercowego. Zaburzenia poznawcze i behawioralne pojawiają się 2-3 tygodnie po zawale mięśnia sercowego i są one statystycznie skorelowane z pomiarami aktywności kaspazy-3. Opisany tutaj protokół służy do indukcji zawału mięśnia sercowego, pobierania tkanki ciała migdałowatego i pomiaru aktywności kaspazy-3 za pomocą spektrofluorometrii. Aby wywołać zawał mięśnia, zstępująca tętnica wieńcowa jest zamykana na 40 minut. Protokół oceny aktywacji kaspazy-3 rozpoczyna się 3 dni po zawale mięśnia sercowego: szczury są uśmiercane, a ciało migdałowate szybko izolowane z mózgu. Próbki są szybko zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu właściwej analizy. Technika wykonywana w celu oceny aktywacji kaspazy-3 opiera się na rozszczepieniu substratu (DEVD-AMC) przez kaspazę-3, która uwalnia związek fluorogenny, który można zmierzyć za pomocą spektrofluorometrii. Metodologia jest ilościowa i odtwarzalna, ale wymagany sprzęt jest drogi, a procedura ilościowego oznaczania próbek jest czasochłonna. Technikę tę można zastosować do innych tkanek, takich jak serce i nerki. DEVD-AMC można zastąpić innymi substratami w celu pomiaru aktywności innych kaspaz.

Ciało migdałowate wyizolowano od 8 szczurów w grupie pozorowanej (kontrolnej) oraz 8 szczurów z MI trzy dni po indukcji protokołu niedokrwienia/reperfuzji. Aktywność kaspazy-3 w tej tkance zmierzono przy użyciu fluorochromu, który może być rozszczepiany przez aktywną kaspazę-3 i wykrywany metodą spektrofluorometrii. Pomiary dodatnie i ujemne (patrz kroki 3.11, 3.12 i 3.16) przeprowadzono w trzech powtórzeniach i mierzono przez 10 s, rejestrując 1 punkt w każdej sekundzie. Obliczono różnice między kontrolami dodatnimi a ujemnymi, a średnią z różnic dla wszystkich tkanek z grupy pozorowanej uzyskanych w tym doświadczeniu przyjęto za 100%. Wyniki dla szczurów z MI przeskalowano zgodnie z tym punktem odniesienia, a Rysunek 1 przedstawia końcowe wyniki: wskazują one na istotnie wyższą aktywność u szczurów z MI w porównaniu do grupy pozorowanej (p &lt;0.05).
<img alt="Wykres słupkowy aktywności kaspazy-3; wyniki MI w porównaniu z grupą Sham; analiza apoptozy; istotna różnica." src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczurów po MI, wyrażona jako procent średniej aktywności w grupach kontrolnych Sham, przyjętej jako 100% (8 szczurów na grupę). *Oznacza istotną różnicę między grupami (p &lt;0.05). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM.

Zawał mięśnia sercowego (MI) nie tylko powoduje upośledzenie funkcji serca, ale także apoptozę w ciele migdałowatym, regionie mózgu zaangażowanym w behawioralne konsekwencje zawału mięśnia sercowego. Protokół ten opisuje, w jaki sposób indukować zawał mięśnia sercowego, pobierać tkankę ciała migdałowatego i mierzyć w niej aktywność kaspazy-3, markera apoptozy.

Aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura mierzona spektrofluorometrią po zawale mięśnia sercowego

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar aktywności kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura po zawale mięśnia sercowego z wykorzystaniem spektrofluorometrii. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuronauki behawioralnej, takie jak skutki zawału mięśnia sercowego dla funkcji poznawczych, zdrowia psychicznego, procesu starzenia się oraz snu. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota, szybkość i niezawodność.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wymaga ona zręczności niezbędnej do przeprowadzenia operacji i pobrania próbek tkanek. Procedurę zaprezentuje Kim Gilbert, asystent naukowy w naszym laboratorium. Po wprowadzeniu w stan znieczulenia zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi, należy potwierdzić prawidłowy przebieg znieczulenia poprzez sprawdzenie braku odruchu uciskania łapy.Wykonaj intubację szczura za pomocą rurki endotrachealnej i ułóż zwierzę w pozycji brzusznej na podgrzewaczce w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie 37 °C. Podłącz rurkę endotrachealną do aparatu do znieczulania podającego 2% isofluranu. Następnie przygotuj pole operacyjne, odkażając je glukonianem chlorheksydyny i alkoholem izopropylowym.Następnie należy nałożyć maść oftalmiczną do obu oczu, aby zapobiec ich wysychaniu. Przykryj zwierzę jałowym polem operacyjnym, aby stworzyć sterylną strefę wokół miejsca operacji. Wymagane jałowe instrumenty chirurgiczne umieść na innym jałowym polu obok zwierzęcia.Następnie należy naciąć skórę za pomocą ostrza skalpela nr 10 lub nożyczek. Za pomocą nożyczek lub kleszczyków hemostatycznych należy odwarstwić tkankę mięśniową. Następnie używając nożyczek lub kleszczyków hemostatycznych, należy otworzyć ścianę klatki piersiowej i umieścić rozwierak klatki piersiowej, a następnie otworzyć osierdzie za pomocą kleszczyków hemostatycznych.Aby wywołać zamknięcie tętnicy wieńcowej, najpierw załóż pętlę z nici jedwabnej o rozmiarze 4-0 i długości 360 millimeter wokół zstępującej tętnicy wieńcowej oraz przez przyległą tkankę mięśnia sercowego. Wprowadź oba końce nici jedwabnej do plastikowej rurki o rozmiarze 14-gauge i długości 1.25 centimeter. Pociągnij oba końce nici jedwabnej i dociśnij rurkę do tętnicy, aby doprowadzić do jej zamknięcia.Zabezpiecz okluzję, zaciskając plastikową rurkę kleszczykami hemostatycznymi, i utrzymuj okluzję przez 40 minut. Po 40 minutach zwolnij okluzję, usuwając kleszczyki hemostatyczne, a następnie elastyczny dren oraz szew jedwabny. Zamknij klatkę piersiową szwem 2-0, wprowadź elastyczny cewnik do jamy klatki piersiowej i odessij powietrze z klatki piersiowej za pomocą strzykawki 10 ml, aby zapobiec odmie opłucnowej.Zaszyj mięśnie nicią jedwabną 4-0, a skórę nicią jedwabną 3-0. Przed zawiązaniem ostatniego szwu skórnego ponownie odsysaj powietrze z klatki piersiowej, używając strzykawki 10 ml i cewnika. Zakończ zszywanie skóry, a następnie odstaw izofluran.Umieść szczura w czystej klatce i monitoruj go podczas wybudzania z narkozy. Podawaj leki przeciwbólowe w dawkach powtarzanych co osiem godzin. Po humanitarnym ścięciu głowy zwierzęcia zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, umieść głowę szczura na szalce postawionej na kruszonym lodzie.Za pomocą nożyczek otwórz czaszkę. Następnie użyj kleszczy kostnych, aby oddzielić pochewki kostne, pociągając je do góry, uważając, by nie uszkodzić leżącej poniżej tkanki. Następnie umieść płaskie ostrze szpatułki między dnem czaszki a tylną powierzchnią brzuszną mózgu i oddziel mózg od czaszki, delikatnie przesuwając ostrze do przodu i wyjmując mózg z czaszki.Umieść mózg powierzchnią grzbietową do dołu. Zlokalizuj podwzgórze przed móżdżkiem i wykonaj cięcia koronalne mózgu przed tylnym końcem podwzgórza oraz za jego przednim końcem. Zidentyfikuj obustronne ciała migdałowate jako dwie małe sfery znajdujące się pod płatami skroniowymi, tuż obok podwzgórza.Następnie należy położyć mózg płasko na przedniej części, tak aby powierzchnia grzbietowa była odwrócona od eksperymentatora. Kolejnym krokiem jest rozdzielenie półkul i usunięcie kory z obszaru ciągłego ciała migdałowatego. Po odsłonięciu ciała migdałowatego należy wyciąć je za pomocą skalpela.Przetnij wzdłuż ciemnego szwu przebiegającego przez ciało migdałowate, aby oddzielić części boczno-podstawną i środkową centralną, a następnie umieść obie części w oddzielnych, oznakowanych probówkach w lodzie. Krok ten należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec degradacji enzymów. Po powtórzeniu procedury sekcji w drugiej półkuli, zanurz wszystkie cztery probówki w ciekłym azocie na jedną minutę, a następnie przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C.Zacznij od dodania 150 µL buforu do lizy do każdych 5–10 mg próbki w warunkach chłodzenia na lodzie. Sonicuj każdą próbkę na lodzie z maksymalną intensywnością przez 5 sekund. Następnie inkubuj na lodzie przez 30 minut.Podczas inkubacji mieszaj próbkę w wirówce typu vortex przez pięć sekund co pięć minut. Następnie przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania, umieszczając próbki naprzemiennie w ciekłym azocie oraz na płycie grzewczej z termostatem ustawionym na 37 °C. Po ostatnim cyklu zamrażania i rozmrażania odwiruj próbki tkanki z prędkością 1300 Gs w temperaturze 4 °C przez 10 minut.Następnie ostrożnie odessaj nadsącz i przenieś go do nowej probówki umieszczonej w lodzie. Po oznaczeniu ilości białka zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym, dodaj 25 µg białka do probówki reakcyjnej zawierającej 0,8 µL 10 mM Ac-DEVD-AMC oraz bufor reakcyjny do uzyskania końcowej objętości 200 µL. W przypadku próbek kontrolnych ujemnych, połącz 25 µg białka z 1 µL 800 µM Ac-DEVD-CHO oraz 0,8 µL 10 mM Ac-DEVD-AMC.Inkubować wszystkie próbki i kontrole w ciemności przez trzy godziny w temperaturze 37°C. Po upływie czasu inkubacji zatrzymać reakcję, dodając do każdej próbki i kontroli 600 µL 0,4 M glicyny i 0,4 M wodorotlenku sodu o pH 10. Do każdej reakcji w kuwecie szklanej dodać dwa mililitry wody destylowanej.Ilościowo określ fluorescencję za pomocą spektrofluorometrii. Odczytaj wartości dla kontroli i próbek przez 10 s, wykonując jeden pomiar w każdej sekundzie. Na koniec oblicz aktywność właściwą w każdej próbce zgodnie z formułą wyświetloną teraz na ekranie.Ten histogram przedstawia aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczurów, u których wystąpił zawał mięśnia sercowego. Dane wyrażono jako procent średniej aktywności w grupie kontrolnej (operacja pozorowana), przyjętej jako 100%. Każda grupa składała się z ośmiu szczurów. Gwiazdka oznacza istotną różnicę między grupami przy wartości p mniejszej niż 0,05.Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu siedmiu godzin, z wyłączeniem odstępu czasu między operacją zawału mięśnia sercowego a pobraniem tkanek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wywołać zawał mięśnia sercowego u szczura oraz jak zmierzyć aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura przy użyciu spektrofluorometrii.

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Szczurzy model ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI) jest przydatny do badania skutków zawału dla patofizjologicznych i fizjologicznych funkcji serca.

Ostry zawał mięśnia sercowego u szczurów

Ten film pokazuje, jak mierzyć aktywność proteasomu w różnych subkomórkowych przedziałach bocznego ciała migdałowatego z mózgów szczurów kondycjonowanych strachem i kontrolnych za pomocą testu peptydów fluorogennych. Proteasom rozszczepia substrat peptydu fluorogenicznego, uwalniając cząsteczki fluorescencyjne, które są oznaczane ilościowo za pomocą czytnika płytek w celu oceny aktywności proteasomu we frakcjach białek jądrowych i synaptycznych. Zwiększona aktywność jądrowa sugeruje zmiany w...

Pomiar aktywności proteasomu w różnych subkomórkowych przedziałach mózgu szczura

Model niedokrwienno-reperfuzyjny serca szczura został ulepszony dzięki zastosowaniu samodzielnie wykonanego retraktora, rurki z polichlorku winylu i unikalnej metody wiązania. Wyniki elektrokardiogramu, chlorku trifenylotetrazolu i barwienia histologicznego oraz analizy procentowej przeżycia wykazały, że ulepszona grupa modelowa ma wyższe wskaźniki sukcesu i przeżycia niż już istniejąca grupa modelowa.

Ulepszony model niedokrwienia mięśnia sercowego i uszkodzenia reperfuzyjnego u gryzoni

Modele in vivo szczurów są niezbędnymi narzędziami do badania mechanizmów patologicznych i celów terapeutycznych dla udaru niedokrwiennego. W niniejszej pracy opisano wykonywanie barwienia immunofluorescencyjnego w wycinkach mózgu z zawałem po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu (MCAO) u szczurów.

Ocena sygnalizacji śmierci komórki za pomocą immunofluorescencji w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Chirurgiczne wywołanie niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u szczura jest powszechnie stosowanym modelem w badaniach nad udarem. W niniejszej pracy demonstrujemy indukcję ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez zamknięcie tętnicy środkowej mózgu. Przedstawiono również wizualizację powstałego zawału za pomocą barwienia histologicznego oraz obrazowania rezonansem magnetycznym.

Model ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez endowaskularną okluzję tętnicy środkowej mózgu u szczura za pomocą szwu

Niniejszy protokół opisuje prostą i niedrogą metodę ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych (tj. enhancerów/promotorów) w żywych siatkówkach myszy za pomocą elektroporacji eksplantów. Opisano przygotowanie DNA, wycięcie siatkówki, elektroporację, hodowlę eksplantów siatkówki oraz analizę i kwantyfikację po utrwaleniu.

Ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Mechanizm leżący u podstaw terapeutycznych efektów operacji Głębokiej Stymulacji Mózgu (DBS) wymaga zbadania. Metody przedstawione w tym manuskrypcie opisują eksperymentalne podejście do badania zdarzeń komórkowych wywoływanych przez DBS poprzez analizę profilu ekspresji genów kandydujących, które mogą ułatwić neurogenezę po operacji DBS.

Analiza zmian ekspresji genów w hipokampie szczura po głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza

Poznaj metodę pomiaru aktywności kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura po zawale mięśnia sercowego przy użyciu spektrofluorometrii. Ta technika pozwala badać apoptozę w neuronauki i kardiologii.

Aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura mierzona spektrofluorometrią po zawale mięśnia sercowego

Przeglądaj więcej filmów