Aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura mierzona spektrofluorometrią po zawale mięśnia sercowego

Zawał mięśnia sercowego (MI) nie tylko powoduje upośledzenie funkcji serca, ale także apoptozę w ciele migdałowatym, regionie mózgu zaangażowanym w behawioralne konsekwencje zawału mięśnia sercowego. Protokół ten opisuje, w jaki sposób indukować zawał mięśnia sercowego, pobierać tkankę ciała migdałowatego i mierzyć w niej aktywność kaspazy-3, markera apoptozy.

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar aktywności kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura po zawale mięśnia sercowego za pomocą spektrofluorometrii. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuronów behawioralnych, takie jak konsekwencje zawału mięśnia sercowego dla sprawności poznawczej, zdrowia psychicznego, procesu starzenia się i snu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, szybka i niezawodna.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, miałyby trudności, ponieważ wymaga ona zręczności w zakresie operacji i pobierania próbek tkanek. Procedurę zademonstruje Kim Gilbert, asystentka naukowa w naszym laboratorium. Po wywołaniu znieczulenia zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi, należy potwierdzić prawidłowe znieczulenie poprzez brak odruchu szczypania łapy.

Zaintubuj szczura rurką dotchawiczą i umieść zwierzę w brzusznej pozycji odleżynowej na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza. Podłącz rurkę dotchawiczą do urządzenia anestezjologicznego dozującego 2% izofluoranu. Następnie należy przygotować miejsce operacji za pomocą glukonianu chlorheksydyny i alkoholu izopropylowego.

I nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Umieść sterylną serwetę na zwierzęciu, aby stworzyć sterylne pole wokół pola operacyjnego. I umieść wymagane sterylne narzędzia chirurgiczne na innym sterylnym polu obok zwierzęcia.

Następnie naciąć skórę ostrzem skalpela lub nożyczkami numer 10. Użyj nożyczek lub zacisku hemostatycznego, aby oderwać tkankę mięśniową. Następnie za pomocą nożyczek lub zacisku hemostatycznego otwórz ścianę klatki piersiowej i ustaw zwijacz klatki piersiowej, a następnie otwórz osierdzie za pomocą zacisku hemostatycznego.

Aby wywołać niedrożność naczyń wieńcowych, najpierw zapętl 360-milimetrowy szew jedwabny z czterema zerami wokół zstępującej tętnicy wieńcowej i przez przylegającą tkankę mięśnia sercowego. Włóż oba końce jedwabnego szwu do plastikowej rurki o rozmiarze 14 i długości 1,25 centymetra. Pociągnij oba końce jedwabnego szwu i dociśnij rurkę do tętnicy, aby ją zatkać.

Zabezpiecz okluzję, zaciskając plastikową rurkę za pomocą hemostatycznego zacisku i utrzymuj okluzję przez 40 minut. Po 40 minutach zwolnij okluzję, usuwając zacisk hemostatyczny, a następnie elastyczną rurkę i szew jedwabny. Zamknij klatkę piersiową dwoma szwami zerowymi i umieść elastyczny cewnik w jamie klatki piersiowej i wyciągnij powietrze z klatki piersiowej za pomocą 10-mililitrowej strzykawki, aby zapobiec odmie opłucnowej.

Zszyj mięsień czterema zerowymi szwami jedwabnymi, a skórę trzema zerowymi szwami jedwabnymi. Przed zamknięciem ostatniego szwu skórnego ponownie wyciągnij powietrze z klatki piersiowej za pomocą 10-mililitrowej strzykawki i cewnika. Zakończ zamykanie skóry, a następnie zatrzymaj izofluoran.

Umieść szczura w czystej klatce i monitoruj podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Podawać środek przeciwbólowy z powtarzanym dawkowaniem co osiem godzin. Po humanitarnym odcięciu głowy zwierzęciu zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, należy położyć głowę szczura na naczyniu umieszczonym na kruszonym lodzie.

Użyj nożyczek, aby otworzyć czaszkę. Następnie użyj rongeurs, aby odłączyć snopy kostne bez okaleczania leżącej pod nimi tkanki poprzez ciągnięcie w górę. Następnie umieść płaskie ostrze szpatułki między dnem czaszki a tylną brzuszną powierzchnią mózgu i odłącz mózg od czaszki, delikatnie popychając ostrze do przodu, podnosząc mózg z czaszki.

Umieść mózg na jego grzbietowej powierzchni. Zidentyfikuj podwzgórze przed móżdżkiem i przetnij mózg koronalnie przed tylnym końcem podwzgórza, a także za przednim końcem. Zidentyfikuj obustronne ciało migdałowate jako dwie małe kule pod płatami skroniowymi tuż obok podwzgórza.

Następnie odwróć mózg płasko na jego przednim końcu, tak aby powierzchnia grzbietowa była odwrócona od eksperymentatora. Następnie oddziel półkule i usuń korę z ciągłego ciała migdałowatego. Kiedy ciało migdałowate zostanie odsłonięte, odetnij ciało migdałowate skalpelem.

Przeciąć wzdłuż ciemnego szwu, który biegnie w poprzek ciała migdałowatego, aby oddzielić podstawno-boczną i środkową część przyśrodkową, a następnie umieść dwie części w oddzielnych oznaczonych rurkach na lodzie. Ten krok należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec pogorszeniu się enzymów. Po powtórzeniu procedury sekcji z drugą półkulą, zanurz wszystkie cztery fiolki w ciekłym azocie na jedną minutę, a następnie przechowuj w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza.

Zacznij od dodania 150 mikrolitrów buforu do lizy do każdych pięciu do 10 miligramów próbki na lodzie. Poddaj sonikę każdej próbce na lodzie z maksymalną intensywnością przez pięć sekund. Następnie inkubować na lodzie przez 30 minut.

Podczas inkubacji należy wirować próbkę przez pięć sekund co pięć minut. Następnie wykonaj trzy cykle zamrażania i rozmrażania, umieszczając próbki na przemian w ciekłym azocie i na termostatycznie sterowanej płycie grzewczej ustawionej na 37 dekretów Celsjusza. Po ostatnim cyklu zamrażania i rozmrażania odwirować próbki tkanek w temperaturze 1300 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie ostrożnie odessać supernatant i przenieść do świeżej rurki na lodzie. Po ilościowym określeniu białka zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnym protokole, dodać 25 mikrogramów białka do probówki reakcyjnej zawierającej 0,8 mikrolitra 10 milimolowych Ac-DEVD-AMC i bufor reakcyjny na końcową objętość 200 mikrolitrów. W przypadku próbek z ujemną reakcją połącz 25 mikrogramów białka z jednym mikrolitrem 800 mikromolowych Ac-DEVD-CHO i 0,8 mikrolitra 10 milimolowych Ac-DEVD-AMC.

Inkubować wszystkie próbki i kontrole w ciemności przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po upływie czasu inkubacji zatrzymać reakcję z 600 mikrolitrami 0,4 molowej glicyny i 0,4 molowego wodorotlenku sodu o pH 10 w każdej próbce i kontroli. Dodaj dwa mililitry wody destylowanej do każdej reakcji w szklanej kuwecie.

Określ ilościowo fluorescencję za pomocą spektrofluorometrii. Odczytuj kontrole i próbki przez 10 sekund z jednym odczytem co sekundę. Na koniec określ ilościowo określoną aktywność w każdej próbce zgodnie ze wzorem pokazanym teraz na ekranie.

Ten histogram pokazuje aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczurów, które przeszły zawał mięśnia sercowego. Dane są wyrażone jako procent średniej aktywności w kontrolach pozorowanych ustawiony na 100%Każda grupa składała się z ośmiu szczurów. Gwiazdka oznacza istotną różnicę między grupami o wartości p mniejszej niż 0,05.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu godzin, z wyłączeniem przerwy między operacją zawału mięśnia sercowego a pobraniem próbek tkanek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać zawał mięśnia sercowego u szczura i zmierzyć aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura za pomocą spektrofluorometrii.