Oczyszczanie naczyń mózgowych myszy

Ogólnym celem procedury jest oczyszczenie przedziału naczyniowego mózgu myszy przy jednoczesnym zachowaniu jego integralności strukturalnej, przy użyciu serii wirowania i filtracji o niskiej prędkości bez konieczności stosowania specyficznych przeciwciał lub szczepów transgenicznych. Podjęto wiele wysiłków w celu opracowania technik umożliwiających komórkowe, molekularne i farmakologiczne badania bariery krew-mózg. Brak separacji, gradientów, okrężnic lub etapów wirowania z dużą prędkością sprawia, że oczyszczanie naczyń mózgowych za pomocą tej procedury jest bardzo łatwe, szybkie i niedrogie.

Naczynia mózgowe pozostaną strukturalnie nienaruszone, a komórki endot są uszczelnione połączeniem znaczników i otoczone pasożytami podstawnymi lanarnymi, komórkami mięśniowymi naczyń krwionośnych S i okołonaczyniowymi błonami astro. Protokół ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące funkcji przedziału naczyniowego CE i umożliwić badanie jego składu molekularnego, demonstrując procedurę, będzie to praca podoktorska z zespołu Martina Coena S. Przed rozpoczęciem procedury należy odciąć spód górnej części śrubowej uchwytu filtra.

Następnie za pomocą skalpela naciąć skórę od szyi myszy do nosa i odciągnąć skórę do tyłu. Umyj czaszkę PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczające włosy, a następnie włóż nożyczki do czaszki przed opuszkami węchowymi. Otwórz nożyczki, aby rozerwać czaszkę na części i usuń mózg szpatułką.

Następnie wypreparuj splot naczyniówkowy z komór bocznych i przenieś mózg do 150-mililitrowej zlewki zawierającej 20 mililitrów roztworu B one na lodzie. Następnie użyj dwóch skalpeli, aby energicznie posiekać mózg na dwumilimetrowe fragmenty tkanki i użyj automatycznego homogenizatora puchowego, aby homogenizować tkankę przez 20 uderzeń przy 400 obr./min na lodzie. Aby oczyścić naczynia, przenieś homogenat do 50-mililitrowej plastikowej rurki i odwiruj zawiesinę tkanki.

W wirówce z wirnikiem wahadłowym na wierzchu osadu naczynia utworzy się duży biały interfejs składający się głównie z mieliny. Odrzucić supernatant z 20 mililitrami lodowatego roztworu B dwa i energicznie wstrząsać probówką przez jedną minutę. Po drugim odwirowaniu mielina utworzy gęstą białą warstwę na powierzchni supernatantu.

Powoli obracaj rurkę, aby roztwór B dwa płynął wzdłuż ścianki podczas wylewania i wyrzuć mielinę z supernatantem. Następnie użyj plastikowej pipety owiniętej w chłonny papier, aby usunąć wszelkie resztki płynu ze ścianek probówki. Uważając, aby nie dotknąć osadu w naczyniu i obrócić rurkę do góry nogami na lodzie.

Następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatego roztworu B trzy, a następnie dodać kolejne pięć mililitrów roztworu B trzy, uważając, aby naczynia nie tworzyły agregatów. Teraz umieść 20-mikronowy nylonowy filtr siatkowy na kolbie Beckera i zrównoważ filtr z 10 mililitrami lodowatego roztworu B 3. Wlej preparat naczyniowy na filtr i ostrożnie przepłucz naczynia kolejnymi 40 mililitrami lodowatego roztworu B trzy.

Następnie za pomocą czystych kleszczyków natychmiast przenieś filtr do zlewki zawierającej 30 mililitrów świeżego roztworu B 3 i przymocuj naczynia do filtra, delikatnie potrząsając. Wlej zawartość zlewki do 50-mililitrowej plastikowej tuby. Następnie po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatego roztworu B 3 przed barwieniem immunologicznym.

Przenieś naczynia do 0,2 mililitrowych probówek do PCR i umieść probówki na lodzie, aż tkanka osadza się na dnie probówek. Następnie użyj końcówek do ładowania żelu, aby zassać większość płynu. Następnie włóż silikonowaną szklaną kapilę o grubości 40 mikrometrów do końcówki pipety P 200 i użyj kapilary, aby przenieść naczynia na szklane szkiełko, gdy naczynia osiądą, ostrożnie usuń płyn kawałkiem chłonnego papieru.

Następnie załaduj pojedynczą kroplę medium montażowego na naczynia i nałóż szkiełko nakrywkowe pod kątem 45 stopni, pozwalając medium montażowemu rozprowadzić się wzdłuż krawędzi szkła, aż szkiełko nakrywkowe znajdzie się na swoim miejscu. Na tym obrazie można zaobserwować ciągłe znakowanie RIN wokół komórek śródbłonka nerwowego, co potwierdza zatrzymanie blaszki podstawnej na oczyszczonych naczyniach. Składniki ścisłych połączeń śródbłonka, takie jak ZO one, są wykrywane również na oczyszczonych naczyniach.

Co więcej, znakowanie NG 2 i aktyny mięśni gładkich wskazuje odpowiednio na zatrzymanie nienaruszonych pasożytów i komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Połączenie okołonaczyniowych białek błony astroglejowej 43 i akwaporyny czwartej jest również wykrywane na powierzchni oczyszczonych naczyń, co świadczy o dodatkowym zatrzymywaniu błon astrocytów okołonaczyniowych podczas procesu oczyszczania, na izolowanych naczyniach obserwuje się jednak tylko rozproszone i krótkie włókna GFAP dodatnie, ujawniające, że ciała komórek astrocytów nie są oczyszczone. Tylko kilka włókien neuronalnych pozostaje przyczepionych do naczyń.

Podobnie, nie wykrywa się również komórek IBA jeden i oli dwóch dodatnich, co potwierdza, że mikroglej i oligodendrocyty nie są oczyszczane ko. Zdecydowanie zalecamy usunięcie obecnego splotu przed homogenizacją mózgu, ponieważ uznaliśmy to za możliwe źródło zanieczyszczenia, pracę w czystym miejscu i unikanie zanieczyszczenia włosów i kurzu. Ponieważ przeciwciała mają wysokie niespecyficzne powinowactwo do tych materiałów.

Ważne jest również, aby zawsze wykonywać barwienie jądrowe. Możliwe jest usunięcie komórek krwi z oczyszczonych naczyń poprzez wykonanie perfuzji dosercowej z PBS przed ekstrakcją naczynia. Udało nam się wyekstrahować powietrze i białka z naczyń oczyszczonych tą procedurą zarówno ze świeżo przygotowanych, jak i zamrożonych palet naczyń.

Wykorzystaliśmy również sondy fluorescencyjne i mikroskopię konfokalną do zbadania funkcji transportu śródbłonka ex vivo naczyń krwionośnych. Życzymy powodzenia w eksperymentach.