Name: Oczyszczanie naczyń mózgowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania naczyń mózgowych myszy z zachowaniem integralności strukturalnej. Protokół wykorzystuje wolne wirowanie i filtrację bez przeciwciał, umożliwiając badania bariery krew-mózg.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Labex MemoLife i ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en plaques)

1. Rozwiązania i materiały 
<ol>
	<li>Przygotować roztwory naczyń izolacyjnych: B1, dodać 1,5 ml HEPES 1M do 150 ml HBSS; B2, dodać 3,6 g dekstranu do 20 ml B1; B3, dodać 1 g BSA do 100 ml B1.</li>
	<li>Zmodyfikuj uchwyt filtra, odcinając dolną część górnej części śrubowej.</li>
	<li>Przygotować roztwory immunobarwiące: roztwór utrwalający, 4% paraformaldehyd o pH PBS 7,4; Roztwór przepuszczalny/blokujący, rozcieńczyć surowicę kozią do 5% i Triton X100 do 0,25% w PBS pH 7,4, 
	Uwaga: Utrwalenie zależy od rodzaju zastosowanych przeciwciał pierwotnych.</li>
</ol>
2. Sekcja
Uwaga: Sterylne warunki nie są wymagane, chyba że naczynia są używane do celów hodowli komórek.
<ol>
	<li>Przygotować zlewkę o pojemności 150 ml z 20 ml witaminy B1. Przechowywać na lodzie i przykryć parafilmem, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.</li>
	<li>Głęboko znieczul mysz pod kapturem małym ręcznikiem papierowym nasączonym 1 ml czystego izofluranu, który dodaje się do klatki. Znieczulenie weryfikuje się brakiem reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Zabij mysz przez zwichnięcie szyjki macicy. 
	UWAGA: Kroki te są wykonywane zgodnie z przepisami krajowymi i instytucjonalnymi.</li>
	<li>Opcjonalnie: Wykonać perfuzję dosercową z użyciem 20 ml PBS 1x w celu wyeliminowania zawartości krwi24.</li>
	<li>Przekrój skórę skalpelem od szyi do nosa i odciągnij ją. Usuń wszystkie zanieczyszczające włoski za pomocą PBS 1x.</li>
	<li>Aby otworzyć czaszkę, najpierw włóż nożyczki z przodu do opuszki węchowej i otwórz nożyczki, aby rozerwać czaszkę na dwie części.</li>
	<li>Ostrożnie usuń mózg za pomocą szpatułki do mózgu. Wyciąć splot naczyniówkowy z komór bocznych, ponieważ mogłyby one zanieczyścić preparat naczyń krwionośnych38, 
	UWAGA: Opcjonalnie: Końcowe przygotowanie będzie zawierało naczynia miąższowe i oponowe. Jeśli nie jest to pożądane, opony mózgowe można odkleić zgodnie z procedurą opisaną w 38.</li>
	<li>Przenieś mózg do zlewki zawierającej roztwór witaminy B1 na lodzie. Jednocześnie można leczyć do 8 mózgów.</li>
</ol>
3. Homogenizacja tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Za pomocą dwóch skalpeli ręcznie i energicznie ubij mózg w roztworze B1, uzyskując następnie małe kawałki o wielkości około 2 mm.</li>
	<li>Homogenizuj preparat za pomocą automatycznego homogenizatora Dounce, wykonując 20 uderzeń przy 400 obr./min. Upewnij się, że szklana rurka jest utrzymywana w lodzie i że górna część leżaczka jest w roztworze podczas poruszania się w górę iw dół, aby zapobiec tworzeniu się kieszeni powietrznych. Jeśli przygotowanych jest kilka próbek, umyj leżaczek wodą jonizowaną między każdą homogenizacją.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie naczynia
<ol>
	<li>Przenieść homogenat do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i przystąpić do wirowania w temperaturze 2 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na górze osadu naczynia utworzy się duży biały interfejs (głównie mielina) (czerwony, jeśli nie przeprowadzono perfuzji).</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Osad naczynia i biały interfejs pozostaną ze sobą połączone. Dodać 20 ml lodowatego roztworu witaminy B2 i ręcznie i energicznie wstrząsać probówką przez 1 minutę.</li>
	<li>Przystąpić do drugiego wirowania w temperaturze 4 400 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Mielina utworzy teraz gęstą białą warstwę na powierzchni supernatantu.</li>
	<li>Ostrożnie oderwij warstwę mieliny od ścianek rurki, przytrzymując rurkę i powoli ją obracając, aby supernatant mógł przejść wzdłuż ścianek. Odrzucić mielinę z supernatantem. Osad zawierający naczynia pozostaje przymocowany na dnie tuby.</li>
	<li>Wytrzyj wewnętrzną ściankę probówki chłonnym papierem owiniętym wokół plastikowej pipety o pojemności 5 ml i usuń wszystkie pozostałe płyny, unikając dotykania osadu w naczyniu. Trzymaj probówkę do góry nogami na chłonnym papierze, aby spuścić pozostały płyn.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml lodowatego roztworu witaminy B3, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówek o niskim poziomie wiązania, utrzymując probówkę na lodzie, a następnie dodać kolejne 5 ml roztworu witaminy B3. Upewnij się, że naczynia są jak najbardziej rozproszone i nie tworzą agregatów.</li>
</ol>
5. Filtracja
<ol>
	<li>Przygotować zlewkę na lodzie z 30 ml lodowatego roztworu witaminy B3. Przykryj parafilmem, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.</li>
	<li>Umieścić filtr o siatce 20 μm na zmodyfikowanym uchwycie filtra na górze kolby Beckera i zrównoważyć, nakładając 10 ml lodowatego roztworu B3</li>.
	<li>Wylej preparat naczyniowy na filtr i przepłucz naczynia 40 ml lodowatego roztworu B3.</li>
	<li>Odzyskać filtr za pomocą czystych kleszczyków i natychmiast zanurzyć go w zlewce zawierającej roztwór B3. Odłącz naczynia od filtra, delikatnie nim potrząsając.</li>
	<li>Wlać zawartość zlewki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować w temperaturze 2 000 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Uwaga: Alternatywnie, zawiesinę naczyń mózgowych z kroku 4.6 można przefiltrować do filtra o siatce 100 μm. W tym przypadku większe naczynia są preferencyjnie zatrzymywane na filtrze, podczas gdy przepływowy zawiera mikronaczynia (głównie kapilary), które są następnie filtrowane na filtrze o siatce 20 μm, jak powyżej.</li>
	<li>Zawiesić osad mikronaczyń w 1 ml lodowatego roztworu B3 i przenieść go pipetując do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 2 000 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
6. Utrwalenie, przepuszczalność i blokowanie
<ol>
	<li>Przenieść naczynia przez pipetowanie do 0,2 ml probówek PCR zawierających PBS przy użyciu końcówki o niskim stopniu wiązania 1,0 ml. Uważaj, aby nie dotykać naczyń, ponieważ mogą one przylegać do zewnętrznej części końcówki. Wykonaj wszystkie poniższe czynności pod mikroskopem dwuokularowym.</li>
	<li>W przypadku każdej z poniższych zmian podłoża należy pozostawić probówki na lodzie, aż naczynia osiągną dno, a następnie odpipetować większość płynów za pomocą długich końcówek do pipet z żelem.</li>
	<li>Usunąć większość PBS i dodać 200 μl roztworu utrwalającego. Zawiesić naczynia przez delikatne wstrząsy i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odpipetować roztwór utrwalający i zastąpić go 200 μl 1x PBS (pierwsze płukanie), inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i powtórzyć ten krok 3 razy. Za każdym razem sprawdź, czy naczynia prawidłowo opadły na dno probówek i odpipetuj 1x PBS, upewniając się, że naczynia nie są dotykane.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu zastąpić 1x PBS roztworem przepuszczalnym/blokującym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, ponownie zawieszając naczynia, delikatnie potrząsając od czasu do czasu.</li>
</ol>
7. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Zastąpić roztwór do permeabilizacji/blokowania mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych (patrz odniesienia do zastosowanych tutaj przeciwciał i rozcieńczenia w tabeli szablonu materiałów) rozcieńczonych w roztworze do permeabilizacji/blokowania i inkubować w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	<li>Po 3 przemyciach w PBS w temperaturze pokojowej należy inkubować naczynia z mieszaniną przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Uwaga: zdecydowanie zalecamy wykonanie barwienia jądrowego za pomocą Hoechst (1:2,000) lub DAPI (1:2,000) w celu odróżnienia naczyń od ewentualnych zanieczyszczających włosów lub pyłów pod mikroskopem.</li>
	<li>Po 3 płukaniach w PBS ponownie zawiesić naczynia w 50 μl PBS.</li>
</ol>
8. Montaż i obserwacja
<ol>
	<li>Przygotuj końcówkę z kapilarą ze szkła silikonowanego: odetnij końcówkę pipety P200 za pomocą skalpela i wyreguluj kapilatę wewnątrz. Przybliżona objętość kapilary wynosi 40 μl.</li>
	<li>Przenieś naczynia do szkiełka za pomocą kapilary ze szkła silikonowanego i ostrożnie usuń płyn kawałkiem chłonnego papieru.</li>
	<li>Nałóż pojedynczą kroplę podłoża montażowego na naczynia i przytrzymaj szkiełko nakrywkowe pod kątem 45º, pozwalając kropli rozprowadzić się wzdłuż krawędzi płytki. Odpuścić szkiełko nakrywkowe i pozwolić pożywce powoli się rozprowadzać. Pozostaw do wyschnięcia O/N w temperaturze RT z ochroną przed światłem. Naczynia można obserwować pod fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier+in+Health+and+Chronic+Neurodegenerative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders.</a> Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Armulik, A., Genové, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Hall, C. N., Reynell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li>
<li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels%3A+an+electron+microscopic+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li>
<li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+Metabolism%3A+Focus+on+Astrocyte-Neuron+Metabolic+Cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).</li>
<li>Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li>
<li>Iadecola, C., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+regulation+of+the+cerebral+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial regulation of the cerebral microvasculature.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).</li>
<li>Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+brain+microvessels%3A+a+purified%2C+metabolically+active+preparation+from+bovine+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex.</a> Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+metabolically+active+capillaries+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier.</a> Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745(1991).</li>
<li>Boado, R. J., Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-type+glucose+transporter+mRNA+is+specifically+expressed+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).</li>
<li>Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+the+blood-brain+barrier%3A+Distribution+of+enzymes+between+the+luminal+and+antiluminal+membranes+of+brain+capillary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells.</a> Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Blood-Brain+Barrier+Transcriptome%3A+A+New+Resource+for+Understanding+the+Development+and+Function+of+Brain+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells.</a> PLoS ONE. 5 (10), e13741(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-Sequencing+Transcriptome+and+Splicing+Database+of+Glia%2C+Neurons%2C+and+Vascular+Cells+of+the+Cerebral+Cortex.%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sarcoglycan+complex+is+expressed+in+the+cerebrovascular+system+and+is+specifically+regulated+by+astroglial+Cx30+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9(2015).</li>
<li>Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+quiescence+of+the+brain+is+set+by+astroglial+Connexin+43%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).</li>
<li>Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+vessels+from+the+mouse+brain+for+gene+expression+analysis+using+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).</li>
<li>Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+CNS+microvascular+endothelium+by+immune-guided+laser-capture+microdissection+coupled+to+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).</li>
<li>Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Ex+Vivo+Laser-induced+Spinal+Cord+Injury+Model+to+Assess+Mechanisms+of+Axonal+Degeneration+in+Real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).</li>
<li>Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+pericytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central nervous system pericytes in health and disease.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).</li>
<li>Ezan, P., André, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+astroglial+connexins+weakens+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).</li>
<li>Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+at+the+gliovascular+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling at the gliovascular interface.</a> The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).</li>
<li>Dubois, L. G., Campanati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliomas+and+the+vascular+fragility+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418(2014).</li>
<li>Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+metabolically+active+capillaries+from+rat+brain1%2C2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2.</a> Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).</li>
<li>Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+microvessels%3A+the+blood-brain+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544(1978).</li>
<li>Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+brain+microvessels%3A+preparation%2C+morphology%2C+histamine+and+catecholamine+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Vessels%22%5BJournal%5D)">Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents.</a> Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).</li>
<li>Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+transport+of+vitamin+D+and+A+derivatives+through+the+rat+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier.</a> Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).</li>
<li>Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+and+canine+endothelial+cells+from+brain+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels.</a> Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).</li>
<li>Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+endothelial+cells+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of endothelial cells from rat brain.</a> Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).</li>
<li>Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+brain+capillary+endothelial+cells+exhibit+improved+barrier+properties+under+the+influence+of+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone.</a> Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).</li>
<li>Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+capillary+endothelium+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Primary culture of capillary endothelium from rat brain.</a> In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).</li>
<li>Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Visual+Description+of+the+Dissection+of+the+Cerebral+Surface+Vasculature+and+Associated+Meninges+and+the+Choroid+Plexus+from+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
<li>Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+Method+to+Isolate+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells+by+Magnetic+Cell+Sorting+and+Dominant+mRNA+Expression+of+Multidrug+Resistance-associated+Protein+1+and+4+in+Highly+Purified+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells.</a> Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).</li>
<li>Warren, M. S., Zerangue, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiles+of+ABC+transporters+in+brain+microvessel+endothelial+cells+and+brain+in+five+species+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human.</a> Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).</li>
<li>Geier, E. G., Chen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Solute+Carrier+Transporters+in+the+Human+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).</li>
<li>Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+Resistance-Related+Transport+Proteins+in+Isolated+Human+Brain+Microvessels+and+in+Cells+Cultured+from+These+Isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates.</a> Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).</li>
<li>Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Sci Rep. 3, 1500(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bariera krew-mózg reguluje przepływ substancji fizjologicznych do i z OUN oraz chroni go przed potencjalnie szkodliwymi substancjami obecnymi we krwi. Bierze udział w kilku patologiach OUN, w tym chorobach neurodegeneracyjnych2 i guzach mózgu28. Bardzo aktywnym polem badań jest wyjątkowo niska przepuszczalność bariery krew-mózg, utrudnia również przechodzenie środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki nerwowe oraz opracowywanie metod mających na celu odwracalne otwarcie bariery krew-mózg bez...

Prawidłowe funkcjonowanie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) wymaga wysoce regulowanego środowiska zewnątrzkomórkowego, a jego wymagania metaboliczne są ogromne w porównaniu z innymi narządami1. Ośrodkowy układ nerwowy jest również niezwykle wrażliwy na szeroką gamę substancji chemicznych, na ogół nieszkodliwych dla narządów obwodowych, ale dla niego neurotoksycznych. Aby zapewnić prawidłowe funkcjonowanie, większość układu naczyniowego OUN tworzy barierę śródbłonkową; bariera krew-mózg (BBB), która kontroluje przepływ cząsteczek i jonów, a także przechodzenie komórek odpornościowych między krwią a mózgiem, utrzymując w ten sposób prawidłową homeostazę2, ale także ograniczając przedostawanie się leków terapeutycznych, utrudniając w ten sposób leczenie zaburzeń neurologicznych3. Na poziomie komórkowym bariera krew-mózg jest utrzymywana głównie przez rozległe ścisłe połączenia między komórkami śródbłonka, spolaryzowaną ekspresję transporterów wypływu i bardzo niski wskaźnik transcytozy4. Właściwości i funkcje bariery krew-mózg są w większości indukowane przez sąsiednie komórki4. W szczególności perycyty odgrywają ważną rolę w indukowaniu i utrzymywaniu bariery krew-mózg5,6. Będąc komórkami kurczliwymi, perycyty regulują również przepływ krwi7, podobnie jak komórki mięśni gładkich otaczające duże naczynia. Wreszcie, astrocyty, główne komórki glejowe mózgu, wysyłają duże procesy zwane końcami stóp wokół większości naczyń krwionośnych mózgu8 i modulują integralność BBB i spokój immunologiczny9, transfer metabolitów do neuronów10 i indukują ścisłe sprzężenie między aktywnością neuronów a przepływem krwi11,12.
Możliwość badania molekularnych i komórkowych właściwości układu naczyniowo-mózgowego jest kluczowa dla lepszego scharakteryzowania jego wkładu w fizjologię mózgu i fizjopatologię. Aby odpowiedzieć na to pytanie, opracowano strategie izolowania układu naczyniowo-mózgowego mózgu, które pozwalają na przygotowanie nienaruszonych fragmentów naczyń mózgowych. Oczyszczanie naczyń mózgowych zostało początkowo opisane przy użyciu mózgów bydlęcych13 i zostało ulepszone i dostosowane do innych gatunków, w szczególności gryzoni14. W tym ostatnim badaniu wprowadzono stosowanie filtrów o różnej wielkości w celu rozdzielenia naczyń mózgowych na frakcje wzbogacone w naczynia o różnych średnicach. Co ciekawe, w takich preparatach komórki śródbłonka zachowywały swoje właściwościmetaboliczne15, funkcjonalnośćtransportera16 i polaryzację17. W tym miejscu szczegółowo opisujemy ten protokół i dalej wykazujemy, że izolowane naczynia zachowują większość swoich struktur in situ. Komórki śródbłonka pozostają połączone ścisłymi połączeniami i otoczone ciągłą blaszką podstawną. Perycyty i komórki mięśni gładkich pozostają przyczepione do warstwy śródbłonka, a także do okołonaczyniowych błon astrocytów. Jednak astrocyty, komórki mikrogleju, neurony i oligodendrocyty są eliminowane. Na koniec opisujemy procedurę barwienia immunologicznego na izolowanych naczyniach mózgowych.
Do tej pory większość badań molekularnych i komórkowych dotyczących układu naczyniowo-mózgowego była przeprowadzana na oczyszczonych komórkach naczyń mózgowych zdysocjowanych przez sortowanie komórek za pomocą specyficznych dla komórek szczepów myszy reporterowych lub procedur opartych na barwieniu immunologicznym18,19. Chociaż techniki te pozwalają na izolację prawie czystych populacji komórek naczyniowo-mózgowych, izolowane komórki całkowicie tracą swoją morfologię i interakcje in situ, co z kolei znacznie wpływa na ich właściwości molekularne i komórkowe. Opisany tutaj protokół, pozwalający na izolację całych fragmentów naczyń mózgowych bez potrzeby stosowania specyficznych przeciwciał lub transgenicznych barwników myszy, stanowi dobrą alternatywę, ponieważ ogólna struktura izolowanych naczyń mózgowych jest zachowana, co zmniejsza wpływ na ich właściwości molekularne. Wyizolowane naczynia mogą być następnie wykorzystane do badania aktywności genów, syntezy białek i regulacji w BBB, jak opisano niedawno20,21. Wreszcie, w porównaniu z mikrodysekcjąlaserową 22,23, obecny protokół jest niedrogi, łatwy do wykonania i szybko adaptowalny w każdym laboratorium.

<table><tbody><tr><td>Młynek do tkanek Rozmiar C</td> Wirówka <td>Thomas scientific</td><td>3431E25</td><td></td></tr><tr><td>5415&nbsp; R</td><td>Wirówka Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000320</td><td></td></tr><tr><td>Wysokowydajny, modułowy mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowy system zapewnia wysoką jakość Leica LED1000</td><td>Końcówki Leica</td><td>LED1000</td><td></td></tr><tr><td>o niskim poziomie wiązania (P1000)</td>Uchwyt filtra <td>Sorenson BioScience</td><td>14200T</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex 47 mm PP 8/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td><td></td></tr><tr><td>Nylonowa siatka filtracyjna Hydrofilowa 20 &mikro; m 47 mm 100/Pk</td><td>Milipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td>Tarcza filtracyjna <td></td></tr><tr><td>z siatki nylonowej Hydrofilowa 100 &micro; m 47 mm 100/Pk</td><td>Milipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td><td></td></tr><tr><td>Standardowa ścianka rurki borokrzemianowe</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>1014356290F</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, grubość 1</td><td>Thermo Scientific</td><td>P10143263NR1</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Probówki cienkościenne z nakrętką kopułową</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PARAFILM M (rozmiar rolki 4 cale i czasy; 125 stóp)</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td><td>Technologia życia</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Technologia życia</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran z Leuconostoc spp. Pan ~70,000</td><td>Sigma</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd (w/v), bez metanolu&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>trichlorowodorek bisBenzimide H 33342 (Hoechst)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Izolektyna GS-IB4 Z Griffonia simplicifolia, koniugat Alexa Fluor 488; Rozcieńczenie 1/100</td><td>Life technology</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Agrin (królik) ; rozcieńczenie 1/400</td><td>uprzejmie dostarczone przez Dr Markus A Ruegg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti ZO-1 (mysz, klon 1A12)</td><td>Technologia życia</td><td>33-9100</td><td>rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Aktyna przeciw mięśniom gładkim (mysz, klon 1A4)</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>&nbsp; rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Anti GFAP (mysz, klon GA5)</td><td>Sigma</td><td>G3893</td><td>&nbsp; rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Anti AQP4 (królik)</td><td>Sigma</td><td>A5971</td><td>&nbsp; rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Anti Cx43 (mysz, klon&nbsp; 2)</td><td>BD Biosciences</td><td>610061</td><td>&nbsp; rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Anti Olig2 (królik)</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>&nbsp; rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Anti NF-M (mysz)</td> <td>dostarczone przez dr Beat M. Riederer, Uniwersytet w Lozannie, Szwajcaria.</td><td>&nbsp; rozcieńczenie 1:10</td><td></td></tr><tr><td>Anti Iba1 (królik)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>&nbsp; rozcieńczenie 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Technologia</td><td>życia</td><td>przeciwciał A11029</td><td>&nbsp; rozcieńczenie 1:2,000</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Technologia życia</td><td>A11034</td><td>&nbsp; rozcieńczenie 1:2,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Przeciwciało Technologia życia</td><td>A21424</td><td>&nbsp; rozcieńczenie 1:2,000</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Przeciwciało drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 555</td><td>Technologia życia</td><td>A21429</td><td>&nbsp; Rozcieńczenie 1:2,000</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie naczyń mózgowych myszy

Purification of Mouse Brain Vessels

W mózgu, większość układu naczyniowego składa się z selektywnej bariery, bariery krew-mózg (BBB), która reguluje wymianę cząsteczek i komórek odpornościowych między mózgiem a krwią. Co więcej, ogromne zapotrzebowanie metaboliczne neuronów wymaga regulacji przepływu krwi z chwili na chwilę. Warto zauważyć, że nieprawidłowości tych regulacji są etiologicznymi cechami charakterystycznymi większości patologii mózgu; w tym glejak, udar, obrzęk, padaczka, choroby zwyrodnieniowe (np. choroba Parkinsona, choroba Alzheimera), guzy mózgu, a także stany zapalne, takie jak stwardnienie rozsiane, zapalenie opon mózgowych i dysfunkcje mózgu wywołane posocznicą. W związku z tym zrozumienie zdarzeń sygnalizacyjnych modulujących fizjologię naczyń mózgowych jest poważnym wyzwaniem. Wiele informacji na temat właściwości komórkowych i molekularnych różnych typów komórek tworzących układ naczyniowo-mózgowy można uzyskać dzięki hodowli pierwotnej lub sortowaniu komórek ze świeżo zdysocjowanej tkanki mózgowej. Jednak właściwości takie jak polaryzacja komórek, morfologia i relacje międzykomórkowe nie są w takich preparatach zachowane. Protokół, który tutaj opisujemy, ma na celu oczyszczenie fragmentów naczyń mózgowych przy jednoczesnym zachowaniu integralności strukturalnej. Pokazujemy, że izolowane naczynia składają się z komórek śródbłonka uszczelnionych ścisłymi połączeniami, które są otoczone ciągłą blaszką podstawną. Perycyty, komórki mięśni gładkich, a także błony końcowe astrocytów okołonaczyniowych pozostają połączone z warstwą śródbłonka. Na koniec opisujemy, jak przeprowadzać eksperymenty barwienia immunologicznego na oczyszczonych naczyniach mózgowych.

W niniejszej pracy opisujemy protokół umożliwiający mechaniczną izolację naczyń mózgowych14. Rycina 1 podsumowuje główne etapy tej techniki. Architektura naczyń mózgowych jest złożona i obejmuje kilka typów komórek, t.j. komórki śródbłonka uszczelnione przez połączenia ścisłe i otoczone perycytami, komórkami mięśni gładkich oraz wypustkami stóp astrocytów9. W związku z tym, po izolacji naczyń mózgowych, dążyliśmy do scharakteryzowania struktury oczyszczonych naczyń za pomoc...

Opisujemy protokół pozwalający na oczyszczenie przedziału naczyniowego mózgu myszy. Izolowane naczynia mózgowe obejmują komórki śródbłonka połączone ścisłymi połączeniami i otoczone ciągłą blaszką podstawną, perycyty, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, a także okołonaczyniowe błony astroglejowe.

Oczyszczanie naczyń mózgowych myszy

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Ogólnym celem procedury jest oczyszczenie frakcji naczyniowej mózgu myszy przy jednoczesnym zachowaniu jej integralności strukturalnej, z wykorzystaniem serii wirowań przy niskich prędkościach oraz filtracji, bez konieczności stosowania specyficznych przeciwciał lub szczepów transgenicznych. Podjęto wiele prób opracowania technik umożliwiających badania komórkowe, molekularne i farmakologiczne bariery krew-mózg. Brak etapów separacji, gradientów, kolumn czy wirowania przy wysokich prędkościach sprawia, że oczyszczanie naczyń mózgowych za pomocą tej procedury jest bardzo łatwe, szybkie i niedrogie.Naczynia krwionośne mózgu pozostaną nienaruszone strukturalnie, z komórkami śródbłonka uszczelnionymi przez połączenia ścisłe i otoczonymi przez błony podstawne, komórki mięśni gładkich naczyń oraz astrocyty okołonaczyniowe. Niniejszy protokół może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji naczyniowego przedziału bariery krew-mózg i umożliwić badanie jego składu molekularnego; procedurę tę zademonstruje postdoc z zespołu Martina Coena. Przed rozpoczęciem procedury odetnij dno górnej, wkręcanej części uchwytu filtra.Następnie za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry od karku myszy do nosa i odsuną skórę. Przemyj czaszkę roztworem PBS, aby usunąć zanieczyszczające ją włosy, a następnie wprowadź nożyczki do czaszki przed cebulkami węchowymi. Rozchyl nożyczki, aby rozbić czaszkę na części, i usuń mózg za pomocą szpatułki.Następnie wypreparuj sploty naczyniowe z komór bocznych i przenieś mózg do zlewki o pojemności 150 ml zawierającej 20 ml roztworu B one w lodzie. Następnie za pomocą dwóch skalpeli energicznie posiekaj mózg na fragmenty tkanki o wielkości 2 mm i użyj automatycznego homogenizatora do homogenizacji tkanki przez 20 cykli przy 400 RPM w lodzie. Aby oczyścić naczynia, przenieś homogenat do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj zawiesinę tkankową.W wirówce z rotorem kątowym utworzy się duża biała warstwa graniczna składająca się głównie z mieliny na górnej części osadu w naczyniu. Odlej nadsącz, zastępując go 20 mililitrami lodowatego roztworu B two, a następnie energicznie wstrząsaj probówką przez jedną minutę. Po drugim wirowaniu mielina utworzy gęstą białą warstwę na powierzchni nadsączu.Powoli obracaj probówką, aby roztwór B two spływał po jej ściance podczas wylewania, a mielinę wraz z nadsączem usunąć. Następnie użyj plastikowej pipety owiniętej papierem chłonnym, aby usunąć resztki cieczy ze ścianek probówki. Uważając, aby nie dotknąć osadu pęcherzykowego, odwróć probówkę do góry dnem i umieść ją na lodzie.Następnie resuspenduj osad w 1 ml lodowatego roztworu B3, a następnie dodaj kolejne 5 ml roztworu B3, dbając o to, aby pęcherzyki nie tworzyły agregatów. Teraz umieść filtr z nylonowej siatki o oczkach 20 µm na zlewce i zrównoważ filtr 10 ml lodowatego roztworu B3. Przelej zawiesinę pęcherzyków przez filtr i ostrożnie przepłucz naczynia kolejnymi 40 ml lodowatego roztworu B3.Następnie za pomocą czystej pęsety niezwłocznie przenieść filtr do zlewki zawierającej 30 ml świeżego roztworu B three, a następnie oddzielić naczynia od filtra, delikatnie potrząsając. Zawartość zlewki przelać do plastikowej probówki o pojemności 50 ml. Po wirowaniu pellet zawiesić ponownie w 1 ml lodowatego roztworu B three przed przeprowadzeniem immunobarwienia.Przenieś naczynia do probówek PCR o pojemności 0,2 ml i umieść probówki w lodzie, aż osad tkankowy opadnie na dno. Następnie za pomocą końcówek do nakładania żelu odessa większość cieczy. W kolejnym kroku włóż silikonizowaną kapilarę szklaną o średnicy 40 µm do końcówki pipety P 200 i za pomocą kapilary przenieś naczynia na szkiełko przedmiotowe; gdy naczynia już osiądą, ostrożnie usuń ciecz za pomocą kawałka papieru chłonnego.Następnie nanieś jedną kroplę medium montażowego na naczynia i nałóż szkiełko nakrywkowe pod kątem 45 stopni, pozwalając medium montażowemu rozprzestrzenić się wzdłuż krawędzi szkła, aż szkiełko nakrywkowe znajdzie się na miejscu. Na tym obrazie można zaobserwować ciągłe znakowanie RIN wokół komórek śródbłonka naczyniowego, co potwierdza zachowanie błony podstawnej na oczyszczonych naczyniach. Na oczyszczonych naczyniach wykryto również komponenty ścisłych połączeń śródbłonka, takie jak ZO one.Ponadto, znakowanie NG2 oraz aktyny mięśni gładkich wskazuje odpowiednio na zachowanie nienaruszonych pasożytów i komórek mięśni gładkich naczyń. Białka połączeń peryvaskularnych błon astroglialnych, koneksyna 43 i akwaporyna 4, są również wykrywane na powierzchni oczyszczonych naczyń, co świadczy o dodatkowym zachowaniu błon astrocytów peryvaskularnych podczas procesu oczyszczania; jednakże na wyizolowanych naczyniach obserwuje się jedynie rozproszone i krótkie włókna dodatnie pod kątem GFAP, co wskazuje, że ciała komórek astrocytów nie zostały współoczyszczone. Do naczyń przylega jedynie kilka włókien neuronalnych.Podobnie nie wykryto komórek dodatnich dla IBA1 i oli2, co potwierdza, że mikroglej i oligodendrocy nie zostały współoczyszczone. Zdecydowanie zalecamy usunięcie splotów przed homogenizacją mózgu, ponieważ w naszym doświadczeniu stanowiły one możliwe źródło zanieczyszczeń; należy również pracować w czystym obszarze oraz unikać zanieczyszczeń w postaci włosów i kurzu, ponieważ przeciwciała wykazują wysoką nieswoistą powinowactwo do tych materiałów.Ważne jest również, aby zawsze przeprowadzać barwienie jąder komórkowych. Możliwe jest usunięcie komórek krwi z oczyszczonych naczyń poprzez wykonanie perfuzji wewnątrzsercowej z użyciem PBS przed ekstrakcją naczyń. Z powodzeniem wyizolowaliśmy RNA i białka z naczyń oczyszczonych tą procedurą, zarówno ze świeżo przygotowanych, jak i zamrożonych preparatów naczyń.Do badania funkcji transportu śródbłonkowego naczyń ex vivo wykorzystaliśmy również sondy fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą i praktyczną technikę odlewu naczyniowego mózgu, która jest łatwa w wykonaniu i może być wykorzystana do obrazowania drzewa naczyniowego mózgu dorosłej myszy.

Odlewanie naczyń mózgowych dorosłej myszy do obrazowania 3D i analizy morfologicznej

Ten film pokazuje izolację nienaruszonych naczyń z mózgu myszy, które tworzą barierę krew-mózg (BBB) wraz z neuronami i komórkami glejowymi. Wyizolowane naczynia mogą być wykorzystane jako model in vitro do zbadania ich roli w utrzymaniu homeostazy mózgu.

Izolowanie naczyń mózgowych myszy: protokół izolowania nienaruszonych naczyń z próbki mózgu myszy

Ten film pokazuje izolację naczyń włosowatych od świeżych mózgów świń. Proces ten polega na usunięciu opon mózgowych, wyizolowaniu istoty szarej z tkanki mózgowej, homogenizacji i filtrowaniu istoty szarej w celu wyizolowania naczyń włosowatych, a na koniec zastosowaniu trawienia enzymatycznego w celu dalszego oczyszczenia naczyń włosowatych.

Oczyszczanie naczyń włosowatych z mózgu świni

Ten film demonstruje metodę izolowania perycytów mózgowych od mózgu myszy. Wyizolowane komórki są hodowane w pożywkach specyficznych dla perycytów w celu promowania proliferacji perycytów.

Izolowanie i hodowla perycytów mózgowych myszy

Ten film demonstruje metodę izolowania przewodów śródbłonkowych od miąższu mózgu myszy. Dzięki połączeniu trawienia enzymatycznego i dysocjacji mechanicznej, proces ten daje nienaruszoną rurkę z komórkami śródbłonka.

Przygotowanie śródbłonka mózgowego z tętniczek miąższowych myszy

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Opisujemy tutaj powtarzalny protokół izolowania mysiego kręgu Willisa.

Protokół izolowania mysiego kręgu Willisa

Przedstawiamy protokół ekstrakcji mysich perycytów mózgowych. Protokół ten, oparty na ekstrakcji perycytów zorientowanej na wzbogacanie bez antybiotyków, jest cennym narzędziem do badań in vitro, zapewniając wysoką czystość i wysoką wydajność, zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych.

Wysokowydajna metoda izolowania perycytów mózgowych od myszy

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Pokazujemy chemiczne indukowanie dużego rozszerzenia naczyń krwionośnych u myszy jako model do badania dysfunkcji naczyń mózgowych, który może być wykorzystany do modelowania demencji naczyniowej i choroby Alzheimera. Demonstrujemy również wizualizację układu naczyniowego poprzez wstrzykiwanie mieszanki kauczuku silikonowego i zapewnianie jasnych wizualnych wskazówek dotyczących pomiaru zmian wielkości naczyń krwionośnych.

Wizualne podejście do wywoływania dolichoektazji u myszy w celu modelowania dysfunkcji naczyń mózgowych za pośrednictwem dużych naczyń krwionośnych

Poznaj metodę oczyszczania naczyń mózgowych myszy z zachowaniem integralności strukturalnej. Protokół wykorzystuje wolne wirowanie i filtrację bez przeciwciał, umożliwiając badania bariery krew-mózg.

Oczyszczanie naczyń mózgowych myszy

Przeglądaj więcej filmów