Oczyszczanie naczyń mózgowych myszy

Ogólnym celem procedury jest oczyszczenie frakcji naczyniowej mózgu myszy przy jednoczesnym zachowaniu jej integralności strukturalnej, z wykorzystaniem serii wirowań przy niskich prędkościach oraz filtracji, bez konieczności stosowania specyficznych przeciwciał lub szczepów transgenicznych. Podjęto wiele prób opracowania technik umożliwiających badania komórkowe, molekularne i farmakologiczne bariery krew-mózg. Brak etapów separacji, gradientów, kolumn czy wirowania przy wysokich prędkościach sprawia, że oczyszczanie naczyń mózgowych za pomocą tej procedury jest bardzo łatwe, szybkie i niedrogie.

Naczynia krwionośne mózgu pozostaną nienaruszone strukturalnie, z komórkami śródbłonka uszczelnionymi przez połączenia ścisłe i otoczonymi przez błony podstawne, komórki mięśni gładkich naczyń oraz astrocyty okołonaczyniowe. Niniejszy protokół może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji naczyniowego przedziału bariery krew-mózg i umożliwić badanie jego składu molekularnego; procedurę tę zademonstruje postdoc z zespołu Martina Coena. Przed rozpoczęciem procedury odetnij dno górnej, wkręcanej części uchwytu filtra.

Następnie za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry od karku myszy do nosa i odsuną skórę. Przemyj czaszkę roztworem PBS, aby usunąć zanieczyszczające ją włosy, a następnie wprowadź nożyczki do czaszki przed cebulkami węchowymi. Rozchyl nożyczki, aby rozbić czaszkę na części, i usuń mózg za pomocą szpatułki.

Następnie wypreparuj sploty naczyniowe z komór bocznych i przenieś mózg do zlewki o pojemności 150 ml zawierającej 20 ml roztworu B one w lodzie. Następnie za pomocą dwóch skalpeli energicznie posiekaj mózg na fragmenty tkanki o wielkości 2 mm i użyj automatycznego homogenizatora do homogenizacji tkanki przez 20 cykli przy 400 RPM w lodzie. Aby oczyścić naczynia, przenieś homogenat do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj zawiesinę tkankową.

W wirówce z rotorem kątowym utworzy się duża biała warstwa graniczna składająca się głównie z mieliny na górnej części osadu w naczyniu. Odlej nadsącz, zastępując go 20 mililitrami lodowatego roztworu B two, a następnie energicznie wstrząsaj probówką przez jedną minutę. Po drugim wirowaniu mielina utworzy gęstą białą warstwę na powierzchni nadsączu.

Powoli obracaj probówką, aby roztwór B two spływał po jej ściance podczas wylewania, a mielinę wraz z nadsączem usunąć. Następnie użyj plastikowej pipety owiniętej papierem chłonnym, aby usunąć resztki cieczy ze ścianek probówki. Uważając, aby nie dotknąć osadu pęcherzykowego, odwróć probówkę do góry dnem i umieść ją na lodzie.

Następnie resuspenduj osad w 1 ml lodowatego roztworu B3, a następnie dodaj kolejne 5 ml roztworu B3, dbając o to, aby pęcherzyki nie tworzyły agregatów. Teraz umieść filtr z nylonowej siatki o oczkach 20 µm na zlewce i zrównoważ filtr 10 ml lodowatego roztworu B3. Przelej zawiesinę pęcherzyków przez filtr i ostrożnie przepłucz naczynia kolejnymi 40 ml lodowatego roztworu B3.

Następnie za pomocą czystej pęsety niezwłocznie przenieść filtr do zlewki zawierającej 30 ml świeżego roztworu B three, a następnie oddzielić naczynia od filtra, delikatnie potrząsając. Zawartość zlewki przelać do plastikowej probówki o pojemności 50 ml. Po wirowaniu pellet zawiesić ponownie w 1 ml lodowatego roztworu B three przed przeprowadzeniem immunobarwienia.

Przenieś naczynia do probówek PCR o pojemności 0,2 ml i umieść probówki w lodzie, aż osad tkankowy opadnie na dno. Następnie za pomocą końcówek do nakładania żelu odessa większość cieczy. W kolejnym kroku włóż silikonizowaną kapilarę szklaną o średnicy 40 µm do końcówki pipety P 200 i za pomocą kapilary przenieś naczynia na szkiełko przedmiotowe; gdy naczynia już osiądą, ostrożnie usuń ciecz za pomocą kawałka papieru chłonnego.

Następnie nanieś jedną kroplę medium montażowego na naczynia i nałóż szkiełko nakrywkowe pod kątem 45 stopni, pozwalając medium montażowemu rozprzestrzenić się wzdłuż krawędzi szkła, aż szkiełko nakrywkowe znajdzie się na miejscu. Na tym obrazie można zaobserwować ciągłe znakowanie RIN wokół komórek śródbłonka naczyniowego, co potwierdza zachowanie błony podstawnej na oczyszczonych naczyniach. Na oczyszczonych naczyniach wykryto również komponenty ścisłych połączeń śródbłonka, takie jak ZO one.

Ponadto, znakowanie NG2 oraz aktyny mięśni gładkich wskazuje odpowiednio na zachowanie nienaruszonych pasożytów i komórek mięśni gładkich naczyń. Białka połączeń peryvaskularnych błon astroglialnych, koneksyna 43 i akwaporyna 4, są również wykrywane na powierzchni oczyszczonych naczyń, co świadczy o dodatkowym zachowaniu błon astrocytów peryvaskularnych podczas procesu oczyszczania; jednakże na wyizolowanych naczyniach obserwuje się jedynie rozproszone i krótkie włókna dodatnie pod kątem GFAP, co wskazuje, że ciała komórek astrocytów nie zostały współoczyszczone. Do naczyń przylega jedynie kilka włókien neuronalnych.

Podobnie nie wykryto komórek dodatnich dla IBA1 i oli2, co potwierdza, że mikroglej i oligodendrocy nie zostały współoczyszczone. Zdecydowanie zalecamy usunięcie splotów przed homogenizacją mózgu, ponieważ w naszym doświadczeniu stanowiły one możliwe źródło zanieczyszczeń; należy również pracować w czystym obszarze oraz unikać zanieczyszczeń w postaci włosów i kurzu, ponieważ przeciwciała wykazują wysoką nieswoistą powinowactwo do tych materiałów.

Ważne jest również, aby zawsze przeprowadzać barwienie jąder komórkowych. Możliwe jest usunięcie komórek krwi z oczyszczonych naczyń poprzez wykonanie perfuzji wewnątrzsercowej z użyciem PBS przed ekstrakcją naczyń. Z powodzeniem wyizolowaliśmy RNA i białka z naczyń oczyszczonych tą procedurą, zarówno ze świeżo przygotowanych, jak i zamrożonych preparatów naczyń.

Do badania funkcji transportu śródbłonkowego naczyń ex vivo wykorzystaliśmy również sondy fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.