Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest umożliwienie wielokrotnych pomiarów przewodności hydraulicznej lub przepuszczalności wodnej ścian mikronaczyń w krezce szczura w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. Osiąga się to poprzez kaniulację mikronaczyń, co pozwala na ustawienie ciśnienia onkotycznego i hydrostatycznego w świetle naczynia oraz precyzyjne kontrolowanie składu chemicznego płynu perfuzyjnego oraz płynu tkankowego. Następnie naczynie zostaje zamknięte, a zawieszone w płynie perfuzyjnym krwinki czerwone, pełniące rolę markerów przepływu, mogą być obserwowane w świetle naczynia jako wskaźniki transvaskularnej wymiany płynów.

Następnie rejestruje się pozycję i prędkość markerowych czerwonych krwinek, poruszających się albo w kierunku miejsca okluzji, albo w kierunku przeciwnym do miejsca okluzji. Na koniec okluzję zwalnia się i powtarza w celu przeprowadzenia dodatkowych pomiarów lub ponownie kaniuluje się naczynie i powtarza pomiary w zmienionych warunkach.

Ostatecznie można wykonać sparowane pomiary przewodności hydraulicznej w warunkach kontrolnych i testowych, aby umożliwić najbardziej bezpośrednie badanie czynników regulujących przepuszczalność mikronaczyń. Zaletą zmodyfikowanej techniki Landisa w badaniu regulacji przepuszczalności naczyń włosowatych jest etap perfuzji. Mikroperfuzja pozwala na pomiar przepuszczalności ścian mikronaczyń w warunkach, w których skład perfuzatu, powierzchnia wymiany oraz ciśnienie w mikronaczyniach są bezpośrednio kontrolowane.

Metoda ta pozwala na badanie mechanizmów komórkowych i molekularnych regulacji przepuszczalności w mikro naczyniach reprezentatywnych dla nienaruszonych organów oraz umożliwia porównanie uzyskanych wyników z danymi z hodowli monowarstw śródbłonka, które często są wykorzystywane do badania szczegółów mechanizmów molekularnych. Protokół prezentuje Joyce Clark, nasza kierownik laboratorium. Joyce była odpowiedzialna za wprowadzenie wielu ulepszeń w tym protokole podczas swojej pracy na stanowisku kierownika laboratorium.

Na początek należy użyć elektronicznej wyciągarki do uformowania z czystych rurek kapilarnych z borokrzemianowego szkła kilku ścienionych połówek, z których każda powinna mieć końcówkę o długości około jednego centymetra. Do tego celu wykorzystuje się napędzaną powietrzem szlifierkę z papierem ściernym o ziarnistości 0,5 mikrona, zanurzoną w wodzie, oraz uchwyt do mikro pipet ustawiony pod kątem 30 stopni względem poziomu skosu mikro pipet. Po umyciu i wysuszeniu mikro pipet zgodnie z protokołem tekstowym, należy wybrać te, które mają otwór o długości około 50 mikronów oraz stosunek długości skosu do jego szerokości w zakresie od 3,1 do 3,5. Powinny one również posiadać ostro ścieniony czubek, co ułatwia penetrację twardych włókien kolagenowych w krezce.

Aby przygotować ograniczniki, należy krótko trzymać nieoszlifowaną, wyciągniętą kapilarę szklaną w pobliżu mikro płomienia, aby uformować tępy koniec. Powtórz tę czynność, aby przygotować kilka ograniczników, i przechowuj je w pudełku wolnym od kurzu. Następnie przygotuj mikrookluzyjne końcówki, trzymając nieoszlifowaną, wyciągniętą rurkę kapilarną pod kątem w mikro płomieniu, a następnie użyj adaptera do rurek lub złamanej mikropipety, aby delikatnie zgiąć rurkę w odległości około czterech milimetrów od końcówki pod kątem bliskim 120 stopni.

W odniesieniu do szydła, ważne jest, aby końcówka nie była ani zapieczona w płomieniu, ani złamana. Po znieczuleniu szczura i ułożeniu tkanki krezkowej oraz jelita zgodnie z protokołem tekstowym, umieść tackę z zwierzęciem na stoliku mikroskopu tak, aby krezka była widoczna przez okulary. Ustaw linię kroplową grawitacyjną z roztworem Ringera dla ssaków w celu ciągłego przepłukiwania.

Następnie użyj gazików, aby utrzymać jelito w miejscu, pomóc w zachowaniu wilgoci i odprowadzić nadmiar roztworu Ringera z powierzchni, dostosuj przepływ i odsysaj wylewkę, aby utrzymać stałą warstwę surowicy, zidentyfikuj docelowe mikro-naczynia płaskie, które są niegałęziastymi segmentami poniżej zbieżnego przepływu i jeden lub dwa odgałęzienia dystalne w stosunku do prawdziwych naczyń włosowatych. Znajdź niegałęziaste naczynie o szybkim przepływie krwi, wolne od leukocytów przylegających do ściany naczynia. Umieść badane mikronaczynia w centrum pola widzenia mikroskopu i przesuń stabilizator w miejsce bliskie wybranemu miejscu kaniulacji.

Aby napełnić mikropipetę, pobierz Perfuse Eight i przemyte erytrocyty do strzykawki przygotowanej zgodnie z protokołem tekstowym, upewniając się, że w przewodach nie ma pęcherzyków powietrza. Wsuń przewód do szerokiego końca mikropipety, aż dotrze do zwężającej się części. Delikatnie i szybko naciśnij tłok strzykawki, aby napełnić końcówkę mikropipety.

Gdy pipeta zostanie napełniona, na jej końcówce pojawi się mały strumień lub kropla. Podczas wyciągania rurki należy delikatnie nacisnąć tłok, aby napełnić trzpień mikropipety. Następnie należy usunąć małe pęcherzyki powietrza z trzpienia, delikatnie nim strzepując.

Następnie umieść mikropipetę w uchwycie do pipet z bocznym portem, który umożliwia ciągłe połączenie cieczowe z manometrem wodnym. Upewnij się, że uchwyt, przymocowany do napędu hydraulicznego i mikromanipulatora, jest ustawiony pod niewielkim kątem poziomym, aby krawędź stożka mikropipety nie uderzyła w jelito lub tacę. Za pomocą strzykawki lub wypełnionej wodą gumowej gruszki dostosuj ciśnienie hydrostatyczne przykładane do cieczy w mikropipecie, zmieniając wysokość słupa cieczy w manometrze do około 40 centymetrów wody powyżej krezki.

Przed ustawieniem napełnionej mikropipety pod mikroskopem, delikatnie dociśnij stabilizator do tkanki w pobliżu mikronaczyń, przykładając siłę wystarczającą do uchwycenia tkanki, a następnie lekko odciągnij stabilizator, rozciągając tkankę w linii z mikronaczyniami tak, aby naprężenia w włóknach kolagenowych krezki były wyrównane z naczyniem. Ustaw mikropipetę w linii z naczyniem i opuść ją w pole widzenia okularów. Umieść końcówkę tuż powyżej wybranego miejsca kaniulacji i opuść ją na tkankę tak, aby częściowo utrudniała przepływ wewnątrz naczynia, ale go nie zamykała.

Za pomocą napędu hydraulicznego przeprowadź kanulację naczynia, powoli wprowadzając końcówkę pipety do światła naczynia, uważając, aby nie przebić końcówką przeciwległej ściany naczynia. W momencie wprowadzenia mikropipety do światła, perfuzat szybko wypłucze krew ze światła naczynia i wpłynie do krwiobiegu. Obniż ciśnienie perfuzji, regulując manometr, aż erytrocyty zaczną delikatnie oscylować w świetle naczynia.

Służy to do wyznaczenia ciśnienia równowagi, które mierzy ciśnienie hydrostatyczne w mikronaczyniach lub PC na dystalnym końcu segmentu mikronaczyniowego. Aby przeprowadzić mikrookluzyjne zamknięcie, należy utrzymać perfuzję naczynia powyżej tego ciśnienia równowagi. Korzystając z podglądu wideo i sygnału audio, umieść blokadę nad perfundowanym naczyniem w pobliżu dolnej krawędzi pola widzenia mikroskopu.

Zapisz słownie położenie miejsca blokady widoczne w czerwonym fragmencie I. Miejsce blokady to 57. Umieść końcówkę blokera tuż nad mikronaczyniem. Używając precyzyjnej kontroli osi Z mikromanipulatora, delikatnie opuszczaj bloker, aż do momentu zatrzymania przepływu w naczyniu.

Użyj dźwięku, aby odnotować ciśnienie na manometrze. Ciśnienie wynosi 50. Następnie zastosuj okluzję przez okres od 3 do 10 sekund i zwolnij.

Aby przywrócić swobodną perfuzję, przesuń miejsce blokady w górę naczynia w stronę końcówki pipety w krokach od 5 do 10 mikronów, wykonując nie więcej niż od trzech do pięciu okluzji w każdym punkcie, aby zapobiec uszkodzeniu ściany naczynia w miejscu blokady. Przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Ten przebieg czasowy mierzy zmiany w przewodnictwie hydraulicznym lub LP w szczurzych naczyniach mikrokrążeniowych pomyślnie kaniulowanych za pomocą czterech perfuzatów.

Wielkość LP przy stałym ciśnieniu została wykorzystana do pomiaru zmian w naczyniach mikrokrążenia. Przepuszczalność ściany mierzono podczas perfuzji 1% BSA jako kontroli w porównaniu z 10 molarami czynnika zapalnego, bradykininy (BK). Jak pokazano tutaj, BK spowodowała przejściowy wzrost LP, który powrócił do poziomu kontrolnego w ciągu 10 do 15 minut.

Po przywróceniu poziomów bazowych przy użyciu 1% BSA 10 nM, przeprowadzono reperfuzję BK wraz z 1 µM pH scene one phosphate lub S1P. Wyniki wskazują, że S1P znacząco osłabiło odpowiedź na BK. W przypadku niektórych projektów eksperymentalnych istotne jest oszacowanie zarówno współczynnika odbicia roztworu dla makrocząsteczki, jak i Lp.

Najlepiej osiąga się to poprzez pomiar JV przy wielu ciśnieniach w każdym z poszczególnych mikronaczyniach. W tym eksperymencie oszacowano zarówno LP, jak i efektywne ciśnienie onkotyczne 5% albuminy w PERFUSE eight, gdy w tkance otaczającej mikronaczynia nie było albuminy. Wartość JV w stosunku do S zmierzono przy trzech różnych ciśnieniach i przedstawiono na wykresie.

LP to nachylenie relacji między JV/S a ciśnieniem, a punkt przecięcia z osią ciśnienia stanowi efektywną różnicę ciśnień onkotycznych przez ścianę naczynia. W połączeniu z innymi technikami, takimi jak znakowanie immunofluorescencyjne i mikroskopia konfokalna, a nawet transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroperfuzja umożliwia zaawansowaną analizę śródbłonka mikronaczyniowego i jego funkcji z wykorzystaniem naczyń o znanej przepuszczalności. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzać powtórne pomiary przewodnictwa hydraulicznego lub przepuszczalności dla wody w mikronaczyniach krezki szczura w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych.

Podejście to można zastosować w obecnie dostępnych modelach szczurzych, jednak szczególnie interesuje mnie możliwość wykorzystania go w nowych szczurach modyfikowanych genetycznie, które staną się dostępne dzięki technologii CRISPR Cas nine, i mam nadzieję, że zostanie ono w ten sposób rozszerzone.