Name: Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Poznaj technikę mikroperfuzji do pomiaru przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura. Ta metoda pozwala kontrolować ciśnienie onkotyczne i hydrostatyczne, umożliwiając badanie wymiany płynów transwaskularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health HL44485 i HL28607.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
1. Wstępna produkcja mikropipet, ograniczników i blokerów
<ol>
	<li>Przeciągnij kilka czystych rurek kapilarnych ze szkła borokrzemianowego na pół za pomocą elektronicznego ściągacza wyregulowanego tak, aby po pociągnięciu rozciągnięta część rurki miała około 1 cm długości, a dwie połówki były nieco symetryczne. Upewnij się, że stożek jest zgodny z wymiarami na rysunku 1. Obu połówek należy używać do mikropipet, ograniczników i blokerów.
	<ol>
		<li>Ukosuj mikropipety za pomocą napędzanej powietrzem ściernicy30 z papierem ściernym 0,5 μm skąpanym w wodzie. Ustaw kąt uchwytu mikropipety tak, aby znajdował się około 30 stopni od poziomu.</li>
		<li>Dokładnie umyj i osusz mikropipety, używając ssania, aby przeciągnąć czysty aceton przez końcówkę i w górę trzonu. Sprawdzić mikropipety (Rysunek 1A) za pomocą małego mikroskopu pionowego z obiektywami 4× i 40×, wyposażonego w zacisk krokodylkowy, uchwyt do mikropipet i siatkę okularową.</li>
		<li>Wybierz mikropipety z otworem końcówki o długości około 50 μm, ze skosem, którego stosunek długości do szerokości wynosi od 3,1 do 3,5 i z ostro zwężającym się końcem, który pomaga penetrować twarde włókna kolagenowe w krezce.</li>
		<li>Przechowuj 15-20 mikropipet o nieco różnych rozmiarach w pudełku bezpyłowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj krępujące za pomocą ciągniętych rurek kapilarnych przygotowanych w kroku 1.1). Przytrzymaj przez chwilę wyciągniętą szklaną rurkę kapilarną w pobliżu mikropłomienia, aby utworzyć koniec (Rysunek 1B). Przechowuj kilka w bezpyłowym pudełku.</li>
	<li>Wykonaj mikrookludery za pomocą ciągniętych kapilar przygotowanych w kroku 1.1). Przytrzymaj wyciągniętą rurkę kapilarną pod mikropłomieniem i delikatnie zegnij (za pomocą adaptera do rurki, np. 23G) cienką końcówkę (około 4 mm od końcówki), aby uzyskać kąt zbliżony do 120 stopni do wału (Rysunek 1C). Zrób i przechowuj kilka.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i chirurgia zwierząt
<ol>
	<li>Samce (350-450 g) lub samice szczurów Sprague-Dawley (200-300 g) znieczulić pentobarbitalem sodu (80-100 mg/kg, Sigma-Aldrich, P3761) poprzez wstrzyknięcie podskórne; chroń krezkę, nie stosując iniekcji dootrzewnowej.</li>
	<li>Podczas zabiegów chirurgicznych i protokołów eksperymentalnych należy utrzymywać znieczulenie przez dodatkowe zastrzyki (30 mg/kg) w razie potrzeby. Określ głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi lub odruch rogówkowy. Po zakończeniu procedury eksperymentalnej należy poddać szczura eutanazji poprzez przedawkowanie pentobarbitalu lub wstrzyknięcie dosercowe nasyconego chlorku potasu w znieczuleniu.</li>
</ol>
3. Przygotuj roztwory i erytrocyty do użycia jako markery przepływu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór Ringera dla ssaków jako roztwór superfuzatu i kontrolny roztwór perfuzatu (zazwyczaj roztwór Ringera dla ssaków zawierający 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej wolnej od kwasów tłuszczowych, BSA).
	<ol>
		<li>Przefiltruj perfuzat przez filtry strzykawkowe 0,2 μm, aby usunąć drobne cząsteczki, które mogą zablokować końcówkę mikropipety; przefiltruj do małego, czystego pojemnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować erytrocyty, pobierając około 0,2 ml krwi z żyły ogonowej znieczulonego szczura do igły 20G na małej strzykawce zawierającej 0,05 ml heparyny (1000 U/ml) i przenieść do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej około 14 ml roztworu Ringera u ssaków.
	<ol>
		<li>Odwirować, aby delikatnie upakować czerwone krwinki (około 200 × g przez 7 minut). Odciągnąć supernatant i ponownie zawiesić krwinki czerwone w roztworze Ringera.</li>
		<li>Po trzykrotnym odwirowaniu i usunięciu supernatantu należy pozostawić upakowane krwinki czerwone na dnie probówki do późniejszego wykorzystania. Należy pamiętać, że ta procedura zmniejsza liczbę płytek krwi w końcowych perfuzatach do mniej niż 0,1% normalnego poziomu31.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ułóż chusteczkę na tacy dla zwierząt
<ol>
	<li>Ogolić brzuch znieczulonego szczura od dołu pępka do wyrostka mieczykowatego. Upewnij się, że ogolony obszar rozciąga się wokół prawej strony (w przypadku szczura umieszczonego po prawej stronie), tak aby włosy nie tworzyły, aby dobrze wyciągnąć superfuzat. Usuń ścięte włosy za pomocą zwilżonej gazy lub chusteczki.
	<ol>
		<li>Przytrzymaj skórę ząbkowanymi kleszczami i wykonaj środkowe nacięcie (o długości 2-3 cm) przez skórę za pomocą mocnych nożyczek. Za pomocą cienkich nożyczek (tęczówki) wykonaj podobne nacięcie przez linea alba, podnosząc ścianę brzucha ząbkowanymi kleszczami, aby uniknąć uszkodzenia jelita.</li>
		<li>Trzymając zwierzę na boku na tacy dla zwierząt, delikatnie wyciągnij jelito z jamy brzusznej za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką (drewniany patyczek) nasączonych roztworem Ringera i ząbkowanych kleszczy. Ułóż jelito w tkance tak, aby krezka była udrapowana na filarze do oglądania przez mikroskop, uważając, aby nie dotykać krezki (potencjalnie uszkadzając mikronaczynia) ani kleszczami, ani bawełną. 
		Uwaga: Taca dla zwierząt (Rysunek 2A) może być wykonana z pleksiglasu i wymaga studzienki na chusteczki (o głębokości około 3 mm), optycznie przezroczystego słupka (np. polerowanego kwarcu o średnicy około 2 cm i wysokości 5 mm) oraz podkładki grzewczej dostosowanej do utrzymania temperatury zwierzęcia. Grubość słupka nie może przekraczać odległości roboczej obiektywu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść tacę na zwierzęta na stoliku mikroskopu tak, aby krezka była widoczna przez okulary.</li>
	<li>Ustawić grawitacyjną linię kroplową, aby w sposób ciągły przelać krezkę z roztworem Ringera ssaków utrzymywanym w temperaturze 35–37 °C. Użyj gazików, aby utrzymać jelito na miejscu, pomóc zatrzymać wilgoć i usunąć nadmiar roztworu Ringera z powierzchni. Dostosuj przepływ i zasysaj ścieki, aby utrzymać stałą grubość superfuzatu.</li>
	<li>Zidentyfikuj docelowe mikronaczynia komorowe, które są nierozgałęzionymi segmentami poniżej przepływu zbieżnego, jedną lub dwiema gałęziami dystalnymi do prawdziwych naczyń włosowatych. Znajdź nierozgałęzione naczynie (najlepiej o długości od 600 do 1000 μm) o szybkim przepływie krwi i wolne od białych krwinek przyklejających się do ściany naczynia.</li>
	<li>Umieść mikronaczynie testowe w środku pola mikroskopu i przesuń ogranicznik na miejsce w pobliżu wybranego miejsca kaniulacji.</li>
</ol>
5. Napełnij mikropipetę i zamontuj w uchwycie
<ol>
	<li>Tuż przed kaniulacją zawieś krwinki czerwone w perfuzacie. Dodać 7 μl upakowanych krwinek czerwonych do 0,5 ml perfuzatu w czystej probówce borokrzemianowej. Uwaga: Można stosować hematokryty 1-3%, ale konsekwentny hematokryt doprowadzi do stałych stężeń perfuzatu wszelkich substancji uwalnianych z krwinek czerwonych.</li>
	<li>Założyć strzykawkę o pojemności 1 ml z adapterem rurki 23 G i rurką PE 50 (długość 5-15 cm). Pobrać mieszaninę perfuzatu i krwinek czerwonych do strzykawki. Odwrócić strzykawkę, aby wymieszać i usunąć wszystkie pęcherzyki z rurki i adaptera. Aby zwiększyć wydajność, przed rozpoczęciem eksperymentu dopasuj rurki do kilku strzykawek i przechowuj je w bezpyłowym pudełku lub plastikowej torbie.</li>
	<li>Napełnij mikropipetę, wsuwając rurkę w duży koniec mikropipety, aż będzie przylegać do stożkowego obszaru. Delikatnie i szybko nacisnąć tłok strzykawki, aby napełnić końcówkę mikropipety. Uwaga: Na końcówce powinien być widoczny mały strumień lub kropelka, aby udowodnić całkowite wypełnienie.</li>
	<li>Wyjmij rurkę, delikatnie naciskając tłok, aby napełnić szerszą część trzonu mikropipety. Usuń małe pęcherzyki z szerokiego trzonka, ostrożnie potrząsając trzonkiem mikropipety. Uwaga: Podobna procedura została zilustrowana32.</li>
	<li>Umieść mikropipetę w uchwycie na pipety z bocznym portem, który umożliwia ciągłe podłączenie płynu do manometru wodnego. Upewnij się, że uchwyt, który jest przymocowany do napędu hydraulicznego używanego do sterowania bardzo precyzyjnym przesuwaniem mikropipety, jest ustawiony pod niewielkim kątem (15-25°) do poziomu, tak aby krawędź stożka mikropipety nie dotykała jelita lub tacki.</li>
	<li>Zamontuj napęd hydrauliczny na ruchomym mikromanipulatorze, który ma napędy x, y i z, aby umożliwić ścisłe wyrównanie z naczyniem testowym (rysunek 2).</li>
	<li>Wyregulować ciśnienie hydrostatyczne przyłożone do płynu w mikropipecie za pomocą strzykawki lub gumowej gruszki wypełnionej wodą, aby zmienić wysokość płynu w słupie wody manometru na około 40cmH2O powyżej krezki.</li>
	<li>Kankaniulować mikronaczynie tak szybko, jak to możliwe po napełnieniu pipety; czerwone krwinki osiadają na dnie pipety, tak że po około 40 minutach bardzo niewiele czerwonych krwinek wpłynie do naczynia.</li>
</ol>
6. Mikrokaniulacja i pomiar ciśnienia mikronaczyniowego
<ol>
	<li>Przed umieszczeniem napełnionej mikropipety pod mikroskopem, delikatnie dociśnij ogranicznik do tkanki w pobliżu mikronaczynia, przykładając wystarczającą siłę, aby chwycić tkankę. Odciągnij krępujący kręp, lekko rozciągając tkankę w linii z mikronaczyniem, tak aby naprężenia we włóknach kolagenowych krezki były wyrównane z naczyniem.
	<ol>
		<li>Wyrównaj mikropipetę z naczyniem i opuść ją w pole widzenia przez okulary. Umieść końcówkę tuż przed wybranym miejscem kaniulacji i opuść ją na tkankę tak, aby częściowo utrudniała przepływ w naczyniu, ale go nie zamykała.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchomij naczynie, powoli wprowadzając końcówkę pipety w światło naczynia za pomocą napędu hydraulicznego. Uważaj, aby nie przepchnąć się przez dolną część naczynia. 
	Uwaga: Gdy mikropipeta wchodzi do światła, perfuzat szybko wypłukuje krew w naczyniu ze światła, a perfuzat swobodnie przepływa do krążenia zwierzęcia dystalnie do badanego mikronaczynia, wypierając część normalnej perfuzji krwi w naczyniach znajdujących się za nim.</li>
	<li>Obniż ciśnienie perfuzji, regulując manometr, aż krew (zgodnie z czerwonymi krwinkami zwierzęcia) zostanie wciągnięta z powrotem do perfundowanego segmentu; określa to ciśnienie równowagi, w którym krwinki czerwone delikatnie oscylują w świetle naczynia i mierzy ciśnienie hydrostatyczne w mikronaczyniach (Pc) na dystalnym końcu segmentu mikronaczynia. Utrzymuj perfuzję naczynia przy wszystkich ciśnieniach powyżej tego ciśnienia równoważącego.</li>
</ol>
7. Mikrookluzja i zbieranie danych
<ol>
	<li>Opcjonalny krok: Przed użyciem mikrookludera do zablokowania naczynia, wciśnij go w tkankę w nieużywanym obszarze krezki z dala od jakiegokolwiek naczynia, tak aby końcówka gromadziła cienką podkładkę tkanki, która chroni naczynie eksperymentalne podczas powtarzających się mikrookluzji.</li>
	<li>Umieść bloker nad perfundowanym naczyniem w pobliżu dolnej krawędzi pola mikroskopu.</li>
	<li>Nagraj następujące elementy z obrazem i dźwiękiem.
	<ol>
		<li>Zapisz ustnie lokalizację miejsca bloku i dolną krawędź ekranu, jak widać na siatce okularu.</li>
		<li>Trzymając końcówkę blokera umieszczoną tuż nad mikronaczyniem, użyj precyzyjnego regulatora z mikromanipulatora, aby delikatnie opuścić bloker, aż przepływ w naczyniu zostanie zablokowany. Zwróć uwagę na ciśnienie manometru (Pc) w dźwięku. Zastosuj okluzję zwykle na 3-10 sekund, a następnie zwolnij, przywracając swobodną perfuzję. Przesuwaj miejsce bloku w górę naczynia w kierunku końcówki pipety w krokach co 5-10 μm w zależności od czasu (>5 minuty po początkowym zablokowaniu w miejscu), liczby okluzji (3-5), aby zapobiec uszkodzeniu ścianki naczynia w miejscu bloku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza danych i pomiar przepuszczalności wody (Lp)
<ol>
	<li>Podczas odtwarzania wideo określ początkową odległość (l0) od czerwonej krwinki markera do miejsca okluzji, korzystając z obrazu mikrometru stage i znanych pozycji na obrazach. Określ prędkość początkową (dl/dt) komórki znacznika na podstawie jej położenia w kilku klatkach w ciągu 3-10 sekund zarejestrowanych obrazów. Określ promień naczynia (r) na podstawie zdjęć wykonanych podczas okluzji (ryc. 3).</li>
	<li>Oblicz Jv/S dla każdej okluzji jako (dl/dt)×(1/l0)× (r/2). Obliczyć Lp przy stałym ciśnieniu jako (Jv/S) podzielone przez ciśnienie napędowe (ciśnienie w mikronaczyniu – efektywne koloidalne ciśnienie osmotyczne; patrz Dyskusja).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szczegóły obliczeń Lp . Chociaż ruch płynu przeznaczyniowego zachodzi, gdy naczynie jest swobodnie ukrwione, taka wymiana jest zbyt mała, aby można ją było zmierzyć podczas swobodnej perfuzji, ponieważ zwykle jest to mniej niż 0,01% szybkości perfuzji naczynia. Jednakże, gdy perfuzja jest przejściowo zatrzymywana przez zamknięcie mikronaczynia, przepływ przeznaczyniowy (tj. filtracja) jest mierzony na podstawie ruchu markerowych krwinek czerwonych w świetle, gdy kolumna płyn...

Mikroperfuzja w układzie naczyniowym polega na ustanowieniu kontrolowanego przepływu sztucznego perfuzatu o znanym składzie za pomocą mikropipety w naczyniu krwionośnym o średnicy zwykle mniejszej niż 40 μm. Perfundowane naczynie pozostaje w swoim normalnym środowisku tkankowym i jest perfundowane krwią zwierzęcia aż do momentu kannelacji. W połączeniu z szeregiem technik obrazowania wideo lub fluorometrycznych, mikroperfuzja in situ umożliwia pomiar przepływu wody i substancji rozpuszczonych przez ścianki mikronaczyń w warunkach, w których znane są siły napędowe tych przepływów, a właściwości przepuszczalności ściany naczyniowej można bezpośrednio ocenić. Ponadto, kontrolując skład płynu otaczającego mikronaczynie w tkance (perfuzat i superfuzat), można badać regulację przepuszczalności i wymiany mikronaczyń, umożliwiając komórkom śródbłonka tworzącym ścianę mikronaczynia wystawienie na różne warunki eksperymentalne (agoniści, zmodyfikowane warunki perfuzji, wskaźniki fluorescencyjne do pomiaru składu wewnątrzkomórkowego i sygnalizacji) przez precyzyjnie mierzone okresy czasu (od sekund do godz.). Ponadto ultrastrukturalne lub cytochemiczne oceny kluczowych komórkowych struktur molekularnych regulujących barierę mogą być badane w tych samych mikronaczyniach, w których bezpośrednio mierzy się przepuszczalność. Podejście to stanowi zatem pomost między badaniem mechanizmów komórkowych i molekularnych modyfikacji funkcji bariery śródbłonkowej w monowarstwach hodowanych komórek śródbłonka a badaniem w nienaruszonych mikronaczyniach. Zapoznaj się z poniższymi recenzjami w celu dalszej oceny1-6.
Ograniczeniem mikroperfuzji jest to, że może być stosowana tylko w łożyskach mikronaczyniowych, które są cienkie, przezroczyste i mają wystarczającą integralność strukturalną, aby umożliwić kaniulację za pomocą szklanej mikropipety. Podczas gdy we wczesnych badaniach wykorzystywano mikronaczynia żaby w krezce i cienkim mięśniu piersiowymskóry 7,8, zdecydowanie najczęściej stosowanym preparatem w modelach ssaków jest krezka szczura9-15. Większość badań koncentrowała się na ostrych zmianach przepuszczalności naczyń badanych w okresach 1-4 godzin, ale nowsze badania zostały rozszerzone na pomiary na poszczególnych naczyniach 24-72 godziny po początkowej perfuzji12,16. Niedawno opracowana technologia CRISPR, która daje nadzieję na udostępnienie większej liczby genetycznie zmodyfikowanych modeli szczurów do badania regulacji przepuszczalności naczyńkrwionośnych 17, powinna umożliwić zastosowanie metod opisanych w niniejszym komunikacie w mikronaczyniach komorowych krezki w tych ważnych nowych modelach szczurów.
Metoda wymaga odwróconego mikroskopu wyposażonego w specjalnie skonstruowany stolik mikroskopowy wystarczająco duży, aby pomieścić zarówno preparat dla zwierząt, jak i co najmniej trzy mikromanipulatory używane do umieszczania mikronarzędzi blisko naczynia perfuzyjnego i ustawiania mikropipety perfuzyjnej do światła naczynia. Na przykład niestandardowa platforma do stolika mikroskopowego x-y (około 90 × 60 cm) może być wykonana z blachy stalowej o grubości 1 cm z powłoką odporną na rdzę. Stolik jest przymocowany do inżynierskiego stołu indeksowego lub dwóch prowadnic typu jaskółczy ogon zamontowanych pod kątem prostym i wspartych na teflonowych filarach lub transferach kulkowych do ruchu w płaszczyźnie poziomej. Typowy aparat (patrz ryc. 2) ma wiele wspólnego z mikroskopem i sprzętem do mikropozycjonowania używanym do szeregu eksperymentów mikrokrążenia przyżyciowego, takich jak te do pomiaru przepływu krwi w pojedynczym naczyniu i hematokrytu, miejscowego dostarczania tlenu przez mikronaczynia perfundowane krwią, regulacji napięcia mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz miejscowej akumulacji mikronaczyniowej znaczników fluorescencyjnych wstrzykiwanych do całego krążenia. 18-26
Podstawowym aspektem tej techniki jest pomiar przepływu objętościowego (Jv) przez określoną powierzchnię (S) ściany mikronaczynia. Aby osiągnąć to za pomocą zmodyfikowanej techniki Landisa opisanej w niniejszym dokumencie, wystarczy prosty mikroskop odwrócony. Na porcie obrazu montowana jest mała kamera wideo, a sygnał wideo, z dodaną podstawą czasu, jest wyświetlany na monitorze wideo i nagrywany w formie cyfrowej na komputerze lub jako sygnał cyfrowy lub analogowy na magnetowidzie. Po kaniulacji mikronaczynia część mikronaczynia widoczną dla kamery może być zmieniana poprzez przesuwanie stolika i manipulatorów jako jednostki bez przerywania kaniulacji.
Pomiar przepływów przeznaczyniowych może być również połączony z bardziej szczegółowymi badaniami przy użyciu zaawansowanego mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami, takimi jak urządzenia używane do pomiarów przepuszczalności substancji rozpuszczonych, monitorowania proporcji fluorescencji cytoplazmatycznego wapnia lub innych mechanizmów komórkowych oraz obrazowania konfokalnego 6,12,13,27. Kluczową zaletą wszystkich metod mikroperfuzji jest możliwość wykonywania powtarzających się pomiarów na tym samym naczyniu pod kontrolowaną zmianą siły napędowej, takiej jak ciśnienie hydrostatyczne i onkotyczne lub indukowana zmiana odpowiedzi naczyń na stany zapalne. Najpowszechniejszym projektem jest sparowane porównanie zmierzonej przewodności hydraulicznej (Lp) w tym samym naczyniu, przy czym naczynie najpierw zostało przepłukane za pomocą mikropipety wypełnionej perfuzatem kontrolnym i zawiesiną krwinek czerwonych w celu ustalenia wyjściowego stanu przepuszczalności, a następnie drugą pipetą z badanym czynnikiem dodanym do perfuzatu. Możliwe są wielokrotne kaniulacje z cyklem powtórzonym po reperfuzji za pomocą pipety kontrolnej.
Obecny protokół demonstruje kaniulację i mikroperfuzję naczynia komorowego w krezce szczura, aby rejestrować przepływy wody przez ścianę mikronaczynia i mierzyć Lp ściany naczynia, użyteczny wskaźnik przepuszczalności wspólnej drogi dla wody i substancji rozpuszczonych przez nienaruszoną barierę śródbłonkową. Procedura ta jest nazywana zmodyfikowaną techniką Landisa, ponieważ oryginalna zasada Landisa polegająca na wykorzystaniu względnego ruchu krwinek czerwonych jako miary wymiany płynu transnaczyniowego po zablokowaniu perfuzji jest zachowana28, ale zakres warunków eksperymentalnych (np. różnice ciśnienia hydrostatycznego i onkotycznego albuminy na ścianie mikronaczynia) dostępnych po mikroperfuzji jest znacznie większy niż w mikronaczyniach perfuzji krwi niekaniulowanej8,29.

<table><tbody><tr><td>MIKROSKOP, STÓŁ I STOLIK Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>odwrócony (typ metalurgiczny) z głowicą trójokularową do wideo: przykład</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>spróbuj umieścić okulary wyżej w stosunku do stolika - musisz patrzeć przez okulary, sięgając do górnej części stolika nad interweniującymi mikromanipulatorami</td></tr> mikroskop <tr><td>odwrócony (typ metalurgiczny) z głowicą trójokularową do wideo: przykład</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>spróbuj umieścić okulary wyżej w stosunku do sceny - musisz patrzeć przez okulary, sięgając do góry stolika nad interweniującymi mikromanipulatorami</td></tr><tr><td>o wąskiej średnicy, dużej odległości roboczej obiektyw: przykład</td><td>Nikon</td><td>Nikon E Plan 10 & razy;/0,25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>platforma sceniczna - spawalnia blachy stalowej 1/2 cala lub 1 cm</td><td>, powinna być ciężka, aby zmniejszyć wibracje</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół Unislide x-y: prowadnice z gołębim ogonem Kamera</td> wideo <td>CCD Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: przykład</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (już niedostępna)</td> <td>nie wymaga koloru</td></tr><tr><td>System przechwytywania wideo z dźwiękiem - ogólny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>system odtwarzania wideo (całkowicie nieruchoma klatka, ruch pojedynczej klatki)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mały </td><td></td><td></td><td></td>mikrofon</tr><tr><td>MIKROMANIPULATORY, UCHWYTY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator, XYZ (3)</td><td>Prior/Stoelting (już niedostępny)</td><td></td><td>szukaj drobnego Z i większego zakresu ruchu w napędach zgrubnych dla łatwości pozycjonowania</td></tr><tr><td>napęd sondy hydraulicznej, jednokierunkowy</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>należy dokupić napęd ręczny lub elektroniczny</td></tr><tr><td>ręczny napęd bębna&nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>lub napęd hydrauliczny, 3-drożny</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1-drożny) lub MX630 (3-drogowy)</td> <td>doskonały do krótkich ramion, wypełniony wodą i musi być odsyłany do uzupełnienia ~ co 2 lata</td></tr><tr><td>łączniki / pręty / uchwyty</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB itp.</td><td></td></tr><tr><td>imadło szpilkowe</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>do trzymania</td></tr><tr><td>uchwytu na pipetę</td> z ogranicznikiem <td>World Prescision Instruments</td><td>Manometr wodny MPH3</td><td></td></tr><tr><td>~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TACA</td><td></td><td></td><td></td>NA MIKROSKOP</tr><tr><td>przezroczysta pleksi do tacki mikroskopowej dla zwierząt</td><td></td><td></td><td></td></tr> 3<tr><td>/4 cala polerowana tarcza kwarcowa ~1/4 cala wysokości</td><td>Quartz Scientific Inc.</td><td>niestandardowe</td><td>&nbsp;( lub plexi polerowana, szkło); upewnij się, że wysokość jest mniejsza niż odległość robocza obiektywu</td></tr><tr><td>Klej do plexi (Weld-on 4: UWAGA RAKOTWÓRCZY)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>klej medyczny do dołka tkankowego</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna mata grzewcza z gumy silikonowej, 5 "L x 2" W</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>grzałka do tacy mikroskopu - potrzebuje przewodu i kontrolera - dostępna</td></tr> <tr><td>wersja 240 VAdapter przewodu zasilającego do grzałek i zestawów kaptonowych, 6 stóp, 120 VAC</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Regulator stałonapięciowy, 10 A; 120 V wejście, 0-140 V wyjście</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PRODUKCJA</td><td></td><td></td><td></td>PIPET</tr><tr><td>pionowy ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 z cienkościenną</td> rurką kapilarną o średnicy zewnętrznej 1,5 <td></td></tr><tr><td>mm</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>młynek do pipet mikroskop powietrzny i preparacyjny - zobacz odniesienie w tekście</td><td></td><td></td><td>lub kup pakiet od Sutter Instruments lub World Precision Instruments</td></tr><tr><td>RX Honing Machine, System II</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II Maszyna</td><td>alternatywna dla kamienia napowietrzającego, do użytku z mikroskopem preparacyjnym zamontowanym pod kątem</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; z ceramiczną tarczą ostrzącą</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>użyj "tak jak jest" lub dołącz</td></tr><tr><td>arkusze folii docierającej, 0,3 lub 0,5 um</td><td>3M</td><td>nr części 051144 80827</td><td>268X Imperial arkusze folii docierającej z samoprzylepnym tyłem - można kupić w Amazon</td></tr></tbody></table>

technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Eksperymenty mające na celu zmierzenie właściwości przepuszczalności indywidualnie perfundowanych mikronaczyń stanowią pomost między badaniem molekularnych i komórkowych mechanizmów regulujących przepuszczalność naczyń krwionośnych w hodowanych monowarstwach komórek śródbłonka a funkcjonalnymi właściwościami wymiany całych łożysk mikronaczyniowych. Opisano metodę kanniulacji i perfuzji mikronaczyń komorowych krezki szczura oraz pomiaru przewodności hydraulicznej ścianki mikronaczynia. Głównym potrzebnym sprzętem jest mikroskop przyżyciowy z dużym zmodyfikowanym stolikiem, który obsługuje mikromanipulatory w ustawianiu trzech różnych mikronarzędzi: (1) mikropipety ze szkła ze skosem do kanniulacji i perfuzji mikronaczynia; (2) szklany mikrookluder do przejściowego blokowania perfuzji i umożliwiający pomiar ruchu przepływu wody przeznaczyniowej przy mierzonym ciśnieniu hydrostatycznym oraz (3) szklany pręt do stabilizacji tkanki krezkowej w miejscu kaniulacji. Zmodyfikowana technika mikrookluzji Landisa wykorzystuje czerwone krwinki zawieszone w sztucznym perfuzacie jako markery ruchu płynu transnaczyniowego, a także umożliwia wielokrotne pomiary tych przepływów w miarę zmiany warunków eksperymentalnych oraz dokładnej kontroli hydrostatycznej i koloidalnej różnicy ciśnień osmotycznych w mikronaczyniach. Pomiary przewodności hydraulicznej najpierw przy użyciu perfuzatu kontrolnego, a następnie po ponownym kaniulacji tego samego mikronaczynia za pomocą perfuzatów testowych umożliwiają sparowane porównania odpowiedzi mikronaczynia w tych dobrze kontrolowanych warunkach. Próby rozszerzenia metody na mikronaczynia w krezce myszy z modyfikacjami genetycznymi, które miały modyfikować przepuszczalność naczyń krwionośnych, były poważnie ograniczone ze względu na brak długich, prostych i nierozgałęzionych mikronaczyń w krezce myszy, ale oczekuje się, że niedawna dostępność szczurów z podobnymi modyfikacjami genetycznymi przy użyciu technologii CRISPR/Cas9 otworzy nowe obszary badań, w których można zastosować opisane tutaj metody.

Rysunek 4 przedstawia wyniki pomiaru przebiegu czasowego zmian Lp w żylnej mikrotniczce szczura, do której kolejno wprowadzono cztery perfuzaty.33 Wartość Lp obliczona przy stałym ciśnieniu posłużyła jako miara zmian przepuszczalności ściany mikrotniczki, najpierw w stanie kontrolnym z perfuzatem zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej, a następnie po poddaniu naczynia działaniu czynnika zapalnego – bradykininy (Bk) przy użyciu drugiej mikropipety zawierającej 10 nM Bk...

Zmodyfikowana technika Landisa umożliwia sparowany pomiar przewodnictwa hydraulicznego poszczególnych mikronaczyń w krezce normalnych i genetycznie zmodyfikowanych szczurów w warunkach kontrolnych i testowych przy użyciu technik mikroperfuzji. Stanowi wygodną metodę oceny mechanizmów regulujących przepuszczalność mikronaczyń i wymianę transnaczyniową w warunkach fizjologicznych.

Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest umożliwienie wielokrotnych pomiarów przewodności hydraulicznej lub przepuszczalności wodnej ścian mikronaczyń w krezce szczura w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. Osiąga się to poprzez kaniulację mikronaczyń, co pozwala na ustawienie ciśnienia onkotycznego i hydrostatycznego w świetle naczynia oraz precyzyjne kontrolowanie składu chemicznego płynu perfuzyjnego oraz płynu tkankowego. Następnie naczynie zostaje zamknięte, a zawieszone w płynie perfuzyjnym krwinki czerwone, pełniące rolę markerów przepływu, mogą być obserwowane w świetle naczynia jako wskaźniki transvaskularnej wymiany płynów.Następnie rejestruje się pozycję i prędkość markerowych czerwonych krwinek, poruszających się albo w kierunku miejsca okluzji, albo w kierunku przeciwnym do miejsca okluzji. Na koniec okluzję zwalnia się i powtarza w celu przeprowadzenia dodatkowych pomiarów lub ponownie kaniuluje się naczynie i powtarza pomiary w zmienionych warunkach.Ostatecznie można wykonać sparowane pomiary przewodności hydraulicznej w warunkach kontrolnych i testowych, aby umożliwić najbardziej bezpośrednie badanie czynników regulujących przepuszczalność mikronaczyń. Z

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Niniejszy artykuł opisuje prosty model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Model ten powoduje gwałtowny wzrost pączkowania naczyń włosowatych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyń w stosunkowo krótkim czasie, w tkance umożliwiającej wizualizację en face całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczej komórki.

Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Miografia ciśnieniowa służy do oceny wazoaktywności małych tętnic, które rozwijają trwałe zwężenie pod wpływem ciśnienia. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół oceny w izolowanych odcinkach małych tętnic krezkowych u szczurów, wazoaktywności i wpływu ciśnienia śródświetlnego na średnicę naczyń krwionośnych.

Ocena odpowiedzi miogennej i wazoaktywności w opornych tętnicach krezkowych za pomocą miografii ciśnieniowej

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Angiogeneza obejmuje interakcje wielokomórkowe, wielosystemowe, które muszą być badane w fizjologicznie odpowiednim środowisku. Celem tego badania jest wykazanie zdolności modelu hodowli krezki szczurów do dokonywania poklatkowych porównań nienaruszonych sieci mikronaczyniowych podczas angiogenezy.

Metoda ex vivo do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych krezki szczura

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.

Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów

Ten protokół przedstawia metodę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego krezki i wizualizacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w żyłkach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Przepływ krwi w tętnicy krezkowej górnej był ograniczony przez 1 godzinę, po czym nastąpiła reperfuzja, co umożliwiło bezpośrednie ilościowe określenie adhezji leukocytów i NETozy.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej

W niniejszym filmie zaprezentowano technikę wycięcia i usunięcia grasicy płodowej, a także przygotowanie kultur ex vivo grasicy traktowanej 2-dGuo. <br...

Przygotowanie hodowli organowych grasicy traktowanych 2-dGuo

Sposób, w jaki nisze i komórki macierzyste tworzą się podczas rozwoju, jest istotnym zagadnieniem o praktycznym znaczeniu. W jajniku Drosophila komórki macierzyste linii zarodkowej oraz ich nisze somatyczne powstają podczas rozwoju larwalnego. Niniejszy film prezentuje sposób preparowania, barwienia i montowania gonad samic larw Drosophila w późnym trzecim stadium larwalnym (LL3).

Disekcja i barwienie jajników larw Drosophila

Poznaj technikę mikroperfuzji do pomiaru przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura. Ta metoda pozwala kontrolować ciśnienie onkotyczne i hydrostatyczne, umożliwiając badanie wymiany płynów transwaskularnych.

Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

Przeglądaj więcej filmów