VDJ-Seq: Analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek B

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka składu klonalnego próbek chłoniaka w celu identyfikacji wzorców ewolucji klonalnej w nawrotach chłoniaka. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chłoniaków, takie jak sposób powstania nawrotowych guzów z guzów pierwotnych. Główną zaletą tego protokołu jest dostosowanie najnowszej technologii sekwencjonowania wysokoprzepustowego, co pozwala na bardziej kompleksowe mapowanie wspólnych cech chłoniaków.

W niniejszym protokole DNA zostanie wyekstrahowane z cienkich skrawków tkanek prawidłowych lub nowotworowych, zamrożonych w OCT oraz utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, w celu uzyskania DNA z tkanek zamrożonych w OCT. Najpierw należy poddać trawieniu od 10 do 30 cienkich skrawków w czterech mililitrach buforu do lizy kwasów nukleowych z proteinazą K i 0,625% SDS w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia do mieszaniny trawiennej należy dodać jeden mililitr nasyconego 5 M chlorku sodu i energicznie wstrząsać przez 15 sekund, a następnie odwirować przy 1 100 ×g przez 15 minut.

W temperaturze pokojowej przenieś nadsącz do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodaj dwie objętości 100% etanolu, wymieszaj, odwracając probówkę sześć do ośmiu razy, a następnie wiruj przy 5 000 ×g przez 60 minut w temperaturze 4°C. Aby zebrać wytrącone DNA, przemyj osad DNA dwukrotnie 70% etanolem, wirując przy 5 000 ×g przez 15 minut przy każdym myciu.

Aby zebrać osad, rozpuść osad DNA w 100 do 400 µL buforu TE w temperaturze pokojowej na wytrząsarkach przez noc, aby wyekstrahować DNA z cienkich przekrojów tkanki utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie. Najpierw przeprowadź deparafinizację, inkubując przekroje parafiniowe w 1 mL ksylenu dwukrotnie w temperaturze pokojowej przez 10 minut za każdym razem. Zbierz przekroje tkankowe, wirując je przy 13 000 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń pozostałości ksylenów, inkubując przekroje dwukrotnie w jednym mililitrze 100% etanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut za każdym razem. Odzyskaj przekroje tkankowe, wirując je przy 13 000 ×g przez pięć minut. Pozostaw przekroje do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut.

Do próbek dodać świeżo przygotowany roztwór proteinazy K do uzyskania końcowej objętości od 50 do 100 µL i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia podgrzać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut w celu inaktywacji proteinazy K. Wydajność DNA z ekstrakcji przedstawionych w poprzednim segmencie wynosi od 5 do 200 µg w zależności od wielkości tkanki.

Kolejnym krokiem jest ocena jakości każdej próbki DNA w mieszaninie w probówce PCR. Należy połączyć 25 µL polimerazy TDNA z 45 µL master mixu z komercyjnego zestawu markerów. Do probówki PCR należy dodać pięć µL DNA i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej pięć razy.

Przeprowadź amplifikację DNA zgodnie z warunkami szczegółowo opisanymi w tekście protokołu. Następnie wymieszaj 20 µL reakcji PCR z czterema µL 6x barwnika do nakładania próbek i nanieś na żel agarozowy 2%. Po zakończeniu elektroforezy zabarw żel agarozowy bromkiem etydium i wykryj produkty PCR.

Przy użyciu systemu obrazowania żeli wykorzystane zostaną próbki, które dają pięć produktów PCR o rozmiarach 100, 200, 300, 400 i 600 par zasad, wyłącznie w celu wygenerowania amplikonów VDJ. W niniejszym filmie zaprezentowana zostanie amplifikacja rekombinowanego segmentu I-G-H-V-D-J z regionu ramowego jeden lub IGV HFR one. Amplifikacja rekombinowanego segmentu I-G-H-B-D-J z regionu ramowego dwa przebiega według podobnej procedury i jest opisana w tekście protokołu w mieszaninie w probówce do PCR.

45 µL master mixu z probówki oznaczonej jako mix dwa z komercyjnego zestawu do wykrywania hipermutacji IGH w komórkach somatycznych metodą żelową, 0,25 µL polimerazy TAC DNA oraz 5 µL DNA próbki. DNA należy amplifikować zgodnie z warunkami opisanymi w tekście protokołu. W celu amplifikacji suboptimalnego DNA można dostosować warunki PCR poprzez wydłużenie czasu przyzwalania (annealing time) lub zwiększenie liczby cykli amplifikacji. Produkty PCR należy rozdzielić za pomocą elektroforezy na żelu AGROS 2%. Żel AGROS należy barwić roztworem bromku etydium o stężeniu 0,5 µg/mL i wykryć produkty PCR.

W systemie obrazowania żeli oczekiwany jest amplikon monoklonalny o rozmiarze od 310 do 380 par zasad. Wytnij fragment żelu zawierający amplikon monoklonalny. Następnie oczyść DNA z wyciętego fragmentu żelu, używając standardowego zestawu do ekstrakcji z żelu zgodnie z protokołem producenta.

Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś oczyszczony produkt V-D-J-P-C-R do probówki PCR i dodaj bufor do resuspensji Res z zestawu do przygotowania próbek DNA, aby zwiększyć objętość do 60 µl. Dodaj 40 µl mieszaniny do naprawy końców z zestawu do przygotowania próbek DNA, dokładnie wymieszaj i inkubuj reakcję w temperaturze 30 °C przez 30 minut w wcześniej rozgrzanym termocyklerze z pokrywą podgrzaną do 100 °C. Następnie wymieszaj 136 µl kulek magnetycznych i 24 µl wody klasy PCR w probówce o pojemności 1,5 ml, przenieś całą reakcję naprawy końców do probówki i dobrze wymieszaj z roztworem kulek.

Umieść probówki na statywie magnetycznym na dwie minuty, aby umożliwić oddzielenie kulek od roztworu. Odsaj cały nadsącz i przemyj kulki dwukrotnie świeżo przygotowanym 80% etanolem. Całkowicie odsaj roztwór etanolu i pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po 15 minutach wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i resuspender kulki w 17,5 µL buforu Resus Suspension Buffer. Umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym na dwie minuty, aby oddzielić kulki od buforu Resus Suspension Buffer. Przenieś bufor Resus Suspension Buffer, który zawiera teraz produkt naprawy końców, do czystej probówki do PCR.

Kolejnym krokiem jest dodanie ogona A do produktu naprawy końców. Do probówki PCR zawierającej produkt naprawy końców należy dodać 12,5 µL mieszaniny do dołączania ogona A i dokładnie wymieszać. Probówki PCR należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w wstępnie podgrzanym termocyklerze z pokrywą podgrzaną do 100 °C.

W celu ligacji adapterów do mieszaniny po reakcji ogonkowania (a-tailing) należy dodać 2,5 µL buforu zawiesającego Resus, 2,5 µL mieszaniny ligacyjnej oraz 2,5 µL indeksowanego adaptera DNA. Reakcję inkubuje się w temperaturze 30 °C przez 30 minut w termocyklerze z podgrzaną pokrywą ustawioną na 100 °C. Po 30 minutach do każdej reakcji należy dodać 5 µL buforu zatrzymującego ligację i dokładnie wymieszać.

Do każdej reakcji dodaj 42,5 µL dobrze wymieszanych kulek magnetycznych i przemyj 80% ethanol zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Dodaj 50 µL buforu Resus suspension buffer, aby eluować produkt z ligacją adapterów. Oczyść produkt z ligacją adapterów po raz drugi, używając 50 µL dobrze wymieszanych kulek ampu XP, a następnie eluuj produkt do 25 µL buforu Resus Suspension Buffer do czystej probówki PCR.

Aby przeprowadzić amplifikację amplikonu VDJ, należy dodać pięć mikrolitrów koktajlu starterów PCR oraz 25 mikrolitrów mieszaniny PCR (master mix) do probówki PCR zawierającej produkt z ligacją adapterów i dokładnie wymieszać, a następnie przeprowadzić amplifikację w termocyklerze zgodnie z warunkami opisanymi w tekście protokołu. Po zakończeniu amplifikacji należy oczyścić produkt reakcji, używając 50 mikrolitrów dobrze wymieszanych kulek magnetycznych, a następnie eluować produkt końcowy w 30 mikrolitrach buforu Resus. Biblioteka amplikonów VTJ zostaje następnie zwalidowana, połączona i poddana sekwencjonowaniu zgodnie z opisem w tekście protokołu.

Z uwagi na niską złożoność biblioteki sekwencyjnej VVG, zalecamy dodanie od 20 do 50% prób sekwencyjnych o zatwierdzonych parametrach w celu umożliwienia dokładnego odczytu zasad. Te reprezentatywne obrazy żelowe przedstawiają produkty amplikonowe V-D-J-P-C-R z DNA wyizolowanego z próbek pacjentów z chłoniakiem. Jakość amplikonu V-D-J-P-C-R przed i po konstrukcji biblioteki została oceniona za pomocą bioanalizatora.

Zmiana wielkości z 334 par zasad do 459 par zasad wskazuje na dodanie adaptera w celu śledzenia ewolucji klonalnej w przypadku nawrotu chłoniaka rozlanego z dużych komórek B. Przeprowadzono analizę filogenetyczną profili somatycznych hipermutacji (SHM) głównych rearanżacji VDJ łańcucha ciężkiego pomiędzy próbkami pobranymi w momencie diagnozy a próbkami z okresu nawrotu.

Zaobserwowano późny model rozbieżnej ewolucji klonalnej. Opracowano nowe metody graficzne służące do wizualizacji ewolucji klonalnej. Przedstawione wzorce to wykresy wielowymiarowego skalowania dla modelu nawrotu późnorozbieżnego oraz wczesnorozbieżnego.

Promień każdego koła wskazuje liczbę subklonów odpowiadających konkretnemu profilowi SHM. Kolor niebieski odpowiada próbce diagnostycznej, a czerwony próbce z nawrotem. Podobnie, grafy nieskierowane pokazują, że rozkład liczby subklonów w przypadku późnej dywergencji różni się od przypadku wczesnej dywergencji.

Krawędzie odpowiadają dwóm profilom SHM z odległością ciągów wynoszącą jedną literę, a kolorowa skala wskazuje proporcję sekwencji przypisanych do konkretnego profilu SHM odpowiadającego czerwonej próbce diagnostycznej lub żółtej próbce z nawrotu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest unikanie kontaminacji krzyżowej między próbkami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak oceniać clonalność próbek guzów chłoniaka.

To podejście może być również wykorzystane do śledzenia minimalnej choroby resztkowej oraz badania odpowiedzi nadzoru immunologicznego na nowotwory. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.