Name: VDJ-Seq: Analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek B (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Poznaj metodę głębokiego sekwencjonowania regionów VDJ immunoglobuliny w celu analizy architektury klonalnej chłoniaka. Technika ta ujawnia wzorce ewolucji klonalnej między diagnozą a nawrotem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować dr Ricie Shaknovich i członkom laboratorium Elemento, laboratorium Melnick i laboratorium Tam za wnikliwe dyskusje. Chcielibyśmy również podziękować Genomics Resources Core Facility w Weill Cornell Medical College za przeprowadzenie sekwencjonowania VDJ. YJ był wspierany przez ASH Scholar Award. WT i OE są wspierane przez Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE jest wspierany przez nagrodę NSF CAREER, Starr Cancer Consortium i Hirschl Trust. Chcielibyśmy również podziękować Katherine Benesch, JD, MPH za jej hojne wsparcie dla tego projektu.

1. Wzmocnienie VDJ
1.1) Ekstrakcja DNA z próbek guza
<ol>
	<li>Ekstrakcja DNA z cienkich skrawków (10-20 μm) zamrożonych tkanek normalnych lub złośliwych osadzonych w OCT.
	<ol>
		<li>Trawić 10-30 cienkich skrawków osadzonej tkanki pociętych mikrotomem kriostatu w 4 ml buforu do lizy nukleinowej (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2; 0,3 M NaCl; 0,002 M Na2EDTA) za pomocą proteinazy K (0,5 mg / ml, stężenie końcowe) i 0,625% SDS w 15 ml probówce wirówkowej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Dodać 1 ml nasyconego NaCl (5 M) do mieszanki wytrawiającej i energicznie wstrząsać przez 15 sekund.</li>
		<li>Wirować przy 1 100 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać dwie objętości 100% etanolu.</li>
		<li>Wymieszaj, odwracając rurkę 6-8 razy. Wirować przy 5 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania wytrąconego DNA.</li>
		<li>Umyj osad DNA dwukrotnie 70% etanolem. Wirować przy 5,000 x g przez 15 minut za każdym razem, aby zebrać osad.</li>
		<li>Rozpuść DNA w 100-400 μl buforu TE w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez noc. Wydajność DNA wynosi od 5 do 200 μg (końcowe stężenie między 50-500 ng/μl) w zależności od wielkości tkanki</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA z cienkich skrawków (10-20 μm) normalnej lub złośliwej tkanki utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (FFPE).
	<ol>
		<li>Inkubować skrawki parafiny w 1 ml ksylenu dwa razy w temperaturze pokojowej przez 10 minut za każdym razem w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml w celu odparafinowania. Zbierz skrawki tkanki, wirując w temperaturze 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować skrawki w 1 ml 100% etanolu dwa razy w temperaturze pokojowej, za każdym razem 10 minut, aby usunąć pozostałości ksylenów. Zbierz skrawki tkanki, wirując w temperaturze 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W tym momencie parafina jest całkowicie rozpuszczona i pozostaje tylko wycinek tkanki.</li>
		<li>Suszyć sekcje na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut.</li>
		<li>Przygotować 0,5 mg/ml roztworu proteinazy K z 1x buforem PCR (rozcieńczonym z 10x buforu PCR wodą wolną od nukleaz). Dodać roztwór proteinazy K do próbek w końcowej objętości 50-100 μl i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut w celu inaktywacji proteinazy K. 
		Uwaga: Na tym etapie próbka DNA rozpuszcza się w buforze PCR i może być bezpośrednio wykorzystana w krokach 1.2 i 1.3. Wydajność DNA wynosi od 0,5 do 20 μg (końcowe stężenie między 10-200 ng/μl) w zależności od wielkości tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
1.2) Ocena jakości DNA
<ol>
	<li>Wymieszaj 0,25 μl polimerazy DNA Taq z 45 μl mieszanki wzorcowej z dostępnego w handlu zestawu drabinkowego w probówce do PCR.</li>
	<li>Dodać 5 μl DNA przygotowanego z 1.1.1.7 lub 1.1.2.5 do probówki PCR i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół przez co najmniej 5 razy.</li>
	<li>Do amplifikacji DNA należy zastosować następujące warunki: 95 °C przez 7 minut, a następnie 35 cykli po 45 sekund w temperaturze 95 °C, 45 sekund w temperaturze 60 °C i 90 sekund w temperaturze 72 °C; następnie 72 °C przez 10 minut i utrzymać w temperaturze 15 °C.</li>
	<li>Przygotuj 2% żel agarozowy w TBE (Tris/Boran/EDTA).</li>
	<li>Wymieszaj 20 μl reakcji PCR z 4 μl 6x obciążającego barwnika i załaduj na 2% żel agarozowy.</li>
	<li>Wybarwić żel agarozowy roztworem bromku etydyny o stężeniu 0,5 μg/ml i wykryć produkty PCR za pomocą systemu obrazowania żelu. Uwaga: próbki, które dają 5 produktów PCR o rozmiarach 100, 200, 300, 400 i 600 pz, będą kontynuowane w celu wytworzenia amplikonów VDJ. 
	UWAGA: Bromek etydyny jest silnym mutagenem. Prosimy o zachowanie szczególnej ostrożności, noszenie sprzętu ochronnego, tj. rękawic, i wyrzucanie do specjalnych pojemników zgodnie z wytycznymi instytucji.</li>
</ol>
1.3) VDJ PCR
1.3.1) Amplifikacja rekombinowanego segmentu IgH VDJ z regionu ramowego 1 (IgVHFR1)
<ol>
	<li>Wymieszać 45 μl mieszanki wzorcowej z probówki oznaczonej jako "Mix 2" komercyjnego somatycznego testu hipermutacji IGH do zestawu do wykrywania żelu, 0,25 μl polimerazy Taq DNA i 5 μl próbki DNA przygotowanej z 1.1.1.7 lub 1.1.2.5 w probówce do PCR.</li>
	<li>Do amplifikacji DNA należy zastosować następujące warunki: 95 °C przez 7 minut, a następnie 35 cykli po 45 sekund w temperaturze 95 °C, 45 sekund w temperaturze 60 °C i 90 sekund w temperaturze 72 °C; następnie 72 °C przez 10 minut i utrzymać w temperaturze 15 °C.</li>
	<li>Rozpuść cały produkt PCR w 2% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy.</li>
	<li>Wybarwić żel agarozowy roztworem bromku etydyny o stężeniu 0,5 μg/ml i wykryć produkty PCR za pomocą żelowego systemu obrazowania. Oczekuje się, że amplikon monoklonalny będzie miał zakres wielkości 310-380 pz.</li>
	<li>Odciąć część żelu zawierającą amplikon monoklonalny między 310-380 pz.</li>
	<li>Oczyść DNA z wyciętego żelu za pomocą standardowego zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta. Uwaga: w przypadku próbek, w przypadku których można uzyskać fragmenty FR1, nie ma potrzeby obfitego oznaczania IgVHFR2 i IgVHFR3.</li>
</ol>
1.3.2) Amplifikacja rekombinowanego segmentu IgH VDJ z Regionu Ramowego 2 (IgVHFR2)
<ol>
	<li>Wymieszać 45 μl mieszanki wzorcowej z probówki oznaczonej jako "Probówka B" komercyjnego testu klonalności genu IGH do zestawu do wykrywania żelu, 0,25 μl polimerazy Taq DNA i 5 μl próbki DNA przygotowanej z 1.1.1.7 lub 1.1.2.5 w probówce do PCR.</li>
	<li>Do amplifikacji DNA należy zastosować następujące warunki: 95 °C przez 7 minut, następnie 35 cykli po 45 sekund w temperaturze 95 °C, 45 sekund w temperaturze 60 °C i 90 sekund w temperaturze 72 °C; następnie 72 °C przez 10 minut i pozostawić w temperaturze 15°C.</li>
	<li>Rozpuść cały produkt PCR w 2% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy.</li>
	<li>Uwidocznić produkt(y) PCR za pomocą barwienia bromkiem etydyny 0,5 μg/ml. Amplikon monoklonalny można zaobserwować w zakresie wielkości 250-295 pz.</li>
	<li>Odciąć część żelu zawierającą amplikon monoklonalny w zakresie od 250 do 295 pz.</li>
	<li>Oczyść DNA z wyciętego żelu za pomocą standardowego zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
1.4) Zoptymalizuj VDJ PCR
<ol>
	<li>Do amplifikacji IgVHFR1 i IgVHFR2 przy użyciu suboptymalnego DNA należy zastosować następujące zmodyfikowane warunki PCR: 95 °C przez 7 min, 40 cykli po 95 °C przez 60 sekund, 60 °C przez 60 sekund i 72 °C przez 90 sekund, końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki amplikonów VDJ
2.1) Przygotowanie biblioteki
2.1.1) Naprawa końcowa
<ol>
	<li>Przenieś produkt VDJ PCR z 1,3 do probówki do PCR i dodaj bufor do reprodukcji z zestawu do przygotowywania próbek DNA, aby zwiększyć objętość do 60 μl.</li>
	<li>Dodaj 40 μl End Repair Mix z zestawu do przygotowywania próbek DNA i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 30 minut w nagrzanym termocyklerze (30 °C) z pokrywką podgrzaną do temperatury 100 °C.</li>
	<li>Najpierw wymieszaj 136 μl kulek magnetycznych i 24 μl wody klasy PCR w probówce o pojemności 1,5 ml, a następnie przenieś całą reakcję naprawy końcowej z 2.1.1.3 do probówki 1,5 ml i dobrze wymieszaj z roztworem kulek.</li>
	<li>Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 2 minuty, aby umożliwić oddzielenie kulek od roztworu. Odessać supernatant i umyć kulki 80% świeżo przygotowanym EtOH dwukrotnie, gdy probówka znajduje się na stojaku magnetycznym.</li>
	<li>Całkowicie odessać roztwór etanolu i pozostawić kulki do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Zdejmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w buforze do ponownego zawieszania 17,5 μl.</li>
	<li>Umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od bufora do ponownego zawieszania. Usuń bufor do ponownego zawieszenia (produkt do naprawy końcowej jest teraz ponownie zawieszony w buforze do ponownego zawieszenia) do czystej probówki do PCR.</li>
</ol>
2.1.2) Ogon A
<ol>
	<li>Dodaj 12,5 μl mieszanki ogonkowej A do probówki PCR zawierającej produkt do naprawy końcowej i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Inkubować probówkę do PCR w temperaturze 37 °C przez 30 minut w nagrzanym termocyklerze (37 °C) z pokrywką podgrzaną do temperatury 100 °C.</li>
</ol>
2.1.3) Podwiązanie adaptera
<ol>
	<li>Dodaj 2,5 μl buforu do reszpulacji do reszty, 2,5 μl mieszanki ligacyjnej i 2,5 μl indeksu adaptora DNA do reakcji ogonowania A.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 30 minut w nagrzanym termocyklerze (30 °C) z pokrywką podgrzaną do 100 °C.</li>
	<li>Dodać 5 μl buforu do ligacji zatrzymującej do każdej reakcji i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Wymieszać 42,5 μl dobrze wymieszanych kulek magnetycznych, aby oczyścić reakcję, wykonując czynności od 2.1.1.5 do 2.1.1.8. Dodać 50 μl buforu do ponownego wyparcia, aby wymyć produkt podwiązany adapterem.</li>
	<li>Wyczyść produkt podwiązany adapterem po raz drugi, używając 50 μl dobrze wymieszanych kulek AMPure XP i eluuj produkt w 25 μl buforu do reprodukcji do czystej probówki PCR.</li>
</ol>
2.1.4) Amplifikacja fragmentów DNA
<ol>
	<li>Dodaj 5 μl PCR Primer Cocktail i 25 μl PCR Master Mix do probówki PCR zawierającej produkt podwiązany adaptorowo i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Wykonaj amplifikację we wstępnie zaprogramowanym termocyklerze w następujących warunkach: 98 °C przez 30 sekund; 10 cykli po 98 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 30 sekund; następnie 72 °C przez 5 minut i utrzymuj w temperaturze 10 °C.</li>
	<li>Oczyść reakcję za pomocą dobrze wymieszanych kulek magnetycznych o pojemności 50 μl i eluuj produkt końcowy w 30 μl buforu do rezaspensji.</li>
</ol>
2.1.5) Walidacja biblioteki
<ol>
	<li>Określić ilościowo produkt końcowy za pomocą fluorometru przy użyciu protokołu producenta. Końcowe stężenie biblioteczne wynosi od 2,5 do 20 ng/μl.</li>
	<li>Oceń jakość produktu końcowego za pomocą instrumentu analitycznego z chipem DNA o wysokiej czułości zgodnie z protokołem producenta. Spodziewaj się pojedynczej opaski o oczekiwanym rozmiarze dla IGVHFR1, IGVHFR2 lub IGVHFR3. Oczekiwany rozmiar produktu bibliotecznego jest równy rozmiarowi oryginalnego wzmacniacza VDJ plus rozmiar adapterów (~125 bp).</li>
</ol>
2.2) Łączenie i sekwencjonowanie bibliotek VDJ-PCR
<ol>
	<li>Oblicz molowość każdej frakcji bibliotecznej, korzystając z następującego wzoru: nM = [(ng/1,000)/bp*660] x 109 gdzie ng jest stężeniem biblioteki VDJ-PCR zmierzonym w kroku 2.1.5.1, a bp jest wielkością piku biblioteki VDJ-PCR zmierzoną w kroku 2.1.5.2.</li>
	<li>Rozcieńczyć bibliotekę do 2 nM (łącznie 10 μl) wodą wolną od DNaz.</li>
	<li>Połączyć 10 μl rozcieńczonych bibliotek 2 nM w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać równą objętość kontrolki PhiX do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Załaduj basen o stężeniu 7 pM na komorę przepływową.</li>
	<li>Sekwencjonuj biblioteki za pomocą sekwencera 150 cykli ze sparowanym końcem zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
3. Analiza danych
Uwaga: Podsumowanie skryptów bioinformatycznych używanych w tej sekcji można znaleźć jako Plik Kodu Uzupełniającego.
3.1) Wyrównanie i kontrola jakości
<ol>
	<li>Sekwencjonowanie sparowanych końców mapy odczytuje bazę danych ludzkich regionów IGH V, D i J pobraną ze strony internetowej IMGT11 przy użyciu dostosowanego algorytmu blastu nukleotydów opartego na "blastn" dostępnym w NCBI z karą za otwarcie luki 2, karą za wydłużenie przerwy wynoszącą 1, długością słowa 7 i progiem wartości e 10-4. Odrzucenie pary odczytu nie jest odwzorowywane zarówno na region IGH V, jak i J.</li>
	<li>Policz pozostałe pary odczytu, które mają odwzorowania IGH V i J, aby uzyskać częstotliwości pasujących kombinacji VJ we wszystkich parach odczytu uzyskanych z sekwencjonowania na próbce. Policz parę odczytu, jeśli jest zmapowana zarówno do genu IGH V, jak i J, a następnie dodaj jego allel do odpowiedniej liczby dla określonej kombinacji VJ.</li>
	<li>Uszereguj liczby dla każdego ponownie połączonego regionu VDJ uzyskanego z 3.1.2 od najwyższego do najniższego. Region VDJ ma największą liczbę odczytów, jest definiowany jako główna kombinacja przegrupowania.</li>
	<li>Odrzuć wyrównane sekwencje, które pokrywają mniej niż 35% głównego przegrupowania domeny określonego w 3.1.3.</li>
</ol>
3.2) Identyfikacja profilu SHM
<ol>
	<li>Policz wszystkie wzorce SHM w odczytach z kroku 3.1.3. Zdefiniuj każdy wzorzec SHM jako subklon.</li>
	<li>Policz liczbę subklonów, które odpowiadają różnym unikalnym wzorcom SHM, oraz liczbę odczytów, które są mapowane na poszczególne subklony.</li>
</ol>
3.3) Graficzne przedstawienie wyników
<ol>
	<li>Przeprowadzić analizę filogenetyczną na subklonach przy użyciu odpowiadających im wzorców SHM, stosując metodę łączenia sąsiedztwa z pakietu R "małpa" zgodnie z protokołem producenta. Oblicz macierz odległości od indywidualnych odrębnych dopasowań, aby odtworzyć filogenezę subklonów zakorzenioną w sekwencji linii zarodkowej danej kombinacji VJ dla każdego sparowanego zestawu próbek.</li>
	<li>Użyj sekwencji nukleotydowej każdego subklonu jako wektora znakowego i oblicz przybliżoną odległość struny między wszystkimi subklonami w głównym przegrupowaniu VJ zarówno dla diagnozy, jak i odpowiadających im próbek nawrotu, używając miary odległości Levenshteina, gdzie matematycznie odległość między dwoma ustawieniami jest określona przez dx,y(i,j), gdzie dx,y(i, j) = 1 jeśli ≠ j i 0 w przeciwnym razie, a następnie zsumuj tę funkcję na długości ciągu odpowiadającego sekwencjom nukleotydów i i j.</li>
	<li>Przedstawiono graficznie wynikową macierz odległości podklonów i odpowiadającą im liczbę podklonów na następujące dwa sposoby:
	<ol>
		<li>Użyj pakietu R "MASS" zgodnie z protokołem producenta, aby zastosować skalowanie wielowymiarowe do macierzy odległości subklonów i wygenerować dwuwymiarową mapę współrzędnych zasad, która jest następnie wykreślana wraz z logarytmem zliczeń subklonalnych jako promień koła.</li>
		<li>Skonstruuj graf nieskierowany na podstawie odległości Levenshteina, gdzie wierzchołki odpowiadają każdemu odrębnemu subklonowi powstającemu w wyniku głównego przegrupowania VJ. 
		Uwaga: Jeśli odległość między dwoma różnymi klonami jest równa jeden, oznacza to, że istnieje krawędź między tymi dwoma wierzchołkami. Jeśli odległość jest większa niż jeden, oznacza to, że nie ma łączącej ich krawędzi.</li>
		<li>Wykreśl wykres 3.3.3.2 za pomocą funkcji tkplot w pakiecie R "iGraph" z układem Kamada Kawai zgodnie z protokołem producenta. Promień wierzchołków jest proporcjonalny do sześciennego pierwiastka całkowitej liczby zmapowanych do niego klonów, a cieniowanie wykorzystuje czerwony i niebieski zakres do oznaczenia proporcji klonów, które należą do diagnozy (niebieski) lub nawrotu (czerwony).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3.4) Pomiar niejednorodności (entropii)
<ol>
	<li>Zbadaj liczby i liczbę subklonów poszczególnych wzorców hipermutacji somatycznych występujących w głównym przegrupowaniu VJ dla każdego sparowanego zestawu próbek.</li>
	<li>Oblicz entropię empiryczną i resztkową entropię empiryczną skorygowaną o liczbę odrębnych klonów w każdej próbce, korzystając ze standardowego oszacowania entropii opartej na histogramie.</li>
</ol>

<ol><li>Nowell, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+evolution+of+tumor+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The clonal evolution of tumor cell populations.</a> Science. 194 (4260), 23-28 (1976).</li>
<li>Greaves, M., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in cancer.</a> Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).</li>
<li>Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+clonal+evolution+of+tumors+from+single+nucleotide+somatic+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations.</a> BMC bioinformatics. 15, 35(2014).</li>
<li>Schatz, D. G., Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+centres+and+the+orchestration+of+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+immunology%22%5BJournal%5D)">Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination.</a> Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).</li>
<li>Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraclonal+generation+of+antibody+mutants+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres.</a> Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).</li>
<li>Coiffier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOP+chemotherapy+plus+rituximab+compared+with+CHOP+alone+in+elderly+patients+with+diffuse+large-B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).</li>
<li>Larouche, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+recurrence+5+years+or+later+following+diffuse+large+B-cell+lymphoma%3A+clinical+characteristics+and+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome.</a> J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).</li>
<li>Friedberg, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapsed%2Frefractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).</li>
<li>Gisselbrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salvage+regimens+with+autologous+transplantation+for+relapsed+large+B-cell+lymphoma+in+the+rituximab+era%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era.</a> J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).</li>
<li>Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2C+the+International+ImMunoGeneTics+Information+System+for+Immunoinformatics+%3A+methods+for+querying+IMGT+databases%2C+tools%2C+and+web+resources+in+the+context+of+immunoinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics.</a> Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+reveals+clonal+evolution+patterns+and+mutation+events+associated+with+relapse+in+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas.</a> Genome biology. 15 (8), 432(2014).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+terminally+differentiated+mature+B+lymphocytes+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency.</a> Cell. 133 (2), 250-264 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Ze względu na prawie nieograniczoną liczbę iteracji informacji o sekwencji kodowanych przez rearanżację VDJ i SHM w locus IGH ludzkich komórek B, badanie całego repertuaru IGH za pomocą wysokoprzepustowego głębokiego sekwencjonowania okazało się skutecznym i kompleksowym sposobem wyznaczania populacji klonalnych i subklonalnych komórek B. Co więcej, strategia ta może być wykorzystana do badania ścieżki ewolucji klonalnej rozwoju, remisji i nawrotu guza z komórek B poprzez porównanie architektury klonalnej i subklonalnej ...

Rak jest chorobą klonalną. Od czasu trzydziestu lat temu, kiedy Peter C. Nowell zaproponował model ewolucji klonalnejraka 1, wiele badań próbowało przeanalizować populacje klonów w próbkach guza i zrekonstruować wzorce ekspansji klonalnej i ewolucji, które leżą u podstaw procesu nowotworzenia. Ostatnio sekwencjonowanie całego genomu umożliwiło badaczom dogłębne przyjrzenie się heterogeniczności i ewolucji klonów3,4. Jednak ze względu na brak podatnych markerów w wielu typach komórek, trudno jest wywnioskować dokładną architekturę klonalną i ścieżkę ewolucyjną. Na szczęście w dojrzałych komórkach B istnieje naturalny marker klonalności, z którego wywodzi się wiele nowotworów układu chłonnego, w tym DLBCL. W odpowiedzi na stymulację antygenową każda komórka B może utworzyć pojedynczą produktywną sekwencję IgH VDJ, łącząc ze sobą segment VH (zmienna), D (różnorodność) i JH (łączący) z dużej puli tych segmentów. Podczas tego procesu małe fragmenty oryginalnej sekwencji mogą zostać usunięte, a dodatkowe nukleotydy nieszablonowe mogą zostać dodane w celu stworzenia unikalnego przegrupowania VDJ. Ta specyficzna rearanżacja VDJ może być dziedziczona u całego potomstwa tej komórki B, znakując w ten sposób pojedynczą dojrzałą komórkę B i jej potomstwo5. Ponadto SHM występuje na rekombinowanych sekwencjach VDJ w późniejszej reakcji centrum rozrodczego (GC) w celu wprowadzenia dodatkowych mutacji w celu rozszerzenia puli przeciwciał i zwiększenia powinowactwa przeciwciał6. W związku z tym, porównując i kontrastując wzorce VDJ i SHM próbek chłoniaka, które przeszły te procesy, można określić niejednorodność wewnątrz guza i wywnioskować klonalną ścieżkę ewolucji choroby.
Poprzednio, przegrupowanie VDJ i SHM można było zidentyfikować za pomocą PCR wzmacniającego rekombinowane regiony, klonowania produktów PCR, a następnie sekwencjonowania Sanger w celu uzyskania informacji o sekwencji. Takie podejście charakteryzuje się niską przepustowością i niską wydajnością, pobierając tylko bardzo małą część całego rekombinowanego repertuaru VDJ i utrudniając scharakteryzowanie ogólnej reprezentacji populacji klonów w danej próbce. Stworzono zmodyfikowane podejście, generując biblioteki sekwencjonowania indeksowanego NGS z produktów VDJ PCR i wykonując sekwencjonowanie PE 2x150 bp w celu uzyskania ponad pół miliona rekombinowanych sekwencji VDJ na próbkę. Ponadto opracowano niestandardowy potok do przeprowadzania kontroli jakości (QC), wyrównywania, filtrowania odczytów sekwencjonowania VDJ w celu identyfikacji przegrupowań i SHM każdego odczytu oraz przeprowadzania analizy filogenetycznej architektury klonalnej każdej próbki. Ponadto opracowano nowe podejście w celu dokładniejszego scharakteryzowania wzorców ewolucji klonów dla próbek pobranych na różnych etapach choroby.
Zastosowaliśmy tę technikę do próbek pacjentów DLBCL. DLBCL jest agresywną postacią chłoniaka nieziarniczego z częstym nawrotem nawet u jednej trzeciej pacjentów7. Nawroty DLBCL zwykle występują wcześnie, w ciągu 2 do 3 lat od wstępnej diagnozy, chociaż niektóre występują po 5 latach8. Rokowanie u pacjentów z nawrotem choroby jest złe, tylko 10% z nich osiąga 3-letnie przeżycie wolne od progresji choroby z powodu ograniczonych możliwości leczenia. Stanowi to podstawę pilnej potrzeby opracowania nowatorskich metod leczenia nawrotu DLBCL9,10. Jednak mechanizmy molekularne związane z nawrotem DLBCL są nadal w dużej mierze nieznane. W szczególności rola heterogeniczności klonalnej w diagnozie i ewolucji klonalnej podczas rozwoju nawrotu DLBCL jest obecnie niescharakteryzowana, co utrudnia zdefiniowanie dokładnego i użytecznego biomarkera do przewidywania nawrotu. Aby odpowiedzieć na te pytania, zastosowaliśmy nasze podejście sekwencjonowania VDJ na wielu parach dopasowanych par próbek DLBCL z pierwotną diagnozą i nawrotem. Dwa odrębne klonalne scenariusze ewolucyjne nawrotu wyłoniły się z porównania architektur klonalnych między diagnozą a próbkami nawrotu, co sugeruje, że wiele mechanizmów molekularnych może być zaangażowanych w nawrót DLBCL.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td>200 proof, do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris&middot; Cl, pH 8,0; 10 mM</td></tr><tr><td>EDTA Ksyleny</td><td>VWR</td><td>EM-XX0055-6</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Proteinaza K&nbsp;</td><td>Life Technonogies</td><td>25530-015</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Mieszanina roztworów trifosforanu deoksynukleotydu (dNTP)</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>10 mM każdy nukleotyd</td></tr><tr><td>10x bufor PCR&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11699105001</td><td>bez MgCl2</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold DNA Polymeraza z buforem złota i technologami MgCl2</td><td>Life</td><td>4311806</td><td>50 i mikro; l przy 5 U/&mikro; l</td></tr><tr><td>Drabina do kontroli próbek</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>2-096-0020</td><td>33 reakcje</td></tr><tr><td>Test hipermutacji somatycznych IGH v2.0 - Wykrywanie żelu</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>5-101-0030</td><td>33 reakcje, Mix 2 do wykrywania IGVHFR1</td></tr><tr><td>Test klonalności genu IGH - Detekcja żelu</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>1-101-0020</td><td>33 reakcje, Probówka B do wykrywania IGVHFR2</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>20 &micro; l przy 5 U/&mikro; l</td></tr><tr><td>10X Bufor Tris-Borate-EDTA (TBE)</td><td>Corning (cellgro)</td><td>46-011-CM</td><td>6x1 L</td></tr><tr><td>50x BUFOR TAE&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>101414-298</td><td>1 l</td></tr><tr><td>roztwór bromku etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>25 pz DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10597011</td><td>1 i mikro; g/&mikro; l</td></tr><tr><td>100 pz Drabina DNA Technologie</td><td>życia</td><td>15628-019</td><td>1 i mikro; g/&mikro; l</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>40% roztwór akrylamidu/Bis</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td>1610144 500 ml</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick Qiagen</td><td></td><td>28704</td><td>50 kolumn</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania wysokiej czułości Qubit dsDNA</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizator</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometr</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do ponownego zawieszania (Zestaw do przygotowania próbki DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka naprawcza końca (Zestaw do przygotowania próbki DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka ogonowa A (Zestaw do przygotowania próbki DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka do ligacji (Zestaw do przygotowania próbki DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Indeks adaptera DNA (Zestaw do przygotowania próbki DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do ligacji zatrzymaj (Zestaw do przygotowania próbki DNA Illumina TruSeq v2)</td> <td>Koktajl startera Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR (Zestaw do przygotowania próbki DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka główna PCR (Zestaw do przygotowania próbki DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Life Technologies</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania żelowego</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>170-8370</td><td></td></tr></tbody></table>

vdj-seq: analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek b

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Zrozumienie klonalności guza jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów związanych z nowotworzeniem i postępem choroby. Ponadto zrozumienie zmian składu klonalnego, które zachodzą w guzie w odpowiedzi na określone mikrośrodowisko lub leczenie, może prowadzić do zaprojektowania bardziej wyrafinowanych i skutecznych podejść do eliminowania komórek nowotworowych. Jednak śledzenie subpopulacji klonów nowotworów było trudne ze względu na brak rozróżnialnych markerów. Aby rozwiązać ten problem, stworzono protokół VDJ-seq w celu śledzenia wzorców ewolucji klonalnej nawrotu chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBCL) poprzez wykorzystanie rekombinacji VDJ i hipermutacji somatycznej (SHM), dwóch unikalnych cech chłoniaków z komórek B.
W tym protokole, biblioteki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) z potencjałem indeksowania zostały zbudowane z amplifikowanego, przegrupowanego regionu VDJ łańcucha ciężkiego immunoglobuliny (IgH) z par próbek DLBCL z pierwotnej diagnozy i nawrotu. Średnio po sekwencjonowaniu uzyskano ponad pół miliona sekwencji VDJ na próbkę, które zawierają zarówno przegrupowanie VDJ, jak i informacje SHM. Ponadto opracowano niestandardowe potoki bioinformatyczne, aby w pełni wykorzystać informacje o sekwencji do charakterystyki repertuaru IgH-VDJ w tych próbkach. Ponadto proces ten umożliwia rekonstrukcję i porównanie architektury klonalnej poszczególnych nowotworów, co umożliwia badanie heterogeniczności klonalnej w obrębie diagnozy guzów i dedukcję wzorców ewolucji klonalnej między parami guzów w wyniku diagnozy i nawrotu. Stosując tę analizę do kilku par diagnoza-nawrót, odkryliśmy kluczowe dowody na to, że wiele charakterystycznych wzorców ewolucyjnych guza może prowadzić do nawrotu DLBCL. Ponadto podejście to można rozszerzyć na inne aspekty kliniczne, takie jak identyfikacja minimalnej choroby resztkowej, monitorowanie postępu nawrotu i odpowiedzi na leczenie oraz badanie repertuaru immunologicznego w kontekstach innych niż chłoniaki.

Całkowita procedura sekwencjonowania VDJ (VDJ-seq), obejmująca ekstrakcję DNA, amplifikację i oczyszczanie rekombinowanych regionów VDJ, konstrukcję biblioteki sekwencyjnej, przetwarzanie odczytów oraz analizę filogenetyczną, została przedstawiona na Rysunku 1. Rutynowo z zamrożonych przekrojów tkanki stałej można odzyskać 5-200 μg DNA, natomiast z przekrojów tkanki utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie 0,5-20 μg DNA. W zależności od jakości, wzorca rearanżacji i stopnia SHM poszczególnych pró...

Ten protokół opisuje podejście do badania rekombinowanych regionów VDJ łańcucha ciężkiego immunoglobuliny chłoniaków poprzez głębokie sekwencjonowanie i odzyskanie rearanżacji VDJ i statusu hipermutacji somatycznej w celu nakreślenia klonalnej architektury pojedynczego guza. Porównanie architektury klonalnej między sparowaną diagnozą a próbkami nawrotu chłoniaka ujawnia tryby ewolucji klonalnej nawrotu chłoniaka.

VDJ-Seq: Analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek B

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka składu klonalnego próbek chłoniaka w celu identyfikacji wzorców ewolucji klonalnej w nawrotach chłoniaka. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chłoniaków, takie jak sposób powstania nawrotowych guzów z guzów pierwotnych. Główną zaletą tego protokołu jest dostosowanie najnowszej technologii sekwencjonowania wysokoprzepustowego, co pozwala na bardziej kompleksowe mapowanie wspólnych cech chłoniaków.W niniejszym protokole DNA zostanie wyekstrahowane z cienkich skrawków tkanek prawidłowych lub nowotworowych, zamrożonych w OCT oraz utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, w celu uzyskania DNA z tkanek zamrożonych w OCT. Najpierw należy poddać trawieniu od 10 do 30 cienkich skrawków w czterech mililitrach buforu do lizy kwasów nukleowych z proteinazą K i 0,625% SDS w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia do mieszaniny trawiennej należy dodać jeden mililitr nasyconego 5 M chlorku sodu i energicznie wstrząsać przez 15 sekund, a następnie odwirować przy 1 100 ×g przez 15 minut.W temperaturze pokojowej przenieś nadsącz do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Doda

vdj-seq-deep-sequencing-analysis-rearranged-immunoglobulin-heavy

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-DNA FISH).

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

Synteza ludzkich przeciwciał monoklonalnych jest pierwszym krokiem w badaniach mających na celu rozwikłanie patofizjologicznych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem autoprzeciwciał. Opracowaliśmy protokół wytwarzania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych ludzkiej immunoglobuliny G (IgG) z komórek B posortowanych krwią, w tym izolację komórek B, klonowanie przeciwciał i syntezę in vitro.

Wytwarzanie rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG z unieśmiertelnionych sortowanych komórek B

Tutaj opisujemy połączone sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej i protokół budowy biblioteki nowej generacji o niskim wkładzie przeznaczony do generowania wysokiej jakości danych o całym eksomie z komórek Hodgkina Reeda-Sternberga (HRS) klasycznego chłoniaka Hodgkina (CHL).

Sortowanie przepływowe i sekwencjonowanie egzomu komórek Reeda-Sternberga klasycznego chłoniaka Hodgkina

Niniejszym przedstawiamy protokół, który szczegółowo opisuje aspekty techniczne i zasadnicze wymagania w celu zapewnienia solidnej analizy sekwencji genów IG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL), w oparciu o zgromadzone doświadczenie Europejskiej Inicjatywy Badawczej nad PBL (ERIC).

Analiza sekwencji genów immunoglobulin w przewlekłej białaczce limfocytowej: od materiału pacjenta do interpretacji sekwencji

Tutaj opisujemy protokoły analizy i wizualizacji struktury i budowy całego repertuaru przeciwciał. Wiąże się to z pozyskiwaniem ogromnych sekwencji RNA przeciwciał za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.

Identyfikacja repertuaru przeciwciał mysich i ludzkich za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Prezentowany tutaj jest test do ilościowego określenia hipermutacji somatycznej w locus genu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny przy użyciu komórek B centrum zarodkowego z mysich plastrów Peyera.

Analiza hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera

Obecny protokół opisuje metodę izolacji DNA z próbek krwi i biopsji jelitowych, generowania bibliotek TCRβ i IGH PCR do sekwencjonowania nowej generacji, wykonywania przebiegu NGS i podstawowej analizy danych.

Analiza repertuaru immunologicznego receptorów limfocytów T i B przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji

Niniejszy film przedstawia skuteczną technikę różnicowania i preparowania poszczególnych półprzezroczystych struktur ciała szklistego ludzkiego oka w materiale pośmiertnym.

Disekcja elementów ludzkiego ciała szklistego do analizy proteomicznej

Opisano metodę propagacji ludzkich guzów siatkówczaka u myszy. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane bezpośrednio do oczu myszy z niedoborem odporności. Guzy wtórne zostały pomyślnie wywołane z wykorzystaniem zarówno komórek pobranych bezpośrednio z ludzkich guzów, jak i hodowanych tumorsfer.

Ustanowienie i propagacja guzów retinoblastomy ludzkiej u myszy z niedoborem odporności

Poznaj metodę głębokiego sekwencjonowania regionów VDJ immunoglobuliny w celu analizy architektury klonalnej chłoniaka. Technika ta ujawnia wzorce ewolucji klonalnej między diagnozą a nawrotem.

VDJ-Seq: Analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek B (Wideo) | JoVE Journal

VDJ-Seq: Analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek B

Przeglądaj więcej filmów