Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie technologii pomiaru zużycia tlenu w mikro płytkach do oceny funkcji łańcucha transportu elektronów, cyklu TCA, szlaku beta-oksydacji oraz transporterów substratowych. Cel ten jest realizowany poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności substratu i roztworów wtryskowych do analizy. W drugim kroku do uprzednio nawodnionego wkładu do analizy tric dodaje się roztwory wtryskowe w celu skalibrowania urządzenia do pomiaru zużycia tlenu.

Następnie należy przygotować roztwory substratów mitochondrialnych i wlać je do płytki do hodowli komórek. Płytkę do hodowli komórek należy odwirować, aby umożliwić przyleganie mitochondriów do dołków płytki przed wprowadzeniem jej do analizatora respirometrycznego. Wyniki uzyskane z urządzenia wykazują tempo zużycia tlenu na podstawie oddychania mitochondrialnego dla każdego pomiaru respirometrycznego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektroda Clarka, jest to, że technologie oparte na mikropłytkach umożliwiają wydajniejszy pomiar i wyższą przepustowość oznaczeń zużycia tlenu przy użyciu mniejszych ilości mitochondriów; zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności ze względu na liczbę etapów związanych z przygotowaniem roztworów do analizy. W noc poprzedzającą eksperyment należy nawodnić kartridż do testu Tric w 1 mL roztworu kalibracyjnego w inkubatorze beCO2 w temperaturze 37 °C. Następnego dnia należy wyjąć wszystkie zamrożone próbki i rozmrozić je w kąpieli wodnej lub inkubatorze w temperaturze 37 °C. Należy przygotować wszystkie roztwory substratów i roztwory do wtrysku, a następnie przechowywać je w lodzie. Kolejnym krokiem jest zaprogramowanie urządzenia do pomiaru zużycia tlenu w wielu studzienkach, ustawiając odpowiednie parametry mieszania i pomiaru.

Uruchom oprogramowanie analityczne i wybierz tryb standardowy. Wejdź do forum gościa seahorse i kliknij kreator analizy. Po wejściu do kreatora analizy kliknij protokół, aby zmienić wagę mieszanki oraz parametry pomiarowe.

Oznacz dołki tła w zakładce korekcji tła (back correction) i upewnij się, że zostały zaznaczone. Przeprowadź korekcję tła. Oznacz warunki, klikając najpierw w zakładkę grup i etykiet (groups and labels), a następnie w zakładkę informacji o grupach (group info).

Po wprowadzeniu tych parametrów kliknij end, a następnie save template. Aby rozpocząć tę procedurę, wprowadź roztwory wtryskowe do kartridża do analizy. Należy upewnić się, że roztwory zostaną wstrzyknięte do odpowiednich portów.

Włóż kartridż do analizy do urządzenia, tak aby narożnik z wcięciem znajdował się w lewym dolnym rogu. Rozpocznij kalibrację, najpierw uruchamiając oprogramowanie analityczne, a następnie przechodząc w tryb standardowy. Zaloguj się do forum gościa seahorse.

Otwórz zapisany szablon na dysku XF w zakładce szablonów. Po otwarciu kliknij start, aby rozpocząć kalibrację, która potrwa około 30 minut. Mitochondria do tej procedury zostały wyizolowane z czerwonego mięśnia szkieletowego; delikatnie, lecz dokładnie wymieszaj roztwór treści substratowej mitochondriów, mieszając roztwór za pomocą końcówki pipety 200 µL, której odcięto około 3 mm końcówki.

Po określeniu stężenia białka w zapasie mitochondriów, resuspendować 10 µg białka mitochondrialnego w 200 µL mieszaniny substratów dla bursztynianu. Delikatnie, lecz dokładnie wymieszać roztwór mitochondriów z substratem, mieszając go powoli końcówką pipety o pojemności 200 µL, z której odcięto około 3 mm końcówki w ten sam sposób. Powtórzyć czynność, resuspendując 14 µg białka mitochondrialnego w 200 µL każdej z pozostałych mieszanin substratów. Wszystkie mieszaniny białka mitochondrialnego z substratami umieścić w lodzie.

Umieść 24-dołkową płytkę hodowlaną na lodzie i w trzech powtórzeniach nanieś do każdego dołka po 50 µL każdej z mieszanin substratów dla mitochondriów. Twórcy testu TRIC w formacie mikropłytkowym zalecają pozostawienie co najmniej dwóch pustych dołków bez mitochondriów, najlepiej po obu stronach płytki hodowlanej. Wiruj płytkę hodowlaną z prędkością 2000 G przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby podczas wirowania mitochondria przywarły do dołków.

Podgrzej roztwory substratów w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po zakończeniu wirowania ostrożnie nanieś 450 µL każdego roztworu substratu na odpowiednie doległości. Napełnianie płytki powinno odbywać się w temperaturze pokojowej.

Napełnij puste studzienki 500 µL blanku podłoża. Studzienki przeznaczone do analizy przepływu elektronów należy napełnić podłożem do analizy przepływu elektronów, natomiast puste studzienki do analizy sprzężonej można napełnić dowolnym podłożem do analizy sprzężonej. Po dodaniu 450 µL podłoża do każdej studzienki, obejrzyj warstwę mitochondriów w studzience przy 20-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że mitochondria są równomiernie rozproszone w pojedynczej monowarstwie.

Jak pokazano w tym przykładzie, dołki obrazowe, w których monowarstwa nie wydaje się być równomiernie rozłożona, można usunąć po etapie oc. Po potwierdzeniu adhezji mitochondriów, przenieś płytkę hodowlaną do urządzenia do analizy Respir metric. Kliknij OK.

Urządzenie wysunie płytkę pomocniczą, która została wcześniej użyta do kalibracji. Należy wyjąć płytkę pomocniczą i umieścić na tacy płytkę do hodowli komórek zawierającą mitochondria. Niebieska wcięcie na płytce do hodowli komórek powinno znajdować się w lewym dolnym rogu tacy.

Kliknij kontynuuj, aby rozpocząć analizę, która trwa około 40 minut. Po zakończeniu procesu naciśnij na ekranie przycisk wysuń, aby wysunąć płytkę hodowlaną. Po wysunięciu płytki wyjmij i zutylizuj płytkę hodowlaną oraz kartridż.

Naciśnij przycisk kontynuuj na ekranie. Pomiary zostaną automatycznie zapisane jako plik XLS w folderze danych. Otwórz ten plik i zmień wyświetlanie z O2 na OCR, klikając strzałkę w dół pod znacznikiem Y1.

Następnie w opcjach wyświetlania danych o szybkości zmień punkt środkowy na szybkości punkt-punkt. Kliknij OK. Aby zastosować te zmiany, kliknij kartę trybu grupowania studzienek w lewym dolnym rogu ekranu, aby pogrupować studzienki o podobnych warunkach.

Na koniec kliknij kartę sample mean standard error znajdującą się w środkowej części ekranu po lewej stronie. Polecenia te można było skonfigurować również przed analizą. Wykresy te przedstawiają tempo zużycia tlenu lub OCR w funkcji czasu dla czterech analiz sprzęgania.

Pierwszy panel przedstawia stan dwa, czyli oddychanie w obecności substratu, ale w braku ADP. Drugi panel po wstrzyknięciu ADP przedstawia maksymalne oddychanie sprzężone, nazywane również oddychaniem w stanie trzy. Trzeci panel po wstrzyknięciu oligomycyny A przedstawia oddychanie wynikające z przecieku protonów, nazywane również oddychaniem w stanie cztery o.

Czwarty panel po wstrzyknięciu FCCP przedstawia maksymalną respirację rozsprzęgoną, nazywaną również respiracją stanu trzy U. Piąty panel po wstrzyknięciu antymycyny A przedstawia zahamowanie respiracji oksydacyjnej. Wszystkie stany mitochondrialne charakteryzują się minimalnym odchyleniem standardowym dzięki dokładnemu wymieszaniu zapasu mitochondriów oraz mieszanin substratów mitochondrialnych, a także uzyskaniu pojedynczej warstwy mitochondriów po wirowaniu w celu adhezji.

W przeciwieństwie do tego, naniesienie nierównej ilości mitochondriów do każdej studni i nieuzyskanie pojedynczej warstwy mitochondriów prowadzi do zwiększonego odchylenia standardowego w każdym stanie, co wskazuje niebieska krzywa, wykazująca wartości OCR powyżej 1 500 ole na minutę, a także spadające tempo oddychania w trakcie okresu pomiarowego, czego przykładem jest spadek wartości tempa między poszczególnymi punktami pomiarowymi. Należy zauważyć, że czerwona krzywa wykazuje spójne tempo między punktami pomiarowymi, a maksymalne wartości OCR są niższe niż 1 500 ole na minutę. Przeładowanie białkiem mitochondrialnym może również prowadzić do wyczerpania tlenu w mikrokomorze studni, co uniemożliwia dokładny pomiar OCR przy każdym kolejnym pomiarze, na co wskazuje niebieska krzywa, wykazująca wartości O2 zbliżające się do zera w trakcie okresu pomiarowego, a także znacznie obniżone początkowe wartości O2 po każdym kolejnym pomiarze.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować cierpliwość podczas mieszania mitochondriów i roztworów substratowych. Po opanowaniu tych metod można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty w celu odpowiedzi na kolejne pytania, takie jak: w jaki sposób leczenie ukierunkowane na konkretny transporter substratu wpływa na mitochondrialne zużycie tlenu?