Name: Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Naucz się izolować mitochondria z mięśni szkieletowych myszy i przeprowadzać wysokoprzepustowe pomiary oddechowe na mikropłytkach. Ta metoda pozwala efektywnie badać funkcję łańcucha transportu elektronów i cyklu Krebsa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Instytut Badawczy Nauk Przyrodniczych Fralin oraz Rdzeń Fenotypowania Metabolicznego w Virginia Tech wsparły tę pracę.

UWAGA: Ten protokół rozpoczyna się po wyizolowaniu mitochondriów z czerwonych mięśni szkieletowych. Mitochondria wyizolowano, jak opisano wcześniej, z ~ 75 - 100 mg czerwonych mięśni szkieletowych13. Z tej ilości tkanki uzyska się od 5 do 10 μg / μl białka mitochondrialnego poprzez ponowne zawieszenie końcowego osadu mitochondrialnego w ≤50 μl buforu izolacyjnego dla mitochondriów (IBM) 2 (patrz Frisard i wsp. 13).
1. Konfiguracja
<ol>
	<li>Przygotować robocze roztwory podstawowe (Tabela 1) i mieszaniny roztworów do oznaczania mitochondriów (MAS) (Tabela 2) do kolejnych testów. 
	Uwaga: Większość przygotowań do testów można wykonać z wyprzedzeniem, ponieważ większość roztworów podstawowych i MAS można przechowywać.</li>
	<li>Uwodnić wkład testu respirometrycznego w 1 ml roztworu kalibracyjnego w noc poprzedzającą eksperyment w inkubatorze innym niż CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W dniu doświadczenia wyjąć zamrożone wywary (substraty i modulatory mitochondrialne, mieszaninę MAS, MAS bez BSA, tabela 1) i rozmrozić w łaźni o temperaturze 37 °C lub w inkubatorze.</li>
	<li>Przygotować wszystkie roztwory substratów (Tabela 3) i wstrzyknięcia (Tabela 4-5) i dostosować pH zgodnie z potrzebami (pH 7,4). Po dostosowaniu pH przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Zaprogramuj wielodołkową maszynę do pomiaru zużycia tlenu, aby prawidłowo mieszała, czekała i mierzyła parametry (patrz tabela 6) i oznacz tło oraz studzienki grupowe/kondycjonalne, najpierw wchodząc do oprogramowania analitycznego, a następnie w trybie "Standard".
	<ol>
		<li>Wejdź na forum "Gość" i kliknij na "Kreator testów". W "Kreatorze testów" kliknij "Protokół", aby zmienić parametry mieszania, oczekiwania i pomiaru. Oznacz studzienki tła pod "Wstecz. Korekta" i pamiętaj, aby zaznaczyć opcję "Wykonaj korektę tła".</li>
		<li>Oznacz warunki, klikając najpierw zakładkę "Grupy i etykiety", a następnie zakładkę "Informacje o grupie". Po wprowadzeniu tych parametrów kliknij "Koniec", a następnie "Zapisz szablon".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przebieg testu
<ol>
	<li>Załaduj roztwory iniekcyjne do kartridża testowego i rozpocznij kalibrację, najpierw wprowadzając oprogramowanie analityczne, a następnie przechodząc do trybu "Standardowego". Wejdź na forum "Gość". Otwórz szablon zapisany w kroku 1.5 pod dyskiem "XF", w zakładce "Szablony". Po otwarciu kliknij "Start", aby rozpocząć kalibrację. 
	Uwaga: Kaseta z testem musi być wprowadzona do maszyny z naciętym rogiem w lewym dolnym rogu. Trwa to około 30 minut. Należy uważać, aby wstrzykiwać roztwory do odpowiednich portów. Iniekcje w tabeli 4-5 są wymienione w kolejności ładowania.</li>
	<li>Delikatnie, ale dokładnie wymieszaj zapas mitochondriów, mieszając roztwór z końcówką do pipety o pojemności 200 μl, a następnie delikatnie rozcierając zapas końcówką do pipety o pojemności 200 μl, której otwór został poszerzony przez odcięcie nożyczkami ~ 3 mm od końca końcówki.</li>
	<li>Wykonaj test kwasu bicinchoninowego (BCA), aby określić stężenie białka w stadzie mitochondrialnym.</li>
	<li>Korzystając ze stężenia podstawowego uzyskanego w kroku 2.3, ponownie zawiesić 10 μg białka mitochondrialnego/200 μl mieszaniny substratów bursztynian/rotenon (Tabela 3). Zawiesić ponownie 14 μg białka mitochondrialnego/200 μl pozostałych mieszanin substratów (należy to zrobić dla każdej mieszaniny substratów) (Tabela 3). Umieść wszystkie mieszanki białek mitochondrialnych z substratem na lodzie. 
	Uwaga: Optymalna ilość białka mitochondrialnego na studzienkę dla każdego testu została określona zgodnie z wcześniejszym opisem9. Stwierdzono, że testy pirogronianu / jabłczanu, palmitoilokarnityny / jabłczanu, glutaminianu / jabłczanu i przepływu elektronów wykorzystują 3,5 μg białka mitochondrialnego, podczas gdy test bursztynianu / rotenonu wykorzystuje 2,5 μg białka mitochondrialnego na studzienkę. Dlatego badacz musi ponownie zawiesić wystarczającą ilość białka mitochondrialnego dla 4 powtórzeń na tym etapie, ponieważ na studzience ładowane jest 2,5 μg lub 3,5 μg na 50 μl (patrz krok 2.6).</li>
	<li>Wymieszaj roztwory mitochondriów/substratów delikatnie, ale dokładnie, mieszając roztwór z końcówką pipety o pojemności 200 μl, a następnie delikatnie rozcierając bulion końcówką pipety o pojemności 200 μl, której koniec został odcięty ~ 3 mm.</li>
	<li>Umieścić płytkę do hodowli komórkowej na lodzie i w trzech egzemplarzach załadować 50 μl/studzienkę każdej z mieszanin mitochondriów/substratów. Twórcy testu respirometrycznego opartego na mikropłytkach zalecają pozostawienie co najmniej dwóch ślepych (bez mitochondriów) studzienek, najlepiej po obu stronach płytki do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Obracać płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 2 000 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Podczas wirowania płytki rozgrzać roztwory podłoża w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu wirowania ostrożnie załaduj 450 μl każdego roztworu substratu na odpowiednie dołki (tj. załaduj substrat pirogronianowy/jabłczan do studzienek, w których mitochondria są początkowo ponownie zawieszone w tym roztworze substratu). Pamiętaj, aby załadować płytę w RT. Uwaga: Puste studzienki należy załadować 500 μl podłoża. Ślepe studzienki przeznaczone do oznaczania przepływu elektronów powinny być załadowane substratem przepływu elektronów (pirogronian/jabłczan + FCCP), podczas gdy sprzężone ślepe studzienki testowe mogą być załadowane dowolnym substratem do oznaczania sprzęgającego. 
	Uwaga: W przypadku wykonywania testów sprzężonych i przepływu elektronów na tej samej płytce, badacz musi ponownie przypisać studzienki tła do odpowiednich testów po zakończeniu testu za pomocą platformy "XF Reader" za pośrednictwem zakładki "Instrument". Po przejściu do ustawień "Instrument" kliknij zakładkę "Administracja", a następnie "Korekta tła". Naciśnij "Zakończ tryb konfiguracji instrumentu" po zakończeniu. Dzieje się tak, ponieważ połączenie askorbinianu/TMPD może zużywaćO2, dlatego dla każdego typu testu potrzebna jest osobna korekta tła.</li>
	<li>Po dodaniu 450 μl substratu do każdej studzienki, obejrzyj warstwę mitochondriów w studzience, aby upewnić się, że mitochondria są równomiernie rozproszone w jednej monowarstwie (20-krotne powiększenie [patrz Rogers9, ryc. 4]). Studnie, które nie wydają się mieć równomiernie rozłożonej monowarstwy, można usunąć post hoc.</li>
	<li>Po sprawdzeniu przylegania mitochondriów włóż mikropłytkę do przyrządu do testu respirometrycznego i rozpocznij test, klikając "OK". 
	Uwaga: Kalibracja z kroku 2.1 musi zostać zakończona przed rozpoczęciem biegu. Gdy badacz kliknie "OK", urządzenie wysunie tabliczkę narzędziową, która została użyta do kalibracji.
	<ol>
		<li>Wyjmij płytkę użytkową i umieść na tacy płytkę do hodowli komórkowej zawierającą mitochondria. Niebieskie nacięcie na płytce do hodowli komórkowej należy umieścić w lewym dolnym rogu tacy. Kliknij "kontynuuj", aby rozpocząć przebieg testu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu cyklu wysuń płytkę z kulturą komórkową i wkład, naciskając "Wysuń" na ekranie.
	<ol>
		<li>Po wysunięciu płytki wyjmij i wyrzuć płytkę do hodowli komórkowej i wkład, a następnie kliknij "Kontynuuj" na ekranie. Przebieg zostanie automatycznie zapisany jako plik .xls w pliku "Dane".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz ten plik i zmień wyświetlanie z "O2" na "OCR", naciskając strzałkę w dół pod znacznikiem "Y1:".
	<ol>
		<li>Następnie zmień "Punkt środkowy" na "Stawki punkt-punkt" w opcji "Dane stawki wyświetlane jako:". Kliknij "OK", aby zastosować te zmiany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij zakładkę "Tryb grupowania studni" w lewym dolnym rogu ekranu, aby pogrupować ze sobą studnie o podobnych warunkach. Na koniec kliknij kartę "Przykładowa średnia/błąd standardowy" w kierunku środka ekranu, po lewej stronie. Alternatywnie te polecenia można skonfigurować przed rozpoczęciem testu w ustawieniu "Kreator testów". 
	Uwaga: Każdy warunek będzie miał wyświetlaną średnią ± odchylenie standardowe dla każdej stawki i każdego warunku. Wykonywane są pomiary szybkości dla każdego stanu (oddychanie w stanie 2 [sprzężenie]/stanie 3u [przepływ elektronów], po którym następują cztery wstrzyknięcia). Użyć średniej szybkości stanu 2 z drugiego pomiaru, określić stan 4o w punkcie minimum po wstrzyknięciu oligomycyny, użyć punktu maksymalnego odpowiednio dla stanu 3 i stanu 3u po wstrzyknięciu ADP i FCCP oraz użyć punktu minimalnego dla oddychania indukowanego antymycyną A dla testów sprzęgających. Użyć punktu maksymalnego dla oddychania indukowanego pirumianem/jabłczanem 3u, użyć punktu minimalnego dla oddychania indukowanego rotenonem, użyć punktu maksymalnego dla oddychania indukowanego bursztynianem 3u i użyć punktu minimalnego dla oddychania indukowanego antymycyną A dla testu przepływu elektronów. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono 3 razy, a przedstawione dane są wynikami reprezentatywnego śledzenia.</li>
</ol>

<ol><li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+muscle+mitochondrial+DNA+content%2C+mitochondrial+enzyme+activity+and+oxidative+capacity+in+man%3A+alterations+with+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Applied+Physiology+and+Occupational+Physiology%22%5BJournal%5D)">Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease.</a> European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).</li>
<li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li>
<li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance%2C+metabolic+flexibility%2C+and+mitochondrial+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).</li>
<li>Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2014).</li>
<li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746(2011).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif.%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+levels+of+lipopolysaccharide+modulate+mitochondrial+oxygen+consumption+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle.</a> Metabolism. 64, 416-427 (2015).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Enzymology+and+Related+Subjects+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Mitochondrial pathways and respiratory control. Gnaiger, E. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. (2007).</li>
</ol>

George W. Rogers jest pracownikiem firmy Seahorse Bioscience, która produkuje instrument, dla którego opracowano te testy. Opłaty za otwarty dostęp zostały zapewnione przez firmę Seahorse Bioscience, będącą częścią Agilent Technologies.

Metody przedstawione w tym artykule zawierają instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu mitochondriów wyizolowanych z 75 - 100 mg mięśni szkieletowych myszy. Testy te można wykonywać z dużą precyzją, o czym świadczy ścisłe odchylenie standardowe między trzema dołkami. Co ważne, te testy respirometryczne pozwalają na określenie, gdzie mogą wystąpić nieprawidłowości i/lub adaptacje w ETC, cyklu TCA, szlaku β-utleniania, transporterach substratów itp. w powszechnie stosowanym modelu zwierzęcym.
Ważne jest, aby podkreślić uzasadnienie stosowania różnych paliw i inhibitorów stosowanych w tym protokole. Testy respirometryczne pirogronianu/jabłczanu i glutaminianu/jabłczanu pozwalają na ocenę oddychania za pośrednictwem kompleksu I, a także ocenę ich odpowiednich transporterów, a w przypadku glutaminianu deaminazy15. Alternatywnie, połączenie bursztynianu / rotenonu pozwala na ocenę mitochondrialnego strumienia oddechowego przez kompleks II ETC, ponieważ rotenon hamuje kompleks I, a bursztynian dostarcza elektrony do kompleksu II poprzez redukcję dinukleotydu flawinoadeninowego (FADH2)15. Testy te dostarczają specyficznych dla substratu informacji na temat skuteczności sprzężenia i maksymalnego oddychania. Test przepływu elektronów jest wyjątkowy, ponieważ połączenie substratów i inhibitorów pozwala na ocenę wielu kompleksów podczas mitochondrialnego przepływu oddechowego9. Początkowa mieszanina substratów pirogronian/jabłczan + FCCP pozwala na ocenę maksymalnego oddychania napędzanego przez kompleks I, podczas gdy wstrzyknięcie rotenonu, a następnie bursztynianu pozwala na ocenę maksymalnego oddychania napędzanego przez kompleks II. Wstrzyknięcie antymycyny A, inhibitora kompleksu III, a następnie wstrzyknięcie askorbinianu/TMPD pozwala na ocenę oddychania napędzanego przez kompleks IV, ponieważ askorbinian / TMPD jest donorem elektronów cytochromu C / kompleksu IV. Chociaż nie uzyskuje się żadnych informacji na temat wydajności sprzężenia, metoda ta jest idealna dla bardzo małych próbek, które wykluczają niezależne uruchamianie wielu substratów. Wreszcie, zastosowanie palmitoilokarnityny/jabłczanu palmitoilu pozwala na ocenę koordynacji między utlenianiem β a ETC, ponieważ równoważnik redukujący powstały w wyniku utleniania kwasu palmitynowego (β-oksydacji) jest wprowadzany do ETC przez flawoproteinę15 przenoszącą elektrony. Należy zauważyć, że testy sprzężenia i przepływu elektronów mogą być również stosowane w połączeniu do identyfikacji zmian w funkcji mitochondriów spowodowanych pewną interwencją (leczenie farmakologiczne, manipulacje genetyczne).
Wysoka precyzja osiągnięta w tych testach wynika przede wszystkim z dokładnego wymieszania mitochondriów, czy to przed oznaczeniem białka, czy z roztworami substratów. W związku z tym, gdy mitochondria zostaną ponownie zawieszone w roztworach substratów, ważne jest, aby dokładnie wymieszać ten roztwór przed załadowaniem płytki do hodowli komórkowej, jak opisano w kroku 2.2, z poszerzoną kryzą końcówki pipety. Brak dokładnego wymieszania mitochondriów doprowadzi do dużej zmienności w teście. Ponadto użycie końcówki pipety z wąskim otworem spowoduje powstanie sił ścinających podczas mieszania mitochondriów i zwiększy potencjał uszkodzenia błon mitochondrialnych i uwolnienia cytochromu C. Etap przestrzegania zaleceń lekarskich (2.7) jest również kluczowym krokiem w tym protokole. Nieobracanie załadowanej płytki hodowli komórkowej wystarczająco długo/szybko spowoduje niepełne przyleganie mitochondriów do dołka, prowadząc w ten sposób do zwiększonej zmienności między studzienkami a pomiarami.
Opisany protokół został zoptymalizowany tak, aby obejmował: ładowanie optymalnej ilości białka mitochondrialnego na studzienkę, stosowanie odpowiednich stężeń/metod przygotowania do sporządzania roztworów podstawowych i substratowych, zmianę przebiegu testu w celu zapewnienia plateau stanu mitochondrialnego oraz odpowiednie mieszanie zapasów mitochondrialnych i mieszanin mitochondrial/substrat. Przed tymi działaniami optymalizacyjnymi autorzy napotkali pułapki w przebiegu testu. Poniżej omówiono metody/modyfikacje rozwiązywania problemów, które były pomocne w optymalizacji tego protokołu. Jeśli chodzi o optymalne obciążenie, obciążenie zbyt małej ilości mitochondriów nie wywoła silnej odpowiedzi, podczas gdy obciążenie zbyt dużej ilości mitochondriów wyczerpie tlen w mikrokomorze i doprowadzi do niedokładnych pomiarów. Rogers i wsp.9 podają przykłady określania optymalnych ilości obciążenia mitochondriów na studzienkę dla testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Częściej zbyt dużo mitochondriów jest załadowanych na studnię, o czym świadczą wskaźniki stanu 2 powyżej 100-200 pmol/min/studnię i wskaźniki stanu 3 >1500 pmol/min/studnia. Jeśli dojdzie do przeciążenia, należy przeprowadzić eksperyment z różnym stężeniem białka mitochondrialnego (np. między 1 a 10 μg), aby wywołać OCR w zakresie dynamicznym maszyny do pomiaru zużycia tlenu. Przygotowanie i stosowanie odpowiednich stężeń substratów i materiałów ma ogromne znaczenie. Zawsze używaj kwaśnej postaci substratów/iniekcji i dostosuj pH za pomocą wodorotlenku potasu lub HCl; Nie zaleca się stosowania/roztworów sodu. Ponadto ponowne zawieszenie substratów/zapasów w DMSO lub 100% etanolu spowoduje niepowodzenie lub błąd pomiaru. Pamiętaj, aby użyć 95% etanolu tam, gdzie jest to zaznaczone. Często zdarza się, że palmitoilokarinityna wytrąca się z 95% etanolu po rozmrożeniu zamrożonego bulionu, powodując w ten sposób dużą zmienność. Pamiętaj, aby dobrze rozgrzać bulion i wir palmitoilokarnityny przed użyciem. Ponadto bardzo zmienny wynik testu pirogronianu/jabłczanu może wynikać z faktu, że materiał pirogroniany ma >2 tygodnie. Pamiętaj, aby co 2 tygodnie przerabiać zamrożone porcje pirogronianu. Test został zmodyfikowany do 2-minutowych pomiarów, aby zapewnić plateau stanu mitochondriów. Jeśli pożądana jest obserwacja wyczerpania ADP, badacz może wydłużyć czas pomiaru w zakładce "Protokół" na forum "Kreator testów". Wreszcie, duża zmienność występuje, gdy zapas mitochondriów i mitochondria oraz roztwory substratów nie są w pełni homogenizowane przed załadowaniem. Jeśli zmienność między studzienkami jest duża po przebiegu testu, należy upewnić się, że roztwór substratu został w pełni wymieszany przed następnym eksperymentem. Nigdy nie mieszaj roztworów mitochondriów/substratów, a raczej mieszaj, rozcieraj i delikatnie rozcieraj końcówką pipety z poszerzonym otworem.
Istnieją pewne ograniczenia tej techniki, na które warto zwrócić uwagę. Po pierwsze, liczba studzienek na płytce do hodowli komórkowej używanej do tych testów jest stosunkowo niska (tj. 24 studzienki i co najmniej 2 przeznaczone dla studzienek ślepych). Jeśli pożądane jest wykonanie wszystkich 5 tych testów na jednej płytce, badacz jest w stanie zbadać odpowiedzi tylko jednej myszy na raz. Należy jednak zauważyć, że dostępnych jest 96 instrumentów wiertniczych o większej przepustowości. Po drugie, istnieją nieodłączne mocne i słabe strony w ocenie dysfunkcji mitochondriów w izolowanych mitochondriach w porównaniu z nienaruszonymi komórkami1. Niektóre słabości obejmują mniejsze znaczenie fizjologiczne w porównaniu z nienaruszonymi komórkami i wywoływanie artefaktów w procesie izolacji. Wreszcie, sukces tej metody zależy od jakości procesu izolacji mitochondriów.
Chociaż niektóre z tych testów zostały albo opracowane w różnych systemach, albo zostały zwalidowane w innych modelach zwierzęcych, metody przedstawione w niniejszym dokumencie są pierwszymi, które zsyntetyzowały wszystkie wyżej wymienione testy w celu optymalnego wykorzystania w wielostudziennej maszynie do pomiaru zużycia tlenu przy użyciu mięśni szkieletowych myszy. Co ważne, wszystkie 5 z tych testów można wykonać z ilością mitochondriów wyizolowanych z ~75 - 100 mg mięśni szkieletowych myszy, zapewniając w ten sposób wysoką przepustowość przy minimalnym materiale. Ogromne znaczenie ma zdolność technologii wielodołkowego zużycia tlenu do wykonywania testów z minimalną ilością mitochondriów, w połączeniu ze zoptymalizowaną metodą izolacji, pozwala badaczowi na wykonanie wielu innych eksperymentów na pozostałej tkance mięśni szkieletowych (np. zachodnie plamy, RT-PCR, testy enzymatyczne itp.), co często stanowi wyzwanie dla tego modelu zwierzęcego.
Podsumowując, przedstawione w niniejszym dokumencie metody zawierają instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Co ważne, przedstawione metody wymagają minimalnej ilości tkanek i mitochondriów. Po opanowaniu, opisane tutaj techniki pozwolą naukowcom określić potencjalny mechanizm wpływu związku lub produktu genu na mitochondrialne zużycie tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Główną fizjologiczną rolą mitochondriów mięśni szkieletowych jest wytwarzanie ATP z fosforylacji oksydacyjnej1. Co ważne, mitochondria mięśni szkieletowych odgrywają szczególną rolę w zdolności wysiłkowej2, starzeniusię3, chorobie zwyrodnieniowej4 i cukrzycy typu II5. W związku ze starzeniem się społeczeństwa, w którym cukrzyca typu II jest siódmąnajczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych6, zapotrzebowanie na metody oceny funkcji mitochondriów staje się coraz bardziej powszechne w badaniach biomedycznych7,8. W szczególności pomiar zużycia tlenu ma wyjątkową przydatność w ocenie funkcji mitochondriów, ponieważ reprezentuje skoordynowaną funkcję między genomami mitochondrialnymi i jądrowymi w celu ekspresji funkcjonalnych składników fosforylacji oksydacyjnej9.
Istnieje kilka technologii, które umożliwiają pomiar zużycia tlenu w nienaruszonych komórkach i izolowanych mitochondriach7-10. Ponadto opracowano testy dla wielu typów komórek i tkanek oraz dla różnych gatunków, które pozwalają na pomiar szlaków mitochondrialnych i kontrolę oddechu9,11,12. Jednak obecnie istnieje luka w literaturze w odniesieniu do kompilacji wszystkich tych testów z wykorzystaniem izolowanych mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do stosowania w technologiach zużycia tlenu opartych na mikropłytkach. Co ważne, stosowanie testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach jest coraz częstsze wśród biologów mitochondrialnych i pozwala na pomiary o wysokiej przepustowości przy użyciu minimalnych ilości izolowanych mitochondriów9. W związku z tym opracowano zbiór testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach, które pozwalają na określenie, gdzie w łańcuchu transportu elektronów (ETC) mogą występować nieprawidłowości i/lub adaptacje. Ponadto opracowano dwa dodatkowe testy respirometryczne oparte na mikropłytkach, które umożliwiają ocenę koordynacji między cyklem kwasu trikarboksylowego (TCA) a ETC oraz między ß-oksydacją a ETC. Co ważne, przedstawione metody zapewniają jasny i zwięzły sposób pomiaru mechanistycznych zmian funkcji mitochondriów w powszechnie stosowanym modelu zwierzęcym.

<table><tbody><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy, minimum 99,0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu, odczynnik ACS, 99,0-102,0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>HEPES minimum 99,5% miareczkowania</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>Zasadniczo tłusty&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>Sklep pod adresem 4 & deg; Bez kwasu C</td></tr> - Kwas pirogronowy <tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 98%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Kwas bursztynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>L(-) Kwas jabłkowy, BioXtra, &ge; 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;,N&-Tetramethyl-p-phenylenodiamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>99%, proszek [TMPD]</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Chlorek palmitylo-L-karnityny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>Przechowywać w -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Oligomycyna A, &ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Cyjanek karbonylu 4-(trifluorometoksy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Przechowywać w temperaturze 2 - 8 stopni; C</td></tr><tr><td>fenylohydrazon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge; 98% (TLC), proszek [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antymycyna A z Streptomyces sp.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Sklep pod adresem -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Sól monopotasowa adenozyno-5&prime;-difosforanu odwadniająca [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Zestaw do oznaczania białek BCA&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Nie dotyczy</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Mitochondria mięśni szkieletowych odgrywają szczególną rolę w wielu patologiach chorobowych. W związku z tym pomiar zużycia tlenu jako wskaźnika funkcji mitochondriów w tej tkance stał się bardziej powszechny. Chociaż istnieje wiele technologii i testów, które mierzą mitochondrialne szlaki oddechowe w różnych komórkach, tkankach i gatunkach, obecnie istnieje luka w literaturze dotyczącej kompilacji tych testów przy użyciu wyizolowanych mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do stosowania w technologiach opartych na mikropłytkach. Co ważne, stosowanie testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach rośnie wśród biologów mitochondrialnych, ponieważ pozwala to na pomiary o wysokiej przepustowości przy użyciu minimalnych ilości izolowanych mitochondriów. W związku z tym opracowano zbiór testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach, które są w stanie ocenić mechanistyczne zmiany/adaptacje w zużyciu tlenu w powszechnie stosowanym modelu zwierzęcym. Przedstawione w niniejszym dokumencie metody zawierają instrukcje krok po kroku, jak wykonać te testy z optymalną ilością białka mitochondrialnego i odczynników oraz z wysoką precyzją, o czym świadczy minimalna wariancja w zakresie dynamicznym każdego testu.

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie technologii pomiaru zużycia tlenu w mikro płytkach do oceny funkcji łańcucha transportu elektronów, cyklu TCA, szlaku beta-oksydacji oraz transporterów substratowych. Cel ten jest realizowany poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności substratu i roztworów wtryskowych do analizy. W drugim kroku do uprzednio nawodnionego wkładu do analizy tric dodaje się roztwory wtryskowe w celu skalibrowania urządzenia do pomiaru zużycia tlenu.Następnie należy przygotować roztwory substratów mitochondrialnych i wlać je do płytki do hodowli komórek. Płytkę do hodowli komórek należy odwirować, aby umożliwić przyleganie mitochondriów do dołków płytki przed wprowadzeniem jej do analizatora respirometrycznego. Wyniki uzyskane z urządzenia wykazują tempo zużycia tlenu na podstawie oddychania mitochondrialnego dla każdego pomiaru respirometrycznego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektroda Clarka, jest to, że technologie oparte na mikropłytkach umożliwiają wydajniejszy pomiar i wyższą przepustowość oznaczeń zużycia tlenu przy użyciu mniejszych ilości mitochondriów; zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności ze względu na liczbę etapów związanych z przygotowaniem roztworów do analizy. W noc poprzedzającą eksperyment należy nawodnić kartridż do testu Tric w 1 mL roztworu kalibracyjnego w inkubatorze beCO2 w temperaturze 37 °C. Następnego dnia należy wyjąć wszystkie zamrożone próbki i rozmrozić je w kąpieli wodnej lub inkubatorze w temperaturze 37 °C. Należy przygotować wszystkie roztwory substratów i roztwory do wtrysku, a następnie przechowywać je w lodzie. Kolejnym krokiem jest zaprogramowanie urządzenia do pomiaru zużycia tlenu w wielu studzienkach, ustawiając odpowiednie parametry mieszania i pomiaru.Uruchom oprogramowanie analityczne i wybierz tryb standardowy. Wejdź do forum gościa seahorse i kliknij kreator analizy. Po wejściu do kreatora analizy kliknij protokół, aby zmienić wagę mieszanki oraz parametry pomiarowe.Oznacz dołki tła w zakładce korekcji tła (back correction) i upewnij się, że zostały zaznaczone. Przeprowadź korekcję tła. Oznacz warunki, klikając najpierw w zakładkę grup i etykiet (groups and labels), a następnie w zakładkę informacji o grupach (group info).Po wprowadzeniu tych parametrów kliknij end, a następnie save template. Aby rozpocząć tę procedurę, wprowadź roztwory wtryskowe do kartridża do analizy. Należy upewnić się, że roztwory zostaną wstrzyknięte do odpowiednich portów.Włóż kartridż do analizy do urządzenia, tak aby narożnik z wcięciem znajdował się w lewym dolnym rogu. Rozpocznij kalibrację, najpierw uruchamiając oprogramowanie analityczne, a następnie przechodząc w tryb standardowy. Zaloguj się do forum gościa seahorse.Otwórz zapisany szablon na dysku XF w zakładce szablonów. Po otwarciu kliknij start, aby rozpocząć kalibrację, która potrwa około 30 minut. Mitochondria do tej procedury zostały wyizolowane z czerwonego mięśnia szkieletowego; delikatnie, lecz dokładnie wymieszaj roztwór treści substratowej mitochondriów, mieszając roztwór za pomocą końcówki pipety 200 µL, której odcięto około 3 mm końcówki.Po określeniu stężenia białka w zapasie mitochondriów, resuspendować 10 µg białka mitochondrialnego w 200 µL mieszaniny substratów dla bursztynianu. Delikatnie, lecz dokładnie wymieszać roztwór mitochondriów z substratem, mieszając go powoli końcówką pipety o pojemności 200 µL, z której odcięto około 3 mm końcówki w ten sam sposób. Powtórzyć czynność, resuspendując 14 µg białka mitochondrialnego w 200 µL każdej z pozostałych mieszanin substratów. Wszystkie mieszaniny białka mitochondrialnego z substratami umieścić w lodzie.Umieść 24-dołkową płytkę hodowlaną na lodzie i w trzech powtórzeniach nanieś do każdego dołka po 50 µL każdej z mieszanin substratów dla mitochondriów. Twórcy testu TRIC w formacie mikropłytkowym zalecają pozostawienie co najmniej dwóch pustych dołków bez mitochondriów, najlepiej po obu stronach płytki hodowlanej. Wiruj płytkę hodowlaną z prędkością 2000 G przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby podczas wirowania mitochondria przywarły do dołków.Podgrzej roztwory substratów w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po zakończeniu wirowania ostrożnie nanieś 450 µL każdego roztworu substratu na odpowiednie doległości. Napełnianie płytki powinno odbywać się w temperaturze pokojowej.Napełnij puste studzienki 500 µL blanku podłoża. Studzienki przeznaczone do analizy przepływu elektronów należy napełnić podłożem do analizy przepływu elektronów, natomiast puste studzienki do analizy sprzężonej można napełnić dowolnym podłożem do analizy sprzężonej. Po dodaniu 450 µL podłoża do każdej studzienki, obejrzyj warstwę mitochondriów w studzience przy 20-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że mitochondria są równomiernie rozproszone w pojedynczej monowarstwie.Jak pokazano w tym przykładzie, dołki obrazowe, w których monowarstwa nie wydaje się być równomiernie rozłożona, można usunąć po etapie oc. Po potwierdzeniu adhezji mitochondriów, przenieś płytkę hodowlaną do urządzenia do analizy Respir metric. Kliknij OK.Urządzenie wysunie płytkę pomocniczą, która została wcześniej użyta do kalibracji. Należy wyjąć płytkę pomocniczą i umieścić na tacy płytkę do hodowli komórek zawierającą mitochondria. Niebieska wcięcie na płytce do hodowli komórek powinno znajdować się w lewym dolnym rogu tacy.Kliknij kontynuuj, aby rozpocząć analizę, która trwa około 40 minut. Po zakończeniu procesu naciśnij na ekranie przycisk wysuń, aby wysunąć płytkę hodowlaną. Po wysunięciu płytki wyjmij i zutylizuj płytkę hodowlaną oraz kartridż.Naciśnij przycisk kontynuuj na ekranie. Pomiary zostaną automatycznie zapisane jako plik XLS w folderze danych. Otwórz ten plik i zmień wyświetlanie z O2 na OCR, klikając strzałkę w dół pod znacznikiem Y1.Następnie w opcjach wyświetlania danych o szybkości zmień punkt środkowy na szybkości punkt-punkt. Kliknij OK. Aby zastosować te zmiany, kliknij kartę trybu grupowania studzienek w lewym dolnym rogu ekranu, aby pogrupować studzienki o podobnych warunkach.Na koniec kliknij kartę sample mean standard error znajdującą się w środkowej części ekranu po lewej stronie. Polecenia te można było skonfigurować również przed analizą. Wykresy te przedstawiają tempo zużycia tlenu lub OCR w funkcji czasu dla czterech analiz sprzęgania.Pierwszy panel przedstawia stan dwa, czyli oddychanie w obecności substratu, ale w braku ADP. Drugi panel po wstrzyknięciu ADP przedstawia maksymalne oddychanie sprzężone, nazywane również oddychaniem w stanie trzy. Trzeci panel po wstrzyknięciu oligomycyny A przedstawia oddychanie wynikające z przecieku protonów, nazywane również oddychaniem w stanie cztery o.Czwarty panel po wstrzyknięciu FCCP przedstawia maksymalną respirację rozsprzęgoną, nazywaną również respiracją stanu trzy U. Piąty panel po wstrzyknięciu antymycyny A przedstawia zahamowanie respiracji oksydacyjnej. Wszystkie stany mitochondrialne charakteryzują się minimalnym odchyleniem standardowym dzięki dokładnemu wymieszaniu zapasu mitochondriów oraz mieszanin substratów mitochondrialnych, a także uzyskaniu pojedynczej warstwy mitochondriów po wirowaniu w celu adhezji.W przeciwieństwie do tego, naniesienie nierównej ilości mitochondriów do każdej studni i nieuzyskanie pojedynczej warstwy mitochondriów prowadzi do zwiększonego odchylenia standardowego w każdym stanie, co wskazuje niebieska krzywa, wykazująca wartości OCR powyżej 1 500 ole na minutę, a także spadające tempo oddychania w trakcie okresu pomiarowego, czego przykładem jest spadek wartości tempa między poszczególnymi punktami pomiarowymi. Należy zauważyć, że czerwona krzywa wykazuje spójne tempo między punktami pomiarowymi, a maksymalne wartości OCR są niższe niż 1 500 ole na minutę. Przeładowanie białkiem mitochondrialnym może również prowadzić do wyczerpania tlenu w mikrokomorze studni, co uniemożliwia dokładny pomiar OCR przy każdym kolejnym pomiarze, na co wskazuje niebieska krzywa, wykazująca wartości O2 zbliżające się do zera w trakcie okresu pomiarowego, a także znacznie obniżone początkowe wartości O2 po każdym kolejnym pomiarze.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować cierpliwość podczas mieszania mitochondriów i roztworów substratowych. Po opanowaniu tych metod można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty w celu odpowiedzi na kolejne pytania, takie jak: w jaki sposób leczenie ukierunkowane na konkretny transporter substratu wpływa na mitochondrialne zużycie tlenu?

using-isolated-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Naucz się izolować mitochondria z mięśni szkieletowych myszy i przeprowadzać wysokoprzepustowe pomiary oddechowe na mikropłytkach. Ta metoda pozwala efektywnie badać funkcję łańcucha transportu elektronów i cyklu Krebsa.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Przeglądaj więcej filmów