Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach
October 30th, 2015
Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie technologii zużycia tlenu opartej na mikropłytkach do oceny funkcji łańcucha transportu elektronów, szlaku utleniania beta cyklu TCA i transporterów substratów. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie substratu i roztworów iniekcyjnych do testu. Drugim krokiem jest dodanie roztworów iniekcyjnych do uprzednio uwodnionego wkładu testowego tric w celu skalibrowania maszyny do zużywania tlenu.
Następnie przygotuj roztwory substratów mitochondrialnych i załaduj te roztwory do płytki hodowli komórkowej. Odkręć płytkę do hodowli komórkowej, aby umożliwić mitochondrialne przyleganie do płytki na długo przed załadowaniem płytki do testu metrycznego Respira. Uzyskuje się wyniki instrumentów, które pokazują wskaźniki zużycia tlenu w oparciu o oddychanie mitochondrialne dla każdego testu metrycznego respiro.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektroda Clarka, jest to, że technologie oparte na mikropłytkach pozwalają na bardziej wydajne i bardziej przepustowe pozyskiwanie zużycia tlenu przy mniejszych ilościach mitochondriów, generalnie osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności ze względu na wszystkie ruchome części zaangażowane w przygotowanie roztworów do testu W noc poprzedzającą eksperyment Wkład do testu hydratycznego w jednym mililitrze roztworu kalibracyjnego w nie Inkubator CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia wyjmij wszystkie zamrożone łodygi i rozmroź je w kąpieli lub inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotować wszystkie roztwory substratów i roztwory do wstrzykiwań i przechowywać je na lodzie. Kolejnym krokiem jest zaprogramowanie wielodołkowej maszyny do pomiaru zużycia tlenu do odpowiednich parametrów mieszanki, wagi i pomiaru.
Wejdź do oprogramowania analitycznego i wybierz tryb standardowy. Wejdź na forum gości konika morskiego i kliknij kreatora testów. W kreatorze testów kliknij protokół, aby zmienić parametry masy mieszanki i pomiaru.
Oznacz dołki tła pod zakładką korekcji wstecznej i pamiętaj, aby podświetlić. Wykonaj korekcję tła. Oznacz warunki, klikając najpierw kartę grup i etykiet, a następnie kartę informacji o grupie.
Po wprowadzeniu tych parametrów kliknij end, a następnie zapisz szablon. Aby rozpocząć tę procedurę, należy załadować roztwory do wstrzykiwań do wkładu testowego. Należy pamiętać o wstrzykiwaniu roztworów do odpowiednich portów.
Załaduj wkład testowy do maszyny z naciętym rogiem w lewym dolnym rogu. Rozpocznij kalibrację, najpierw wchodząc do oprogramowania analitycznego, a następnie przechodząc do trybu standardowego. Wejdź na forum gości konika morskiego.
Otwórz zapisany szablon w obszarze XF Drive na karcie szablonów. Po otwarciu kliknij start, aby rozpocząć kalibrację, która zajmie około 30 minut. Mitochondria do tej procedury wyizolowano z czerwonych mięśni szkieletowych delikatnie, ale dokładnie wymieszano substrat mitochondriów, delikatnie mieszając, iterując roztwór za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, która miała odcięte około trzech milimetrów końca.
Po określeniu stężenia białka w zapasie mitochondrialnym, resus zawiesić 10 mikrogramów białka mitochondrialnego na 200 mikrolitrów znanej mieszanki substratów bursztynianu. Delikatnie, ale dokładnie wymieszaj roztwór substratu mitochondriów, delikatnie mieszając, delikatnie mieszając roztwór końcówką pipety o pojemności 200 mikrolitrów, której koniec został odcięty w ten sam sposób. Reeses Band, 14 mikrogramów białka mitochondrialnego na 200 mikrolitrów każdej z pozostałych mieszanek substratów umieszcza wszystkie mieszanki substratów białek mitochondrialnych na lodzie.
Umieścić 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej na lodzie i w potrójnym obciążeniu 50 mikrolitrów na studzienkę każdej z mieszanin substratów mitochondriów. Twórcy testu tric opartego na mikropłytkach zalecają pozostawienie co najmniej dwóch ślepych studzienek bez mitochondriów, najlepiej po obu stronach płytki do hodowli komórkowej. Obracać płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 2000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby przykleić mitochondria do studzienek podczas obracania się płytki.
Rozgrzej roztwory substratów w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania ostrożnie załaduj 450 mikrolitrów każdego roztworu substratu na odpowiednie dołki. Pamiętaj, aby załadować płytę w temperaturze pokojowej.
Załaduj puste studzienki 500 mikrolitrami półfabrykatu podłoża. Studzienki przeznaczone do oznaczania przepływu elektronów powinny być załadowane substratem przepływu elektronów, podczas gdy sprzężone studzienki ślepe do testów mogą być załadowane dowolnym substratem do oznaczania sprzęgającego. Po dodaniu 450 mikrolitrów substratu do każdego z nich, dobrze obejrzyj warstwę mitochondriów w studzience przy 20-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że mitochondria są równomiernie rozproszone w jednej monowarstwie.
Jak pokazano w tym przykładzie, dołki obrazu, które nie wydają się mieć równomiernie rozłożonej warstwy monowarstwowej, można usunąć po oc. Po potwierdzeniu przylegania mitochondriów należy przenieść płytkę do hodowli komórkowej do przyrządu do testu metrycznego Respir. Kliknij w porządku.
Maszyna wysunie tabliczkę narzędziową, która była wcześniej używana do kalibracji. Wyjmij płytkę użytkową i umieść na tacy płytkę do hodowli komórkowej zawierającą mitochondria. Niebieskie nacięcie na płytce do hodowli komórkowej należy umieścić w lewym dolnym rogu tacy.
Kliknij przycisk Kontynuuj, aby rozpocząć przebieg testu, który trwa około 40 minut. Po zakończeniu przebiegu naciśnij przycisk wysuwania na ekranie, aby wysunąć płytkę do hodowli komórkowej. Po wysunięciu płytki wyjmij i wyrzuć płytkę do hodowli komórkowej i wkład.
Naciśnij przycisk Kontynuuj na ekranie. Przebieg zostanie automatycznie zapisany jako plik XLS w pliku danych. Otwórz ten plik i zmień wyświetlanie z O2 na OCR, naciskając strzałkę w dół pod znacznikiem Y one.
Następnie zmień stawki z punktu środkowego na punkt do punktu pod danymi stawki wyświetlanymi jako opcja. Kliknij w porządku. Aby zastosować te zmiany, kliknij kartę trybu grupowania studni w lewym dolnym rogu ekranu, aby zgrupować ze sobą studnie o podobnych warunkach.
Na koniec kliknij przykładową kartę średniego błędu standardowego w kierunku środka ekranu po lewej stronie. Polecenia te można również skonfigurować przed testem. Ślady te reprezentują wskaźniki zużycia tlenu lub OCR w funkcji czasu dla czterech testów sprzęgających.
Pierwszy panel reprezentuje stan drugi, oddychanie lub oddychanie w przypadku braku DP. Drugi panel po wstrzyknięciu A DP reprezentuje maksymalne oddychanie sprzężone, zwane również oddychaniem w stanie trzecim. Trzeci panel po wstrzyknięciu oligo mycyny. A reprezentuje oddychanie z powodu wycieku protonów, zwane również oddychaniem stanu czwartego.
Czwarty panel po wstrzyknięciu FCCP reprezentuje maksymalne oddychanie niesprzężone, zwane również oddychaniem stanu trzy U. Piąty panel po wstrzyknięciu antymycyny A reprezentuje hamowanie oddychania oksydacyjnego. Wszystkie stany mitochondrialne mają minimalne odchylenie standardowe ze względu na dokładne wymieszanie materiału mitochondrialnego i mieszaniny substratów mitochondriów oraz uzyskanie pojedynczej monowarstwy mitochondriów po spinie adhezencji.
W przeciwieństwie do tego, ładowanie nierównych mitochondriów w każdym dołku i nieosiągnięcie ani jednej monowarstwy mitochondriów prowadzi do zwiększonego odchylenia standardowego w każdym stanie, na co wskazuje niebieski ślad, który pokazuje wartości OCR powyżej 1 500 ole na minutę, a także zmniejszenie częstości oddychania w okresie pomiaru, czego przykładem jest spadek wartości szybkości od punktu do punktu. Należy pamiętać, że czerwony ślad pokazuje stałe szybkości od punktu do punktu, a maksymalne wartości OCR są mniejsze niż 1 500 ole na minutę. Przeciążenie białkami mitochondrialnymi może również prowadzić do wyczerpania tlenu w mikrokomorze studni, uniemożliwiając w ten sposób dokładny pomiar OCR dla każdego kolejnego pomiaru, na co wskazuje Blue Trace, który pokazuje wartości O2 zbliżające się do zera w okresie pomiaru, a także znacznie obniżone początkowe wartości O2 po każdym kolejnym pomiarze.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o pacjentach podczas mieszania mitochondriów i roztworów substratów. Po opanowaniu tych metod można zdeformować dodatkowe eksperymenty, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: w jaki sposób leczenie lekami określonego transportera substratu wpływa na zużycie tlenu w mitochondriach?
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metody przeprowadzania pomiarów oddechowych opartych na płytkach mikrotytrach z wyizolowanymi mitochondriami z mięśni szkieletowych myszy. Te pomiary mierzą zmiany w zużyciu tlenu przez mitochondria, zapewniając wgląd w adaptacje metaboliczne.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Fizjologia metaboliczna
Tło
- Technologie oparte na płytkach mikrotytrach zwiększają wydajność pomiarów zużycia tlenu.
- Izolowane mitochondria z mięśni szkieletowych służą jako model do badania funkcji mitochondria.
- Rozumienie oddychania mitochondrialnego jest kluczowe dla wglądu w choroby metaboliczne.
- Tradycyjne metody, takie jak Elektroda Clarka, są mniej efektywne w analizie wysokoprzekątowej.
Cel badania
- Ocenić funkcję łańcucha transportu elektronowego i cyklu kwasu cytrynowego.
- Ocenić adaptacje mitochondrialne w odpowiedzi na różne substraty.
- Dostarczyć szczegółowego protokołu dla badaczy nowych w tej metodzie.
Zastosowane metody
- Przygotowanie substratu i roztworów do wstrzykiwania do badania.
- Kalibracja urządzenia do pomiaru zużycia tlenu przy użyciu nawodnionej kasetki do badania.
- Izolacja i przygotowanie mitochondria z mysich mięśni szkieletowych.
- Przeprowadzenie badań oddechowych w celu zmierzenia szybkości zużycia tlenu.
Główne wyniki
- Udane pomiary szybkości oddychania mitochondrialnego przy użyciu technologii płytek mikrotytrach.
- Demonstracja wyższych możliwości przetwarzania w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Identyfikacja optymalnych warunków dla przylegania mitochondrialnego i ładowania substratu.
Wnioski
- Badania oddechowe oparte na płytkach mikrotytrach są skuteczne w badaniu funkcji mitochondrialnej.
- Ta metoda pozwala na efektywne wykorzystanie ograniczonej ilości próbek mitochondrialnych.
- Szczegółowe protokoły mogą pomóc badaczom w wdrożeniu tych badań w ich badaniach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput assessment of mitochondrial function using minimal skeletal muscle tissue, supporting early-stage target validation in metabolic disease research. By providing quantitative oxygen consumption data from isolated mitochondria, it enhances predictive confidence in pathway modulation studies. The approach addresses a key gap in scalable mitochondrial phenotyping for preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of electron transport chain, TCA cycle, and fatty acid oxidation pathways in a disease-relevant model.
- Operational Value: Requires only microgram quantities of mitochondrial protein, conserving precious preclinical samples.
- Scientific Value: Supports target hypothesis testing by linking substrate transporter modulation to respiratory output.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative OCR measurements across multiple respiratory states for compound screening.
- Operational Value: Microplate format allows parallel testing of conditions, improving assay throughput and reagent efficiency.
- Scientific Value: Standardized mitochondrial adherence and substrate loading reduce well-to-well variability, enhancing data reliability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant skeletal muscle mitochondrial data to inform translational biomarker strategies.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of metabolic adaptations in preclinical models.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating mitochondrial contributions to whole-tissue phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows, enabling mitochondrial phenotyping after target identification and before efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of metabolic targets in skeletal muscle.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible OCR readouts for hit confirmation and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Provides state-resolved respiration metrics (basal, coupled, leak, uncoupled) to compare metabolic phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro mitochondrial function to preclinical continuity via disease-relevant tissue model.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized mitochondrial assay platform applicable across multiple metabolic targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement by linking modulation to measurable respiratory changes.
- Operational Value: Reduces sample consumption through low-input, high-precision measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early metabolic liability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mitochondrial safety and efficacy profiles.
Implementation Considerations
- Expertise in mitochondrial isolation and respirometry is required for reliable results.
- Access to a microplate-compatible oxygen consumption analyzer and associated cartridges is necessary.
- Standardization of mitochondrial protein quantification and substrate preparation across teams ensures reproducibility.
- Adaptation to other tissues may require optimization of isolation and adherence protocols.
- Technical precision in mixing and monolayer formation is critical to minimize variability in OCR measurements.
