Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Ogólnym celem tego artykułu wideo jest wyizolowanie wysokiej jakości mitochondriów z niewielkich ilości mięśni szkieletowych myszy do wykorzystania w testach tric opartych na mikropłytkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach biomedycznych, takie jak opisanie, w jaki sposób niektóre leki i białka modulują mięśnie szkieletowe i mitochondrialne zużycie tlenu. Główną zaletą tej techniki jest to, że wysokiej jakości mitochondria można wyizolować z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy niż wcześniej zgłaszano.

Przeprowadzić eutanazję myszy zgodnie z wytycznymi instytucji. Następnie ustaw mysz na boku i użyj nożyczek z cienką końcówką, aby wykonać nacięcie w skórze. Nakładanie na nadkłykieć boczny kości udowej.

Obierz skórę w kierunku myszy, a następnie usuń poduszeczkę tłuszczową umieszczoną nad punktem początkowym mięśnia czworogłowego. Następnie przetnij ścięgno mięśnia czworogłowego, które jest przyczepione do rzepki. Powoli przeciąć nerwicę apo między kością a mięśniem czworogłowym, unikając tętnicy udowej.

Następnie przetnij ścięgno w punkcie początkowym na kości udowej, aby uwolnić mięsień czworogłowy uda i umieść mięsień czworogłowy w schłodzonym PBS. Usuń widoczną tkankę tłuszczową nad mięśniem czworogłowym za pomocą nożyczek. Po oczyszczeniu odwróć mięsień czworogłowy uda tak, aby część mięśnia, która leżała nad kością udową, była skierowana do góry.

Otwórz mięsień czworogłowy uda za pomocą kleszczy ruchem wachlującym. Usuń dwie widoczne czerwone części mięśni z każdego płata i umieść je w zlewce zawierającej pięć mililitrów schłodzonych mitochondriów. Bufor izolacyjny.

Następnie przetnij skórę leżącą na ścięgnie Achillesa cienkimi nożyczkami i obierz skórę w kierunku myszy. Przetnij odsłonięte ścięgno Achillesa i złudź mięsień w kierunku ciała myszy. Przetnij ścięgno na kłykciach bocznych i przyśrodkowych kości udowej, aby uwolnić brzuchaty łydki i umieść mięsień brzuchaty łydki przyczepiony do jego ścięgien w naczyniu wypełnionym schłodzonym PBS.

Odwróć mięsień brzuchaty łydki i oderwij mięsień płaszczkowaty. Umieść mięsień płaszczkowaty w zlewce zawierającej pięć mililitrów schłodzonych mitochondriów. Bufor izolacyjny.

Jeden z kolejnych wentylatorów otworzył gastrok i usunął trzy wizualne czerwone części mięśni. Będą dwie boczne części i jeden przyśrodkowy powierzchowny czerwony pasek. Po wyizolowaniu przenieś czerwony mięsień do zlewki zawierającej pięć mililitrów schłodzonych mitochondriów.

Bufor izolacyjny jeden. Usuń kolejne 75 do 100 miligramów czerwonego mięśnia z drugiej nogi myszy. Powtarzanie procesu, który właśnie pokazano.

Umieść wypreparowany mięsień z drugiej nogi w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej z koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy oraz buforem do lizy komórek przygotowanym zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Natychmiast zamknąć, zamrozić drugą próbkę w ciekłym azocie do użycia w western blot. Umieść wstępnie zagojoną płaską plastikową powierzchnię na lodzie w dużym wiadrze.

Następnie wlej kroplę bufora izolacyjnego mitochondriów na plastikową powierzchnię i za pomocą pęsety umieść cały podzielony czerwony mięsień w kropli izolacji. Bufor. Miel tkankę mięśniową przez dwie minuty za pomocą żyletek z pojedynczą krawędzią, zmieniaj na nową ostrą maszynkę do golenia co 40 sekund. Przenieś zmieloną tkankę do nowej zlewki z pięcioma mililitrami świeżych mitochondriów.

Bufor izolacyjny jeden. Następnie weź roztwór i odcedź go przez sitko o wielkości 100 mikronów, umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Osusz tkankę delikatną wycieraczką zadaniową, a następnie przenieś ją do pięciu mililitrów 0,05% roztworu tryny.

Użyj pęsety, aby usunąć pozostałą tkankę z wycieraczki roboczej i dodaj ją do trypsyny. Inkubuj tkankę mięśniową w roztworze trypsyny na lodzie przez 30 minut. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu wlej supinat trypsyny do pojemnika na odpady i ponownie zawieś osad z trzema mililitrami lodowatego buforu do izolacji mitochondriów. Następnie przenieś tkankę do 45-mililitrowej szklanej probówki homogenizatora. Przepłucz 15-mililitrową stożkową probówkę kolejnym 1,5 mililitra bufora do izolacji mitochondriów, aby zebrać pozostałą próbkę i dodać ją do szklanej probówki homogenizatora.

Następnie umieść szklaną rurkę homogenizatora w zlewce lub plastikowym pojemniku wypełnionym do połowy lodem. Tak więc szklany homogenizator porusza się minimalnie w zlewce. Homogenizować próbkę za pomocą tłuczka z politetrafluoroetylenu przymocowanego do tkanki napędzanej silnikiem.

Homogenizator z 10 przy 80 obr./min. Przytrzymaj dolną część każdego przejścia przez około dwie sekundy. Następnie przenieś homogenat tkankowy do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

I przepłucz szklaną rurkę homogenizatora 6,5 mililitra jednego buforu izolacji mitochondriów. Wlej bufor do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów zawierającej resztę tkanki. Homogenat. Wirować próbkę w temperaturze 700 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie delikatnie wlać supinat do szklanej probówki wirówkowej o wysokiej wytrzymałości i wyrzucić osad.

Następnie obracaj snat z prędkością 8 000 razy G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Aby osadzać mitochondria, usuń snat i ponownie zawieś osad, powoli dodając 500 mikrolitrów buforu izolacyjnego mitochondriów dwa, odetnij koniec końcówki pipety i delikatnie homogenizuj osad w buforze, mieszając i mieszając. Następnie dodaj kolejne 4,5 mililitra izolacji mitochondriów.

Bufor dwa do mieszaniny Po całkowitym zawieszeniu osadu wirować homogenat w temperaturze 8 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby ponownie zagnieździć mitochondria. Usunąć supernatant S i delikatnie, ale całkowicie ponownie zawiesić osad, dodając 2 25 mikrolitrów izolacji mitochondriów. Bufor drugi, za pomocą końcówki pipety z odciętym końcem, delikatnie wymieszać i wymieszać granulat po każdym wydaniu 25 mikrolitrów buforu.

Po zakończeniu umieść ten mitochondrialny zapas na lodzie. Wykonaj dwa oddzielne rozcieńczenia mitochondriów w wodzie o wysokiej czystości od jednego do 20 rozcieńczeń. Dodać 0,1% Triton 100 x do jednej próbki i sonikować przez 10 sekund na niskim poziomie.

Pozostawić drugie rozcieńczenie na lodzie i umieścić próbkę poddaną sonikacji z powrotem w lodzie. Po sonikacji, następnie wykonać test syntazy cytrynianu z rozcieńczeniem mitochondriów zarówno niesonikowanymi, jak i sonikowanymi, używając testu fotometrycznego przy użyciu standardowych technik, określić procent nienaruszonych błon mitochondrialnych, korzystając z równań podanych w dołączonym protokole tekstowym. Syndykacja mitochondriów powoduje statystycznie istotny wzrost aktywności syntazy cytrynianu.

Aktywność syntazy cytrynianu w niesonikowanych próbkach mitochondrialnych w porównaniu z próbkami sonikowanymi pokazuje, że 92,5% mitochondriów pozostało nienaruszonych po izolacji ekspresji ga. DH i COX cztery są widoczne w lizacie całej tkanki w izolowanych mitochondriach obserwuje się ekspresję Coxa cztery. Chociaż widoczne są tylko słabe pasma GA DH, wyniki te wskazują na dobre izolacje mitochondriów z niewielkim zanieczyszczeniem składnikami niemitochondrialnymi podczas procedury izolacji.

Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby obchodzić się z zapasem mitochondrialnym ostrożnie, nigdy go nie wirować ani energicznie mieszać po tej procedurze. Inne metody, takie jak pomiar produkcji gatunków o działaniu reaktywnym, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy interwencja wpływa na produkcję reaktywnych form tlenu w izolowanych mitochondriach.