Name: Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę izolacji mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych. Technika umożliwia badanie funkcji mitochondrialnej i wpływu substancji na metabolizm energetyczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Instytut Badawczy Nauk Przyrodniczych Fralin oraz Rdzeń Fenotypowania Metabolicznego w Virginia Tech wsparły tę pracę.

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Instytucie Politechnicznym Wirginii i Uniwersytecie Stanowym.
1. Ustawienie (Czas: ~45 min)
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożone zapasy 0,25% trypsyny, buforu izolacyjnego dla mitochondriów (IBM) 1 i IBM2 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Opłucz szklane naczynia i narzędzia sekcyjne w 70% etanolu, a następnie w wodzie o wysokiej czystości.</li>
	<li>Przygotuj 0,05% roztwór trypsyny z 0,25% zapasu trypsyny, rozcieńczając 1 część trypsyny w 4 częściach IBM1.</li>
	<li>Wymieszaj koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy z buforem do lizy komórek (stosunek 1:100) w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml z zakrętką.</li>
	<li>Podwielokrotność 5 ml (5 ml/mysz) 0,05% trypsyny do plastikowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Ustaw homogenizator tkankowy napędzany silnikiem na 80 obr./min.</li>
</ol>
2. Izolacja mitochondriów mięśni szkieletowych (Czas: ~90 min)
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Usuń czerwony mięsień z mięśnia czworogłowego uda i mięśnia brzuchatego łydki, który obejmuje płaszczkowaty (łącznie ~ 75-100 mg), jak opisano w następujących krokach:
	<ol>
		<li>Obierz skórę w kierunku myszy.</li>
		<li>Usuń poduszeczkę tłuszczową nad punktem początkowym mięśnia czworogłowego. Przetnij ścięgno mięśnia czworogłowego, które jest przyczepione do rzepki, nożyczkami z cienką końcówką. 
		Uwaga: Mięsień czworogłowy uda można rozpoznać po jego anatomicznym położeniu w przedniej części bliższej części kości udowej.</li>
		<li>Powoli odetnij rozcięgno między kością a mięśniem czworogłowym, unikając tętnicy udowej, aby uwolnić mięsień czworogłowy od kości. Przetnij ścięgno nożyczkami z cienką końcówką w punkcie początkowym na kości udowej, aby uwolnić mięsień czworogłowy uda i umieść mięsień czworogłowy w schłodzonym PBS.</li>
		<li>Usuń widoczną tkankę tłuszczową nad mięśniem czworogłowym za pomocą nożyczek. Odwróć mięsień czworogłowy uda tak, aby część mięśnia, która leżała nad kością udową, była skierowana do góry. Otwórz mięsień czworogłowy uda za pomocą kleszczy ruchem wachlującym. Usunąć dwie widoczne czerwone części mięśni z każdego płata za pomocą nożyczek z cienką końcówką i umieścić w zlewce zawierającej 5 ml schłodzonego IBM1. 
		Uwaga: Mięsień czworogłowy uda pojawia się jako dwa płaty z paskiem czerwonego mięśnia znajdującym się w pobliżu bocznej krawędzi każdego płata.</li>
		<li>Przetnij skórę leżącą na ścięgnie Achillesa nożyczkami z cienką końcówką i obierz skórę w kierunku myszy. Przetnij odsłonięte ścięgno Achillesa i złudź mięsień w kierunku ciała myszy.</li>
		<li>Przetnij ścięgno na bocznych i przyśrodkowych kłykciach kości udowej nożyczkami z cienką końcówką, aby uwolnić brzuchaty łydki i umieść mięsień brzuchaty łydki przyczepiony do ścięgien w schłodzonym PBS.</li>
		<li>Odwróć mięsień brzuchaty łydki i oderwij mięsień płaszczkowaty i umieść w zlewce zawierającej 5 ml schłodzonego IBM1. Wachluj otwórz brzuchaty łydki. Usunąć trzy widoczne czerwone części mięśni (dwa boczne i jeden przyśrodkowy powierzchowny czerwony pasek) nożyczkami z cienką końcówką i przenieść je do zlewki zawierającej 5 ml schłodzonego IBM1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń kolejne ~ 75-100 mg czerwonego mięśnia z drugiej nogi myszy (jak opisano w kroku 2.2) i umieść w 1,5 ml probówce mikrowirówkowej z koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy oraz buforem do lizy komórek (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% dodecylosiarczan sodu, 0,5% deoksycholan sodu, 1% polioksyetylenofenyloeter polioksyetylenowy (9), rozgałęziony. Drugą próbkę należy natychmiast błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie w celu późniejszego wykorzystania w Western blot (patrz krok 6.1).</li>
	<li>Umieść wstępnie schłodzoną, płaską plastikową powierzchnię na lodzie w dużym wiadrze. Wylej kroplę IBM1 na plastikową powierzchnię i za pomocą pęsety umieść cały podzielony czerwony mięsień (kroki 2.2.4 i 2.2.7) w kropli IBM1. Miel tkankę mięśniową przez 2 minuty za pomocą 3 ostrzy maszynki do golenia, zmieniając maszynki do golenia co 40 sekund.</li>
	<li>Przenieść zmieloną tkankę do nowej zlewki z 5 ml świeżego IBM1, przytrzymując plastikową powierzchnię nad zlewką i zeskrobując mięsień do zlewki za pomocą żyletki. Pobrać ten roztwór i odcedzić go przez sitko o wielkości 100 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Osusz tkankę delikatną wycieraczką zadaniową, a następnie przenieś ją do 5 ml 0,05% roztworu trypsyny. Użyj pęsety, aby usunąć chusteczkę z wycieraczki roboczej.</li>
	<li>Inkubuj tkankę mięśniową na lodzie przez 30 minut w 0,05% roztworze trypsyny.</li>
	<li>Obracać stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą mieszaninę trypsyny i mięśni w temperaturze 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wlać supernatant trypsyny do pojemnika na odpady i ponownie zawiesić osad z 3 ml lodowatego IBM1. Przenieść tkankę do szklanej probówki homogenizatora o pojemności 45 ml. Przepłukać stożkową probówkę o pojemności 15 ml innym pojemnikiem IBM1 o pojemności 1,5 ml, aby zebrać pozostałą próbkę i dodać ją do szklanej probówki homogenizatora.</li>
	<li>Umieść szklaną rurkę homogenizatora w zlewce lub plastikowym pojemniku wypełnionym do połowy lodem, tak aby szklany homogenizator poruszał się minimalnie w zlewce.</li>
	<li>Homogenizować mieszaninę tkanka/IMB1 za pomocą tłuczka PTFE przymocowanego do homogenizatora tkankowego napędzanego silnikiem z 10 przejściami przy 80 obr./min. Przytrzymaj dolną część każdego przejścia przez ~2 sekundy.</li>
	<li>Przenieść homogenat tkankowy do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przepłukać szklaną probówkę homogenizatora 6,5 ml IBM1. Wlać IBM1 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej homogenat tkankowy.</li>
	<li>Obracać stożkową probówkę o pojemności 15 ml o masie 700 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Delikatnie wlać supernatant do szklanej probówki wirówkowej o wysokiej mocy i wyrzucić osad.</li>
	<li>Wirować supernatant z powyższego stopnia w temperaturze 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant IBM1 i ponownie zawiesić osad, powoli dodając 500 μl IBM2. Odetnij koniec końcówki pipety i delikatnie homogenizuj granulkę w IBM2, mieszając i mieszając. Dodać kolejne 4,5 ml IBM2 do mieszaniny po całkowitym zawieszeniu osadu. 
	Uwaga: Unikaj nadmiernego rozcierania podczas łamania większych kawałków granulek, ponieważ może to uszkodzić błony mitochondrialne.</li>
	<li>Wirować homogenat IBM2/tkankowy w temperaturze 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Ten krok można powtórzyć w czystej probówce wirówkowej o wysokiej wytrzymałości w celu dokładniejszego oznaczania ilościowego białka w izolowanych mitochondriach w kroku 4, ponieważ resztkowe BSA mogą przyczyniać się do całkowitej zawartości białka.</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie, ale całkowicie ponownie zawiesić osad, dodając dwie porcje IBM2 o 25 μl z końcówką pipety z odciętym końcem. Delikatnie wymieszać i wymieszać osad po każdym dodaniu 25 μl IBM2. Umieść ten mitochondrialny bulion na lodzie.</li>
</ol>
3. Homogenizacja całego lizatu tkankowego (Czas: ~45 min; można to zrobić w kroku 7)
<ol>
	<li>Usuń mięsień z tego, który został umieszczony w ciekłym azocie z kroku 2.3 i inkubuj w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozmrożenia.</li>
	<li>Miel tkankę przez ~30 sekund na lodzie nożyczkami z cienką końcówką.</li>
	<li>Dodaj dwie miarki 100 μl kulek tlenku cyrkonu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z nakrętką z kroku 3.2, która zawiera zmieloną tkankę. Homogenizuj tkankę w homogenizatorze tkanek w młynie perełkowym, wykonując dwa do trzech 5-minutowych cykli przy ustawieniu prędkości 4-6 (ustawienie średnie).</li>
	<li>Wirować mieszaninę z kroku 3.3 w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzucić osad i umieścić supernatant na lodzie.</li>
</ol>
4. Oznaczanie białka (Czas: ~30 min)
<ol>
	<li>Określić stężenie białka w lizacie całej tkanki (krok 3.4) i zapasie mitochondrialnym (krok 2.17) za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA zgodnie ze specyfikacjami producenta.</li>
</ol>
5. Integralność błony mitochondriów; Aktywność syntazy cytrynianu (CS) (czas: ~15 min)
<ol>
	<li>Wykonaj dwa oddzielne rozcieńczenia mitochondriów w stosunku 1: 20 w wodzie o wysokiej czystości. Dodaj 0,1% Triton 100-X do jednej próbki i poddaj ją sonizacji na niskim poziomie (765 watów, amplituda 2). Pozostawić drugie rozcieńczenie na lodzie. Po sonikacji umieścić próbkę z powrotem w lodzie.</li>
	<li>Przeprowadzić test syntazy cytrynianu zarówno z niesonikowanymi, jak i sonikowanymi rozcieńczeniami mitochondrialnymi, używając testu spektrofotometrycznego, jak opisano wcześniej11,12.</li>
	<li>Określ procent nienaruszonych błon mitochondriów, korzystając z następujących równań: 
	(Niesonikowana aktywność CS ÷ Sonikowana aktywność CS)* 100</li>
</ol>
 
100- N (procent osiągnięty z góry)
6. Jakość izolacji mitochondriów; Western Blotting (czas: zgodnie z protokołem laboratoryjnym)
<ol>
	<li>Wykonaj Western blot na lizacie całej tkanki i izolowanych mitochondriach, jak opisano wcześniej12. 
	Uwaga: Należy użyć przeciwciał pierwszorzędowych dla GAPDH (rozcieńczenie 1: 1,000 w 5% BSA/TBS-T) i COXIV (rozcieńczenie 1:1,000 w 5% mleku beztłuszczowym/TBS-T), a następnie odpowiednio przeciwciał drugorzędowych przeciwko kozom i królikom (1:10,000).</li>
</ol>
7. Test respirometryczny (Czas: ~90 min)
<ol>
	<li>Wykonaj pożądane testy respirometryczne przy użyciu technologii pomiaru zużyciaO2 na bazie mikropłytek, jak opisano wcześniej (patrz artykuł towarzyszący i Rogers i wsp. 8).</li>
	<li>Określ współczynnik kontroli oddechowej (RCR), dzieląc stan 3 przez stan 4o (RCR) lub dzieląc stan 3u przez stan 4o. Przy określaniu RCR należy użyć środkowego (średniego) punktu lub najwyższych (stan 3) i najniższych (stan 4o) ze śladów punkt-punkt.</li>
</ol>

<ol><li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%22">Bioenergetics</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li>
<li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).</li>
<li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance%2C+metabolic+flexibility%2C+and+mitochondrial+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS one. 6, e21746(2011).</li>
<li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).</li>
<li>Hulver, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+stearoyl-CoA+desaturase-1+expression+in+skeletal+muscle+contributes+to+abnormal+fatty+acid+partitioning+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans.</a> Cell Metab. 2, 251-261 (2005).</li>
<li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+modulates+skeletal+muscle+substrate+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Subjects+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).</li>
<li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol.%3A+Respir.%2C+Envir.+and+Ex.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).</li>
<li>Asmann, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+functions%2C+mitochondrial+DNA+copy+numbers%2C+and+gene+transcript+profiles+in+type+2+diabetic+and+nondiabetic+subjects+at+equal+levels+of+low+or+high+insulin+and+euglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia.</a> Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).</li>
<li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li>
</ol>

George Rogers jest pracownikiem firmy Seahorse Bioscience, która produkuje instrument, dla którego ten protokół został zmodyfikowany.

Przedstawione w niniejszym artykule metody zawierają szczegółowy opis procedury izolacji mitochondriów z minimalnych ilości (~75-100 mg) mięśni szkieletowych myszy. Ta procedura izolacji jest w stanie uzyskać wysoko funkcjonujące, czyste mitochondria (~ 450 μg), o czym świadczą wskaźniki zużyciaO2 , wartości RCR, maksymalna aktywność syntazy cytrynianu i ekspresja białka z immunoblottingu. Co ważne, mitochondria wyizolowane z tej procedury mogą być wykorzystywane do wielu testów respirometycznych z technologią...

Podstawową funkcją mitochondriów jest wytwarzanie ATP z fosforylacji oksydacyjnej. Jednak mitochondria mają wiele innych ważnych funkcji komórkowych, w tym między innymi: produkcję i detoksykację reaktywnych form tlenu, regulację cytoplazmatycznego i mitochondrialnego wapnia, transport organelli, homeostazę jonową i udział w apoptozie1,2. Dlatego nie jest zaskakujące, że dysfunkcyjne mitochondria odgrywają rolę w wielu patologiach chorobowych, takich jak starzenie się, choroby neurodegeneracyjne, choroby układu krążenia, nowotwory, otyłość i cukrzyca3,4. Co ważne, mitochondria mięśni szkieletowych są zaangażowane w wiele z tych patologii3-5.
Testy oddychania mitochondrialnego z wykorzystaniem izolowanych mitochondriów pozwalają na ocenę łańcucha transportu elektronów i funkcji fosforylacji oksydacyjnej oraz określenie mechanizmu (mechanizmów) działania leków i białek modulujących metabolizm. Procedury izolacji mitochondriów istnieją dla wielu typów tkanek i komórek dla różnych gatunków6,7. Jednak procedury te często wymagają dużych ilości tkanek/komórek w celu uzyskania wysokiej jakości mitochondriów niezbędnych do klasycznych testów respirometrycznych. 
Testy respirometyczne oparte na mikropłytkach pozwalają na pomiary o wysokiej przepustowości przy użyciu minimalnych ilości izolowanych mitochondriów, często zaledwie kilka μg na studzienkę8. W związku z tym przedstawiamy modyfikację wcześniej opublikowanych metod7, aby umożliwić wyizolowanie wysokiej jakości mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu zastosowania w testach respirometycznych opartych na mikropłytkach. Ponadto przedstawiono metody ustalania jakości preparatu do izolacji mitochondriów i integralności błon mitochondrialnych. Biorąc pod uwagę, że mitochondria mięśni szkieletowych są zaangażowane w wiele stanów patologicznych, pomiar zużyciaO2 w badaniach napędzanych mechanistycznie staje się coraz bardziej powszechny w badaniach biomedycznych9,10.

<table><tbody><tr><td>Zasadniczo tłusty</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Bez kwasów - BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris/HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>Aldrich E6511</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>N/A</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Chlorek sodu Białe kryształy lub krystaliczny proszek &ge; 99.0 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771&nbsp;</td><td>N/a</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750&nbsp;</td><td>N/a</td></tr><tr><td>Eter polioksyetylenofenylowy (12), rozgałęziony</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Jednokrawędziowe żyletki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon- 100 uM Nylonowe sitka komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>352360</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Halt Protease & Koktajl z inhibitorami fosforanów</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861284</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrowirówek z nakrętką</td><td>Thermo Scientific</td><td>3474</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kulki z tlenku cyrkonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>C9012112</td> Przeciwciało <td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (1D4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-59540</td><td>Nie dotyczy Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-COXIV</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4844s</td><td>Wystarczy dowolne mitochondrialne białko błony wewnętrznej</td></tr><tr><td>Sprzężone z peroksydazą powinowactwo Osioł, anty królik IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearh</td><td>711-035-152</td><td>N / A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza sprzężona z affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>115-001-003</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA Pierce&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C,pH do 7,4 z KOH przed użyciem w teście respirometrycznym</td></tr><tr><td>Kwas bursztynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej, pH do 7,4 z KOH przed użyciem w teście respirometrycznym</td></tr><tr><td>Kwas jabłkowy L(-), BioXtra, &ge; 95%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej, do 7,4 z KOH przed użyciem w teście respirometrycznym</td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej, do 7,4 z KOH przed użyciem w teście respirometrycznym, do 7,4 z KOH przed użyciem w teście</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> respirometrycznym <tr><td>Chlorek palmitoilu L-karnityny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni C</td></tr><tr><td>Oligomycyna A, &ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Cyjanek karbonylu 4-(trifluorometoksy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C</td></tr><tr><td>fenylohydrazon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge; 98% (TLC), proszek [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antymycyna A z Streptomyces sp.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Sklep pod adresem -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Sól monopotasowa adenozyno-5&prime;-difosforanu odwadniająca [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C, do 7,4 z KOH przed użyciem w teście</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> respirometrycznym <tr><td>Rotenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr></tbody></table>

izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunkcyjne mitochondria mięśni szkieletowych odgrywają rolę w zaburzeniach metabolizmu obserwowanych wraz ze starzeniem się, otyłością i cukrzycą typu II. Mitochondrialne testy respirometryczne z izolowanych preparatów mitochondrialnych pozwalają na ocenę funkcji mitochondriów, a także określenie mechanizmu(ów) działania leków i białek modulujących metabolizm. Obecne procedury izolacji często wymagają dużych ilości tkanki, aby uzyskać wysokiej jakości mitochondria niezbędne do testów respirometrycznych. Przedstawione tu metody opisują, w jaki sposób wysokiej jakości oczyszczone mitochondria (~ 450 μg) można wyizolować z minimalnych ilości (~75-100 mg) mięśni szkieletowych myszy w celu zastosowania w wysokoprzepustowych pomiarach oddechowych. Ustaliliśmy, że nasza metoda izolacji daje 92,5± 2,0% nienaruszonych mitochondriów, mierząc aktywność syntazy cytrynianu spektrofotometrycznie. Ponadto analiza Western blot w izolowanych mitochondriach spowodowała słabą ekspresję białka cytozolowego GAPDH i silną ekspresję białka mitochondrialnego COXIV. Brak wyraźnego pasma GAPDH w izolowanych mitochondriach wskazuje na niewielkie zanieczyszczenie ze źródeł innych niż mitochondrialne podczas procedury izolacji. Co najważniejsze, pomiar wskaźnika zużyciaO2 za pomocą technologii opartej na mikropłytkach i określenie współczynnika kontroli oddechowej (RCR) dla sprzężonych testów respirometrycznych wykazuje wysoce sprzężone (RCR; >6 dla wszystkich testów) i funkcjonalne mitochondria. Podsumowując, dodanie oddzielnego etapu mielenia i znaczne zmniejszenie prędkości homogenizacji napędzanej silnikiem w poprzednio opisanej metodzie pozwoliło na wyizolowanie wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy, co skutkuje wysoce sprzężonymi mitochondriami, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Aktywność syntazy cytrynianowej służy jako miara integralności błon, ponieważ syntaza cytrynianowa znajduje się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej i w związku z tym nie powinna występować w zawiesinach mitochondriów z nienaruszonymi błonami. Rysunek 1 przedstawia aktywność syntazy cytrynianowej w niepoddanych sonikacji próbkach mitochondrialnych w porównaniu z próbkami poddanymi sonikacji z tej samej izolacji. Sonikacja mitochondriów prowadzi do statystycznie istotnego wzrostu aktywności syntazy cytry...

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Ogólnym celem niniejszego artykułu wideo jest izolacja wysokiej jakości mitochondriów z niewielkich ilości mięśnia szkieletowego myszy do zastosowania w testach tric opartych na mikropłytkach. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach biomedycznych, takie jak opisanie sposobu, w jaki określone leki i białka modulują pobór tlenu przez mitochondria w mięśniach szkieletowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość izolacji wysokiej jakości mitochondriów z mniejszych ilości mięśnia szkieletowego myszy, niż zgłaszano to wcześniej.Przeprowadź eutanazję myszy zgodnie z wytycznymi instytucji. Następnie ułóż mysz na boku i za pomocą nożyczek z cienkimi końcówkami wykonaj nacięcie skóry nad bocznym nadkłykciem kości udowej.Odsuń skórę w kierunku myszy, a następnie usuń tkankę tłuszczową znajdującą się nad punktem przyczepu mięśnia czworogłowego uda. Następnie przetnij ścięgno mięśnia czworogłowego przyczepione do rzepki. Powoli przetnij aponeurozę między kością a mięśniem czworogłowym, uważając, aby nie uszkodzić tętnicy udowej.Następnie przetnij ścięgno w punkcie przyczepu do kości udowej, aby uwolnić mięsień czworogłowy, i umieść mięsień czworogłowy w schłodzonym PBS. Za pomocą nożyczek usuń widoczną tkankę tłuszczową znajdującą się nad mięśniem czworogłowym. Po oczyszczeniu obróć mięsień czworogłowy tak, aby część mięśnia, która znajdowała się nad kością udową, była skierowana ku górze.Rozchyl mięsień czworogłowy za pomocą pęsety, wykonując ruch rozszerzający. Usuń dwie widoczne czerwone części mięśnia z każdego płata i umieść je w zlewce zawierającej pięć mililitrów schłodzonego buforu do izolacji mitochondriów.Następnie należy naciąć skórę nad ścięgnem Achillesa za pomocą nożyczek z cienkimi końcówkami i odsunąć skórę w kierunku głowy myszy. Przeciąć odsłonięte ścięgno Achillesa i odsunąć mięsień w stronę ciała myszy. Przeciąć ścięgno na wysokości kłykcia bocznego i przyśrodkowego kości udowej, aby uwolnić mięsień brzuchaty łydki, a następnie umieścić mięsień brzuchaty łydki wraz z przytwierdzonymi do niego ścięgnami w naczyniu wypełnionym schłodzonym PBS.Odwróć mięsień brzuchaty łydki i oddziel mięsień płaszczkowaty. Umieść mięsień płaszczkowaty w zlewce zawierającej 5 mL schłodzonego buforu do izolacji mitochondriów.Następnie wykonano nacięcie mięśnia brzuchatego łydki i usunięto trzy widoczne czerwone części mięśnia. Będą to dwie części boczne oraz jeden przyśrodkowy powierzchowny pas czerwonego mięśnia. Po wyizolowaniu przenieś czerwony mięsień do zlewki zawierającej pięć mililitrów schłodzonych mitochondriów.Bufor izolacyjny jeden. Usuń kolejne 75 do 100 miligramów mięśnia czerwonego z drugiej nogi myszy, powtarzając proces pokazany przed chwilą.Wypreparowany mięsień z drugiej nogi umieść w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej koktajl inhibitorów proteaz i fosfataz oraz bufor do lizy komórek, przygotowane zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Drugą próbkę natychmiast zamroź gwałtownie w ciekłym azocie w celu późniejszego wykorzystania w technice western blotting. Płaską, plastikową powierzchnię, wcześniej ogrzaną, umieść na lodzie w dużym wiadrze.Następnie nalej kroplę buforu do izolacji mitochondriów nr 1 na plastikową powierzchnię i za pomocą pęsety umieść wszystkie przekroje mięśnia czerwonego w kropli buforu do izolacji. Rozdrobnij tkankę mięśniową przez dwie minuty, używając jednokrawędziowych żyletek, wymieniając ostrze na nowe co 40 sekund. Przenieś rozdrobnioną tkankę do nowego zlewki z pięcioma mililitrami świeżego buforu do izolacji mitochondriów.Bufor izolacyjny jeden. Następnie należy przelać roztwór przez sitko komórkowe o oczkach 100 μm, umieszczone na probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Osuszyć tkankę delikatną chusteczką do wycierania, a następnie przenieść ją do 5 ml 0,05% roztworu trypsyny.Za pomocą pęsety usuń wszelką pozostałą tkankę z wycieraczki do zadań i dodaj ją do trypsyny. Inkubuj tkankę mięśniową w roztworze trypsyny na lodzie przez 30 minut. Następnie odwiruj próbkę z prędkością 200 ×g przez trzy minuty w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu odlać nadsącz trypsyny do pojemnika na odpady i resuspender osad w 3 ml lodowatego buforu do izolacji mitochondriów nr 1. Następnie przenieść tkankę do szklanej rurki do homogenizacji o pojemności 45 ml. Przepłukać stożkową rurkę 15 ml kolejnymi 1,5 ml buforu do izolacji mitochondriów nr 1, aby zebrać pozostałą próbkę, i dodać ją do szklanej rurki do homogenizacji.Następnie umieść szklaną probówkę do homogenizacji w zlewce lub plastikowym pojemniku wypełnionym w połowie lodem, tak aby szklany homogenizator poruszał się w zlewce w minimalnym stopniu. Zhomogenizuj próbkę za pomocą pestika z politetrafluoroetylenu przymocowanego do napędzanego silnikiem homogenizatora tkankowego.Homogenizator z końcówką 10 przy 80 RPM. W każdym cyklu przytrzymaj końcówkę na dnie przez około dwie sekundy. Następnie przenieś homogenat tkankowy do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.Następnie należy opłukać szklaną rurkę homogenizatora 6,5 ml buforu do izolacji mitochondriów nr 1. Bufor należy wlać do 15 ml stożkowej probówki zawierającej pozostałą część tkanki. Następnie homogenizować próbkę. Wirować próbkę z prędkością 700 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie delikatnie przelać nadsącz do wytrzymałej szklanej rurki wirówkowej i odrzucić osad.Następnie wiruj supernatant z prędkością 8,000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby uzyskać osad mitochondriów, zdejmij supernatant i resuspenduj osad, powoli dodając 500 µL buforu do izolacji mitochondriów dwa; odetnij końcówkę końcówki pipety i delikatnie homogenizuj osad w buforze, wykonując ruchy mieszające i mieszanie. Następnie dodaj kolejne 4,5 mL buforu do izolacji mitochondriów.Dodaj bufor dwa do mieszaniny. Po całkowitym zawieszeniu osadu, odwiruj homogenat z prędkością 8 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby ponownie uzyskać osad mitochondriów. Usuń supernatant i delikatnie, lecz całkowicie resuspenduj osad, dodając bufor dwa do izolacji mitochondriów w 2 inkrementach po 25 µL, używając końcówki pipety z odciętym czubkiem; po każdym dodaniu 25 µL buforu delikatnie zamieszaj i wymieszaj osad.Po zakończeniu procesu umieść ten zapas mitochondriów w lodzie. Przygotuj dwa osobne rozcieńczenia zapasu mitochondriów w wodzie o wysokiej czystości w stosunku od 1 do 20. Do jednej próbki dodaj 0,1% Triton 100 x i poddaj sonikacji przez 10 sekund przy niskim ustawieniu.Pozostałe rozcieńczenie pozostawić w lodzie, a próbkę poddaną sonikacji ponownie umieścić w lodzie. Po sonikacji przeprowadzić analizę aktywności syntazy cytrynianowej zarówno dla rozcieńczenia mitochondrialnego niepoddanego sonikacji, jak i tego poddanego sonikacji, stosując pomiar fotometryczny zgodnie ze standardowymi technikami; następnie wyznaczyć procent nienaruszonych błon mitochondrialnych, korzystając z równań podanych w towarzyszącym protokole tekstowym. Sonikacja mitochondriów prowadzi do statystycznie istotnego wzrostu aktywności syntazy cytrynianowej.Aktywność syntazy cytrynianowej w niepoddanych sonikacji próbkach mitochondrialnych w porównaniu z próbkami sonikowanymi wykazuje, że 92,5% mitochondriów pozostało nienaruszonych po izolacji. Ekspresja GA DH i COX four jest wyraźna w lizacie całej tkanki, natomiast w izolowanych mitochondriach obserwuje się ekspresję Cox four. Choć widoczne są jedynie słabe prążki GA DH, wyniki te wskazują na prawidłową izolację mitochondriów przy niewielkim zanieczyszczeniu komponentami niemitochondrialnymi podczas procedury izolacji.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z zapasem mitochondriów; nie wolno go wortexować ani energicznie mieszać po zakończeniu tej procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. czy dana interwencja wpływa na wytwarzanie reaktywnych form tlenu w izolowanych mitochondriach, można zastosować inne metody, takie jak pomiar produkcji reaktywnych form tlenu.

isolation-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Mitochondria są kluczowymi organellami metabolicznymi, które wykazują wysoki poziom plastyczności fenotypowej w mięśniach szkieletowych. Import białek z cytozolu jest krytycznym szlakiem biogenezy organelli, niezbędnym do ekspansji retikulum i utrzymania funkcji mitochondriów.  Dlatego import białka służy jako barometr zdrowia komórek.

Pomiar zdolności importowej białek z mitochondriów mięśni szkieletowych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Metoda enzymatycznej dysocjacji, znakowania powierzchniowego i oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej progenitorów fibro/adipogennych i miogennych z mięśni szkieletowych myszy.

Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Poznaj metodę izolacji mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych. Technika umożliwia badanie funkcji mitochondrialnej i wpływu substancji na metabolizm energetyczny.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Przeglądaj więcej filmów