Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbudowanie modelu do badania interakcji między pojedynczą bakterią a pojedynczym grzybem. Model ten może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji patogenów, takie jak czynniki zaangażowane w komunikację międzykomórkową i dialekt międzygatunkowy. Główną zaletą tej techniki jest to, że dane generowane przez ten model in vivo mają znaczenie kliniczne.

Aby podać grzyba donosowo, najpierw rozcieńczyć 2×10⁶ CFU C.albicans na mililitr w sterylnym PBS. Następnie, po potwierdzeniu utraty odruchu prostowania u dorosłej myszy hipotonicznej, pobrać co najmniej 50 µL zawiesiny grzybiczej za pomocą pipety 200 µL. Teraz chwycić mysz jedną ręką i obrócić zwierzę tak, aby spoczywało na grzbiecie brzuchem skierowanym do góry.

Gdy mysz znajduje się w odpowiedniej pozycji, należy użyć palca wskazującego ręki trzymającej zwierzę do podtrzymania głowy, a kciuka do utrzymania zamkniętej szczęki, a następnie zbliżyć końcówkę pipety do nosa zwierzęcia. Następnie należy ostrożnie nanieść kroplę 50 µL grzyba na nozdrza, pozwalając, aby kropla została wciągnięta podczas spontanicznego oddychania myszy. Po wszystkim mysz należy umieścić pojedynczo w klatce do czasu całkowitego dojścia do siebie.

Cztery dni po inokulacji C.albicans, ogolić brzuch uśpionego zwierzęcia, a następnie przeprowadzić sterylizację odsłoniętej skóry etanolem. Następnie za pomocą nożyczek otworzyć skórę od mostka do środkowej części brzucha. Po tym rozszerzyć nacięcie wzdłuż klatki piersiowej po obu stronach linii środkowej i odchylić skórę na boki w obrębie klatki piersiowej.

Po odsłonięciu klatki piersiowej należy wykonać pionowe nacięcia po obu stronach klatki piersiowej w kierunku obojczyków, a następnie odchylić całą przednią ścianę klatki piersiowej, wykorzystując mostek, aby uwidocznić serce i płuca. Następnie, używając strzykawki uprzednio przepłukanej heparyną, należy nakłuć serce w pobliżu tętnicy międzykomorowej i pobrać co najmniej 500 µL krwi. Próbkę krwi należy umieścić w lodzie.

Następnie wykonaj nacięcie szyjne w linii środkowej, aby odsłonić tchawicę. Ostrożnie rozdziel powięź wokół tchawicy, a następnie umieść szew pod tchawicą. Po tym użyj zmodyfikowanej igły do gavage o rozmiarze 20G, aby wprowadzić cewnik do tchawicy, mocując kaniulę wcześniej założonym szwem.

Aby przeprowadzić płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe, należy delikatnie wprowadzić 500 µL lodowatego PBS do płuca. Następnie należy odessać płyn z płukania i przenieść go do probówki wirówkowej o pojemności 2 mL umieszczonej w lodzie. Po pobraniu kolejnych dwóch próbek po 500 µL, należy wyjąć płuca z klatki piersiowej i umieścić fragment płuca w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 mL w celu natychmiastowego zamrożenia w temperaturze -80 °C.

Następnie umieść kolejny fragment tkanki płucnej w uprzednio zważonej probówce do hemolizy zawierającej PBS, utrzymując ją w lodzie. Na koniec wykonaj nacięcie w lewej części jamy brzusznej. Pobierz śledzionę do drugiej probówki do hemolizy zawierającej 1 ml PBS i umieść probówkę w lodzie.

Model czterodniowej persistencji uzyskuje się poprzez podanie donosowe pięciu razy 10⁵ CFU C.albicans na mysz. W ciągu tych czterech dni myszy przybierają na wadze, lecz nie wykazują uszkodzeń płuc. Jednak wraz ze wzrostem CFU inokulum nasila się uszkodzenie płuc.

Maksymalne uszkodzenie płuc zaobserwowano między 24 a 36 godzinami po zakażeniu. Z kolei obciążenie bakteryjne wykazuje spadek o jeden log CFU na mililitr co 24 godziny, przy jednoczesnym obserwowanym każdego dnia przyrostie skumulowanego rozsiewu bakterii. W płuczce oskrzelowo-pęcherzykowej pobranej od zakażonych myszy stwierdzono szeroką rekrutację neutrofili, a różnicowe liczenie komórek wykazało populację naciekających komórek odpornościowych składającą się w 90% z neutrofili i w 10% z makrofagów i limfocytów.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak analiza płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące charakterystyki odpowiedzi zapalnej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zbudować kolonizację Pseudomonas. Należy pamiętać, że praca z luminescencyjną Candida może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odzieży ochronnej, aby uniknąć kontaminacji kropelkowej.