Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza
13 stycznia 2016
Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.
Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie modelu do badania interakcji między pojedynczą bakterią a pojedynczym grzybem. Wiadomość ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji patogenów, takie jak czynniki zaangażowane w przesłuchy i dialekt międzygatunkowy. Główną zaletą tej techniki jest to, że dane wygenerowane z tego modelu in vivo mają znaczenie kliniczne.
Aby zainstalować grzyba donosowo, najpierw rozcieńczyć dwa razy dziesięć do szóstego CFU C.albicans na mililitr w sterylnym PBS. Następnie, po potwierdzeniu utraty odruchu prostowania u dorosłej myszy hipotonicznej, należy odessać co najmniej 50 mikrolitrów zawiesiny grzybów do pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Teraz chwyć mysz jedną ręką i obróć zwierzę tak, aby leżało na plecach z brzuchem skierowanym do pionu.
Gdy mysz znajduje się na swoim miejscu, użyj palca wskazującego ręki trzymającej mysz, aby podeprzeć głowę, a kciuka, aby utrzymać szczękę zamkniętą, i przesuń końcówkę pipety blisko nosa zwierzęcia. Następnie ostrożnie dozuj 50-mikrolitrową kroplę grzyba do nozdrzy, umożliwiając wdychanie kropli przez spontaniczny oddech myszy. I umieść mysz samą w klatce, aż w pełni wyzdrowieje.
Cztery dni po instalacji C. albicans należy ogolić brzuch zwierzęcia poddanego eutanazji, a następnie poddać odsłoniętej skórze sterylizację etanolem. Następnie użyj nożyczek, aby otworzyć skórę od mostka do połowy brzucha. Następnie przedłuż nacięcie wzdłuż klatki piersiowej po obu stronach linii środkowej i odchyl skórę po obu stronach klatki piersiowej.
Kiedy klatka piersiowa jest widoczna, wykonaj pionowe nacięcie po obu stronach klatki piersiowej w kierunku obojczyków i użyj mostka, aby odchylić całą przednią ścianę klatki piersiowej, aby uwidocznić serce i płuca. Następnie za pomocą strzykawki z heparyną należy nakłuć serce obok tętnicy śródkomorowej i pobrać minimum 500 mikrolitrów krwi. Umieść próbkę krwi na lodzie.
Następnie wykonaj nacięcie szyjki macicy w linii środkowej, aby odsłonić tchawicę. Ostrożnie rozetnij powięź wokół tchawicy, a następnie umieść szew pod tchawicą. Następnie za pomocą zmodyfikowanej igły do głębka o rozmiarze 20 należy cewnikować tchawicę, zabezpieczając kaniulę wcześniej założonym szwem.
Aby wykonać płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, delikatnie dozuj 500 mikrolitrów lodowatego PBS do płuc. Następnie odessać płyn z płukania i przenieść płyn do dwumililitrowej probówki wirówkowej na lodzie. Po pobraniu dwóch kolejnych próbek o pojemności 500 mikrolitrów usuń płuca z klatki piersiowej i umieść kawałek płuca w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej w celu natychmiastowego przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Następnie umieść kolejny kawałek tkanki płucnej w wstępnie zważonej probówce do hemolizy zawierającej PBS na lodzie. Na koniec wykonaj nacięcie po lewej stronie brzucha. Zbierz śledzionę do drugiej probówki do hemolizy zawierającej jeden mililitr PBS i umieść probówkę na lodzie.
Model trwałości czterodniowej uzyskuje się przez instalację donosową pięć razy dziesięć do piątej CFU C. albicans na mysz. W ciągu tych czterech dni myszy przybierają na wadze, ale nie wykazują uszkodzenia płuc. Jednak wraz ze wzrostem CFU inokulum dochodzi do uszkodzenia płuc.
Maksymalne uszkodzenie płuc obserwowane jest od 24 do 36 godzin po zakażeniu. Z kolei obciążenie bakteryjne wykazuje spadek o jeden log CFU na mililitr co 24 godziny, przy czym skumulowany wzrost rozprzestrzeniania się bakterii obserwuje się z każdym dniem. W popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych pobranych od zakażonych myszy neutrofile są szeroko rekrutowane, a różnicowa liczba komórek wykazuje 90 procent neutrofili i 10 procent limfocytów makrofagów naciekających populację komórek odpornościowych.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak analiza płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące charakterystyki odpowiedzi zapalnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbudować kolonizację Pseudomonas. Nie zapominaj, że praca z luminescencyjnym Candida może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie odzieży ochronnej, aby uniknąć zanieczyszczenia kropelkami, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Badanie to stworzyło model na myszach w celu zbadania interakcji między Candida albicans a Pseudomonas aeruginosa w kontekście zapalenia płuc związanego z wentylacją. Model ma na celu wyjaśnienie złożonych reakcji immunologicznych zaangażowanych w te interakcje patogenów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Immunologia
- Interakcje patogenów
Tło
- Badania in vitro dostarczają informacji na temat reakcji immunologicznych.
- Modele in vivo są niezbędne do zrozumienia złożonych interakcji.
- Zapalenie płuc związane z wentylacją jest istotnym klinicznym problemem.
- Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa są częstymi patogenami w takich infekcjach.
Cel badania
- Opracowanie modelu do badania interakcji między bakterią a grzybem.
- Identyfikacja czynników zaangażowanych w komunikację międzygatunkową.
- Generowanie klinicznie istotnych danych z badań in vivo.
Zastosowane metody
- Wdrożenie donosowe Candida albicans u myszy.
- Zastosowanie hipotonicznego modelu myszego do obserwacji reakcji.
- Ocena odruchu szybkiego wyprostowania jako wskaźnika zdrowia.
- Analiza interakcji mikrobiologicznych w środowisku płucnym.
Główne wyniki
- Ustawienie wiarygodnego modelu muryny do badania interakcji patogenów.
- Identyfikacja kluczowych czynników w komunikacji międzygatunkowej między Candida i Pseudomonas.
- Demonstracja istotności klinicznej modelu.
- Wgląd w patogeniczność zapalenia płuc związanego z wentylacją.
Wnioski
- Opracowane model jest skuteczny w badaniu złożonych interakcji mikrobiologicznych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia patogenezy zapalenia płuc związanego z wentylacją.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym modelu w celu zbadania interwencji terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Modeling host-mediated interactions between Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa in vivo addresses a critical gap in understanding polymicrobial dynamics relevant to airway infections. This approach enables mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses by capturing immune complexity and pathogen cross-talk not accessible in vitro. The model supports predictive confidence for translational research targeting ventilator-associated and chronic lung infections.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen and interspecies signaling pathways in a physiologically relevant context.
- Supports biological de-risking by revealing immune cell recruitment and inflammatory profiles during co-infection.
- Facilitates functional target validation for interventions modulating microbial interactions or immune responses.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for downstream analysis of immune cell populations and pathogen burden.
- Enables quantitative assessment of neutrophil and macrophage infiltration via bronchoalveolar lavage.
- Supports reproducible measurement of microbial load and tissue injury for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for chronic lung infection and ventilator-associated pneumonia.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of anti-infective or immunomodulatory strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling clinically relevant pathogen interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This in vivo model bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing of microbial and immune interactions in the airway. It provides a platform for lead identification and mechanistic de-risking in infection biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of cross-kingdom pathogen interactions and immune modulation.
- Screening: Delivers quantitative outputs on pathogen burden and immune cell recruitment for comparative studies.
- Analytics: Enables statistical analysis of microbial load, immune infiltration, and tissue injury across experimental conditions.
- Translational Research: Models clinically relevant infection scenarios for biomarker and therapeutic evaluation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable in vivo platform adaptable to other polymicrobial or host-pathogen studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection biology.
- Operational Value: Standardizes in vivo infection protocols and immune readouts for reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for anti-infective and immunomodulatory programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates targeting polymicrobial or immune-mediated pathologies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine infection models and immune cell analysis.
- Needs access to animal facilities, biosafety protocols, and analytical infrastructure for lavage and tissue processing.
- Demands cross-team standardization of inoculum preparation, infection timing, and sample collection.
- Adaptation may be needed for different microbial species or host genetic backgrounds.
- Safety precautions are essential when handling luminescent Candida or infectious agents.
