Name: In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj model in vitro przepływu krwi do badania odpowiedzi komórek śródbłonka na zmiany morfologii i ekspresji białek. Ta metoda pozwala symulować warunki fizjologiczne i patologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną wskazać źródła finansowania, w tym AHA (13GRNT16990019 do WT) i NHLBI (HL097246 i HL119371 do WT).

1. Silanizacja i funkcjonalizacja biomolekułami szkiełka lub membrany poliwęglanowej
Uwaga: Wiele substancji chemicznych i roztworów stosowanych w tym protokole charakteryzuje się wysokim tempem parowania (etanol (EtOH), aceton itp.). Inne etapy wymagają długich czasów inkubacji, aby zminimalizować parowanie. W celu uszczelnienia pojemników zaleca się stosowanie folii Parafilm. Ostrożnie: Wiele z chemikaliów (w tym: kwas siarkowy, aceton, (3-aminopropyl)trietoksysilan, glutaraldehyd, EtOH) jest uznawanych za niebezpieczne lub lotne. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki (MSDS) każdego materiału w celu zapewnienia właściwego przechowywania, obchodzenia się z nimi oraz utylizacji.
<ol>
	<li>Umieść nową szkiełko przedmiotowe o wymiarach 75 mm na 50 mm na 1 mm w czystej, szklanej kuwecie do barwienia, bez względu na orientację, zapewniając całkowite zanurzenie. Używaj tego pojemnika w krokach 1.1-1.12. 
	Uwaga: W przypadku kokultury, we wszystkich kolejnych krokach dotyczących funkcjonalizacji PC i wysiewu EC należy uwzględnić membranę z poliwęglanu (PC) o rozmiarze porów 0,4 mikrona, dociętą do rozmiaru 75 mm na 50 mm.</li>
	<li>Zanurz szkiełko w kwasie siarkowym (20%) na noc (O/N). 
	Ostrzeżenie: Przed użyciem zapoznaj się z kartą charakterystyki (MSDS) kwasu siarkowego.</li>
	<li>Umyj szkiełko, zanurzając je w wodzie dejonizowanej (DI) przez 5 min, trzykrotnie, za każdym razem wymieniając wodę DI.</li>
	<li>Zanurz szkiełko w acetonie na 30 min. 
	Ostrzeżenie: Przed użyciem zapoznaj się z kartą charakterystyki (MSDS) acetonu.</li>
	<li>Zanurz szkiełko w 6% roztworze (3-aminopropyl)trietoksysilanu w acetonie na noc (O/N). 
	Ostrzeżenie: Przed użyciem zapoznaj się z kartą charakterystyki (MSDS) (3-aminopropyl)trietoksysilanu i acetonu.</li>
	<li>Zanurz szkiełko w acetonie przez 5 min, trzykrotnie, za każdym razem wymieniając aceton. 
	Ostrzeżenie: Przed użyciem zapoznaj się z kartą charakterystyki (MSDS) acetonu.</li>
	<li>Umyj szkiełko, zanurzając je w wodzie DI przez 5 min, trzykrotnie, za każdym razem wymieniając wodę DI.</li>
	<li>Zanurz szkiełko w 1,5% roztworze glutaraldehydu w wodzie DI na 60 min. 
	Ostrzeżenie: Przed użyciem zapoznaj się z kartą charakterystyki (MSDS) glutaraldehydu.</li>
	<li>Umyj szkiełko, zanurzając je w wodzie DI przez 5 min, dwukrotnie, za każdym razem wymieniając wodę DI.</li>
	<li>Umieść szkiełka w 70% etanolu (EtOH) na 30 min w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Usun EtOH i pozwól pozostałym resztkom odparować. Zanurz szkiełka w sterylnym DI i odlej nadmiar wody, aby rehydratować szkiełka. 
	Uwaga: Szkiełka lub membrana PC mogą zostać zamknięte w uchwycie do szkiełek i przechowywane w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia. Przed użyciem do hodowli komórkowej powtórz kroki 1.10 i 1.11.</li>
	<li>Wyjmij szkiełko z uchwytu i umieść je w kwadratowej szalce Petriego o wymiarach 100 mm na 100 mm w komorze z laminarnym przepływem powietrza. 
	Uwaga: Ten pojemnik będzie używany we wszystkich pozostałych krokach.
	<ol>
		<li>Przygotuj szkiełko lub membranę PC do wysiewu komórek śródbłonka do eksperymentu z monokulturą.
		<ol>
			<li>Pokryj funkcjonalizowane szkiełko lub membranę PC (krok 1.11) 1 ml roztworu fibronektyny (25 μg/ml) z jednej strony, pokrywając przybliżony obszar wystawiony na działanie komory hodowli komórkowej.</li>
			<li>Inkubuj szkiełka lub membranę PC w sterylnym inkubatorze ustawionym na 37 °C przez 1-2 h.</li>
			<li>Po inkubacji odessaj pozostały roztwór za pomocą szklanej pipety aspiracyjnej podłączonej do próżni. 
			Uwaga: Szkiełka mogą być teraz przechowywane na noc (O/N) w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj kroki 1.12.2 wyłącznie w celu przygotowania kokultury EC/SMC. Przygotuj i wysiej kulturę komórek mięśni gładkich (SMC) do eksperymentu z kokulturą.
		<ol>
			<li>Umieść uszczelkę silikonową na wierzchu szkiełka (krok 1.11) o średnicy zewnętrznej 75 mm na 50 mm, średnicy wewnętrznej 50 mm na 30 mm, grubości 0,5 mm i perforacjach dopasowanych do próżni komory przepływowej.</li>
			<li>Przygotuj 1 ml zawiesiny SMC w 10% FBS/DMEM. Zneutralizuj 1 ml roztworu kolagenu typu I o stężeniu 2 mg/ml za pomocą 7% roztworu NaHCO3 i 0,1 M NaOH do pH 7,4, a następnie wymieszaj z zawiesiną SMC do uzyskania końcowej gęstości komórek 2 x 106 komórek/ml.</li>
			<li>Rozprowadź roztwór SMC wewnątrz uszczelki i inkubuj szkiełka w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 min.</li>
			<li>Po inkubacji pokryj szkiełko 25 ml 0,1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zmieszanej z pożywką DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) na 72 h.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj komórki śródbłonka (ECs) na szkiełku szklanym/membranie poliwęglanowej.
	<ol>
		<li>Wysiej 1 ml ECs w 10% FBS/DMEM, z początkowym stężeniem 6,0 x 105 komórek/ml, na powierzchnie pokryte fibronektyną szkiełka szklanego lub membrany poliwęglanowej.</li>
		<li>Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 10% FBS przez 120 min.</li>
		<li>Pokryj szkiełka z komórkami dodatkowym 10% FBS/DMEM i umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na noc (O/N), aż osiągną 70%-80% konfluencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wyznaczanie lepkości cieczy i objętościowego natężenia przepływu
Uwaga: Rotacyjne wiskozymetry są urządzeniami precyzyjnymi, dlatego przed kalibracją, zerowaniem lub przeprowadzaniem pomiarów należy zapoznać się z instrukcją obsługi wiskozymetru.
<ol>
	<li>Wyznaczyć pożądaną wartość naprężenia ścinającego płynu (τ) na podstawie literatury dotyczącej docelowego układu naczyniowego w eksperymencie.</li>
	<li>Zmierzyć lepkość (μ) 1% FBS/DMEM za pomocą wiskozymetru rotacyjnego.</li>
	<li>Wyznaczyć wymaganą objętościową prędkość przepływu (Q) z równania Poiseuille'a: 
	<img alt="Wzór na naprężenie ścinające, równanie τ; dynamika płynów, analiza lepkości; wyprowadzenie matematyczne." src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">, 
	gdzie τ = naprężenie ścinające płynu, μ = lepkość, Q = objętościowa prędkość przepływu, w = szerokość komory, a h = wysokość komory).</li>
	<li>Ustawić pompę na prędkość przepływu wyznaczoną w kroku 2.3 i stosować ją we wszystkich kolejnych etapach.</li>
</ol>
3. Wyznaczenie indeksu pulsacyjności
Uwaga: Wszystkie porty połączeniowe w systemie powinny być połączone za pomocą odpowiednio dobranych złączy pierścieniowych z kolcem lub żeńskich złączy luer z kolcem. Następnie do złączy z kolcem można podłączyć rurki z PVC, aby zamknąć obwód.
<ol>
	<li>Podłączyć obwód przepływowy zgodnie z Rysunkiem 2, z komorą tłumiącą (Rysunek 3) oraz ultradźwiękowym przepływomierzem w odpowiednim kierunku przepływu. 
	Uwaga: Ultradźwiękowy przepływomierz jest czułym urządzeniem; przed użyciem należy zapoznać się z instrukcją obsługi.</li>
	<li>Wypełnić obwód przepływowy i zbiornik wodą DI, upewniając się, że rurka wylotowa zbiornika (do pompy) jest zanurzona w objętości zbiornika. Zwizualizować przebieg fali przepływu za pomocą przepływomierza.</li>
	<li>Otworzyć zawór odpowietrzający w komorze tłumiącej, aby zmienić stosunek objętości cieczy do powietrza. Zamykać zawór odpowietrzający w różnych odstępach poziomów cieczy i obliczyć indeks pulsacyjności (PI = (VMax - VMin) / VMean), korzystając z szczytu (VMax), dołka (VMin) oraz średniej (VMean) przebiegu fali przepływu. Zapisać wartości PI w notatniku.</li>
	<li>Zaznaczyć otrzymany poziom cieczy i PI na komorze tłumiącej za pomocą permanentnego pisaka z włókniną do późniejszego użytku. Określić pożądane poziomy PI na podstawie literatury patologicznej11.</li>
	<li>Formowanie rurek silikonowych – opcjonalna, bardziej zaawansowana metoda kontrolowania pulsacyjności
	<ol>
		<li>Wymieszać bazę elastomeru silikonowego i utwardzacz w różnych proporcjach (np. stosunek bazy do sieciującego od 10:1 do 36:1) dla różnych docelowych modułów sprężystości, zgodnie z wcześniejszą ilustracją.2</li>
		<li>Wyprodukować rurki silikonowe poprzez powtarzalny proces zanurzania i utwardzania, krótko zanurzając stalową kaniulę (14 G) w mieszaninie prepolimeru silikonowego o określonym stosunku bazy do sieciującego.</li>
		<li>Umieścić kaniulę pokrytą prepolimerem w piekarniku ustawionym na 60 °C na 4 hr, aby utwardzić powłokę polimerową na kaniuli, zmieniając jej kierunek w połowie procesu utwardzania.</li>
		<li>Powtórzyć proces zanurzania z tą samą mieszaniną elastomeru silikonowego i ponownie umieścić w piekarniku na kolejne 4 hr, co pozwoli uzyskać rurki o grubości ~0.3 mm.</li>
		<li>Zdjąć ultracienką rurkę silikonową ze stalowej kaniuli.</li>
		<li>Podłączyć rurki do obwodu przepływowego zamiast komory tłumiącej i przetestować PI dla każdej z nich zgodnie z punktem 3.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Sterylizacja pompy
<ol>
	<li>Zanurzyć komorę przepływową (Rysunek 2), rurki PVC oraz uszczelki w 10% nadtlenku wodoru (H2O2). Przed krokiem 4 wypłukać sterylną wodą dejonizowaną (DI).</li>
	<li>Umieścić pompę do krwi na wolnej półce inkubatora. 
	Uwaga: Półki inkubatora powinny być wykonane ze stali nierdzewnej i być w stanie utrzymać ciężar całego obiegu przepływowego.</li>
	<li>Wypełnić obieg przepływowy i zbiornik 10% H2O2, upewniając się, że rurka wylotowa zbiornika (do pompy) jest zanurzona w objętości zbiornika. Cyrkulować H2O2, pompując roztwór przez obieg przez 20 min w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy włączonym świetle UV.</li>
	<li>Odssać cały H2O2 z rurek i wypłukać sterylnym PBS, pompując go przez obieg przepływowy.</li>
</ol>
5. Montaż komory przepływowej
Uwaga: Komora przepływowa składa się z akrylowej płyty wykonanej na zamówienie, z portami próżniowymi oraz wlotowym i wylotowym portem przepływu (patrz Rysunek 2). Montaż komory polega na umieszczeniu komory przepływowej i uszczelek na szkiełkach do hodowli, przy zachowaniu odpowiedniego wyrównania, co opisano poniżej.
<ol>
	<li>Podgrzać 1% FBS/DMEM w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i przygotować komorę przepływową.
	<ol>
		<li>Wyjąć preparat z EC z medium (z kroku 1.13) i nałożyć na niego uszczelkę stroną z komórkami do góry.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Wyjąć membranę PC z medium (z kroku 1.13) i nałożyć na nią uszczelkę stroną z komórkami do góry. Pod membraną PC umieścić preparat z kokulturą z wysianymi SMC (krok 1.12.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównać kanał próżniowy komory przepływowej z otworami w uszczelce (Rycina 2).</li>
	<li>Podłączyć rurkę próżniową do portów próżniowych (Rycina 2), upewniając się, że medium nie wycieka do układu próżni.</li>
	<li>Umieścić arkusz poliwęglanowy pod szkiełkiem przedmiotowym i zacisnąć zespół komory przepływowej za pomocą zacisków sprężynowych, po jednym z każdej strony komory przepływowej (Ryciny 2 oraz 5).</li>
	<li>Umieścić system przepływowy w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, a następnie napełnić obieg medium, pompując je z wypełnionego zbiornika przy niskiej pulsacyjności. Utrzymywać ten przepływ przez 4 hr w celu wstępnego kondycjonowania komórek.</li>
	<li>Dostosować objętość cieczy w komorze tłumiącej do zaznaczonego poziomu PI i inkubować przez wymagany czas.</li>
</ol>

<ol><li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening-Induced+High+Pulsatility+Flow+Activates+Endothelial+Inflammation+via+a+TLR2%2FNF-%CE%BAB+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102195(2014).</li>
<li>Wexler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+Artery+Calcification%3A+Pathophysiology%2C+Epidemiology%2C+Imaging+Methods%2C+and+Clinical+Implications+A+Statement+for+Health+Professionals+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association.</a> Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).</li>
<li>Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+fibrosis+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Pathol%22%5BJournal%5D)">Vascular fibrosis in atherosclerosis.</a> Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).</li>
<li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+endothelial+recovery+and+reducing+neointimal+hyperplasia+using+sequential-like+release+of+acetylsalicylic+acid+and+paclitaxel-loaded+biodegradable+stents%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents.</a> Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).</li>
<li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Remodeling+in+Hypertension+Roles+of+Apoptosis+Inflammation%2C+and+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis.</a> Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).</li>
<li>Greil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+carotid+artery+flow+velocities+after+stent+implantation%3A+a+fluid+dynamics+study+with+laser+Doppler+anemometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endovasc+Ther%22%5BJournal%5D)">Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry.</a> J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).</li>
<li>Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+as+biomechanical+sensors+in+regulating+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function.</a> Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).</li>
<li>Liu, S. Q., Goldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+shear+stress+in+the+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+T+Bio-Med+Eng%22%5BJournal%5D)">Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration.</a> IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).</li>
<li>Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+pulsatility+flow+stimulates+smooth+muscle+cell+hypertrophy+and+contractile+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Lung+C%22%5BJournal%5D)">High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression.</a> AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).</li>
<li>Panaritis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatility+Index+of+Temporal+and+Renal+Arteries+as+an+Early+Finding+of+Arteriopathy+in+Diabetic+Patients.%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients.</a> Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).</li>
<li>Miao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Flow+Patterns+on+the+Localization+and+Expression+of+VE-Cadherin+at+Vascular+Endothelial+Cell+Junctions%3A+In+vivo+and+in+vitro+Investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations.</a> J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje metodę odtwarzania przepływu pulsacyjnego in vitro i może być podstawowym pierwszym krokiem w określaniu udziału warunków przepływu w patologiach chorobowych. Wcześniejsze badania z wykorzystaniem tego protokołu wykazały, że warunki przepływu przyczyniają się do naczyniowej odpowiedzi zapalnej. 1,10 Ponadto protokół ten jest przeznaczony dla doświadczonych laboratoriów. W związku z tym nie opisano tu ani dogłębnej mechaniki płynów, ani analizy biochemicznej. Aby uzyskać...

Wskaźniki zachorowalności na choroby sercowo-naczyniowe są największe w Ameryce, a wiele z nich wynika z niezdrowego układu krwinek. Zdrowe tętnice składają się z elastycznej tkanki z miękką powierzchnią światła pokrytą monowarstwą komórek śródbłonka (EC). Przepływ tętniczy można modelować jako funkcję fali oscylacyjnej o dodatnim średnim natężeniu przepływu. Wskaźnik pulsatywności (PI) jest ilorazem wielkości oscylacji i średniego przepływu (PI = (maks. - min.) / średnia),1 i został zamodelowany in vitro ze zmienną elastycznością naczyń. 2 Elastyczność tętnic jest ważna w magazynowaniu energii przepływu ze skurczów serca, rozszerzania się pod ciśnieniem skurczowym i odgrywa znaczącą rolę w modulowaniu przepływu krwi PI. Ponieważ serce utrzymuje stały, pulowy, objętościowy przepływ, rozszerzenie tętnic zwiększa pole przekroju poprzecznego, zwiększając stabilność przepływu poprzez zmniejszenie prędkości przepływu, naprężeń ścinających i PI. Często w niezdrowych tętnicach występują zmiany elastyczności lub podatności, wykazując usztywnienie spowodowane przebudową naczyń krwionośnych, bliznowatą tkanką lub zwapnieniem 3,4. Ponadto inne zaburzenia naczyniowe, takie jak przerost neointimy (NIH),5 tętniak inadciśnienie6 oraz zwłóknienie naczyń4, mogą zwężać średnicę naczynia. Jednak obecne leczenie farmakologiczne i leczenie za pomocą urządzeń w chorobach naczyniowych często zaniedbuje znaczenie zgodności ścian naczyń lub dynamiki przepływu krwi w chorobie naczyniowej, która często jest skomplikowana przez zmiany w morfologii i właściwościach naczyń. Ani angioplastyka balonowa, ani stentowanie nie rozwiązują problemu elastyczności ścian7. Dlatego modelowanie in vitro przepływów krwi wynikających z choroby tętnic i leczenia jest ważne w badaniu patologii chorobowych i przyszłej skuteczności leczenia. W niniejszym artykule opisano metodę replikacji fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi przeznaczoną do określenia odpowiedzi komórek w patologiach chorób naczyniowych. Przepływ płynu powoduje naprężenie ścinające na ścianie naczynia, co jest ważnym sygnałem mechanicznym dla zdrowia naczynia, wpływającym na wszystkie komórki w obrębie układu naczyniowego. Zidentyfikowano kilka mechanicznych czujników na śródbłonku naczyniowym do ścinania płynu, w tym rzęski pierwotnej, które wykazano w ostatnich badaniach nad mechanosensacją śródbłonka8. Na aktywność i morfologię komórek śródbłonka ma wpływ prędkość, kierunek i pulsacja przepływu. Dodatkowo, na migrację komórek mięśni gładkich (SMC) mogą wpływać sygnały mechaniczne przepływu o niskiej prędkości przez płyn śródmiąższowy9, a także mogą być przenoszone przez sygnalizację parakrynną z komórek śródbłonka poprzez ich odpowiedź na przepływ i mechano-transdukcję sygnałów przepływu poprzez uwalnianie cytokin10. Zależność od "dawki" średniego ścinania, PI i sygnalizacji parakrynnej może być również współzależna. W tym celu określenie odpowiedzi komórek naczyniowych na ścinanie płynu przy zróżnicowanym "dawkowaniu" w hodowli jednowarstwowej lub kokulturze in vitro może dostarczyć mechanistycznych informacji na temat przebudowy naczyń krwionośnych i poprawić przewidywanie chorób i leczenia. System przepływu zastosowany w tym eksperymencie składa się z pompy krwi, zbiornika powietrza tłumiącego przepływ przed przepływem, przepływomierza używanego tylko podczas konfiguracji eksperymentalnej, hodowli komórkowej za nim, komory przepływu z równoległą płytką i zbiornika pożywki. Kontrolę zmiennych przepływu naczyniowego, takich jak średnie natężenie przepływu, uderzenia na minutę i PI, można osiągnąć poprzez kontrolowanie natężenia przepływu, częstotliwości impulsów i wprowadzenie tłumienia ciśnienia. Pulsacyjne pompy krwi są dostępne ze zmiennym przemieszczeniem skoku, przy kontrolowanej częstotliwości udaru, odnoszącej się bezpośrednio do średniego objętościowego natężenia przepływu i częstotliwości tętna. Wprowadzenie zbiornika powietrza w obiegu przepływu pozwala na tłumienie ciśnienia, zmniejszając wielkość oscylacji przepływu. Media są nieściśliwym płynem, podczas gdy powietrze w komorze tłumienia jest ściśliwe, co pozwala na pochłanianie nadmiernego ciśnienia z fali przepływowej przez sprężanie powietrza. Stosunek powietrza do mediów pozwala na kontrolę nad stopniem tłumienia. Z akrylu stworzono niestandardową komorę przepływową do hodowli komórkowych o długości 75 mm i szerokości 50 mm. Przepływ wchodzi przez otwór wlotowy i rozszerza się przez kolektor wlotowy, zapewniając stały przepływ w całej komorze przepływowej. Podobny przepływ i struktury występują na wylocie z komory. Komórki są wysiewane na funkcjonalizowanych szkiełkach, a następnie umieszczane w komorze przepływowej. Pozwala to na uzyskanie dużych populacji, które można łatwo odzyskać po badaniu. Eksperymenty z kokulturami mogą wykorzystywać porowatą membranę poliwęglanową w celu wyeliminowania kontaktu między komórkami między kulturami, umożliwiając jednocześnie transport cytokin/przepływ. System ten był wcześniej używany do modelowania wysokiego przepływu PI i jego wpływu na hodowlę jednowarstwową śródbłonka i kokulturę EC/SMC 1,10, w celu zbadania odpowiedzi komórek na chorobę o patologicznie wysokim PI. Opisując protokół używany do modelowania tych warunków przepływu, mamy nadzieję pomóc innym w określeniu udziału sygnału przepływu w odpowiedzi komórki.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szkiełkowe (70&#160; mm x 50&#160; mm)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Membrana poliwęglanowa</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td>HTTP09030</tr><tr><td>Uszczelka silikonowa</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>RD 475464</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna (25 &mu; g / ml)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>36486</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> tłumiąca <td>Ta komora jest wykonana na zamówienie i można ją zamówić przy użyciu rysunku technicznego Rysunek 3.</td></tr><tr><td>Pompa krwi</td><td>Aparat Harvard</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>rurki z poliwęglanu winylu</td><td>US Plastik</td><td>65066, 65063, 65062</td><td>Mogą być wymagane różne rozmiary</td></tr><tr><td>Połączenia Luer</td><td>Nordson Medical</td><td>Różne</td><td>Wymagane będą różne rozmiary, a do wymiany należy zakupić pewną liczbę części.</td></tr><tr><td>Komora hodowlana</td><td>Obrabiany we własnym</td><td>zakresie</td><td>akryl na zamówienie można kupić w arkuszach i obrobić zgodnie z przeznaczeniem. Rysunek techniczny pokazany na Rysunek 2 może być użyty do odtworzenia tej komory.</td></tr><tr><td>Kwadratowa szalka Petriego</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-14007-10</td><td></td></tr><tr><td>Szklany uchwyt na szkiełko</td><td>Capitol Scientific</td><td>WHE-900303</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle Medium</td><td>Mediatech, Inc. firmy Dulbecco</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Przepływomierz</td><td>Sonotec, GmbH</td><td>Sonoflow co.55/060</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów Sylgard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td></td></tr><tr><td>14 G Kaniula stalowa</td><td>Ogólne zaopatrzenie</td><td>laboratoryjne S8365-1</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Choroby naczyniowe są częstą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badania wpływu dynamiki przepływu na patologie chorób naczyniowych. Niezdrowe tętnice często objawiają się usztywnieniem ścian, bliznowaceniem lub częściowym zwężeniem, które mogą wpływać na szybkość przepływu płynów i wielkość przepływu pulsacyjnego lub wskaźnik pulsacji. Odtworzenie różnych warunków przepływu jest wynikiem dostrojenia komory tłumiącej ciśnienie przepływu za pompą krwi. Wprowadzenie powietrza do zamkniętego systemu przepływu pozwala ściśliwemu medium na pochłanianie pulsacyjnego ciśnienia z pompy, a tym samym zmianę wskaźnika pulsacji. Opisana tutaj metoda jest po prostu odtworzona, z wysoce kontrolowanymi danymi wejściowymi i łatwo mierzalnymi wynikami. Pewne ograniczenia polegają na odtwarzaniu złożonego fizjologicznego kształtu fali impulsowej, który jest tylko przybliżony przez system. Na komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich i fibroblasty wpływa przepływ krwi przez tętnicę. Składnik dynamiczny przepływu krwi zależy od pojemności minutowej serca i podatności ściany tętnicy. Mechaniczna transdukcja dynamiki przepływu w komórkach naczyniowych może wyzwalać uwalnianie cytokin i przesłuchiwanie między typami komórek w tętnicy. Kohodowla komórek naczyniowych jest dokładniejszym obrazem odzwierciedlającym interakcję komórka-komórka na ścianie naczynia krwionośnego i odpowiedź naczyniową na sygnalizację mechaniczną. Udział dynamiki przepływu, w tym odpowiedzi komórki na dynamiczne i średnie (lub stałe) składowe przepływu, jest zatem ważnym wskaźnikiem w określaniu patologii choroby i skuteczności leczenia. Poprzez wprowadzenie modelu kohodowli in vitro i tłumienia ciśnienia za pompą krwi, która wytwarza symulowany rzut serca, można badać różne patologie chorób tętnic.

Utrzymanie warunków przepływu zależy od prawidłowego montażu obwodu przepływowego (Rysunek 1). Średnica rurek jest istotnym parametrem podczas montażu, ponieważ większe średnice zmniejszają opór przepływu i wynikający z tego spadek ciśnienia przed i za komorą hodowlaną. Aby zapewnić zamierzone ciśnienie i prędkość przepływu, należy zmontować system z przepływomierzem przed eksperymentem, stosując odpowiednie rurki. Wyrównanie kanału próżniowego komory hodowlanej (Rysunek 2) z perforacjam...

Ten protokół replikuje fizjologiczny lub patologiczny przepływ krwi in vitro, aby pomóc w określeniu odpowiedzi komórek w patologiach chorobowych. Wprowadzając komorę tłumiącą ciśnienie za pompą krwi, przepływ krwi przez naczynia krwionośne może zostać ponownie podsumowany i nałożony na monowarstwę śródbłonka naczyniowego lub kokulturę mimetyczną.

In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obserwacja wpływu różnych patologii przepływu pulsacyjnego na komórki śródbłonka in vitro. Jest to realizowane poprzez wstępną obróbkę chemiczną szkiełek przedmiotowych i pokrycie ich białkiem, aby zapewnić przyleganie komórek podczas ekspozycji na przepływ.W drugim kroku wyznaczany jest indeks pulsacyjności przepływu, co pozwala na porównanie przepływu in vitro z wartościami opisanymi w literaturze. Następnie preparaty z osadzonymi komórkami są podłączane do systemu przepływowego w celu pomiaru odpowiedzi komórkowej na patologie przepływu. Wyniki wykazują zmiany w morfologii i ekspresji białek w zależności od profili przepływu, przy zastosowaniu mikroskopii optycznej oraz barwienia immunofluorescencyjnego.Główną zaletą tej techniki w stosunku do pompy perystaltycznej lub pulsacyjnej jest możliwość regulacji pulsacji przepływu w celu odtworzenia odpowiedzi charakterystycznej dla stanu chorobowego lub zdrowego. Może to pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chorób tętnic. Aby rozpocząć, należy umieścić nowe szkiełka przedmiotowe o wymiarach 75 milimetrów na 50 milimetrów na jeden milimetr w czystej szklanej kuwecie do barwienia szkiełek.Następnie dodać odpowiednią ilość 20% roztworu kwasu siarkowego, aby całkowicie zanurzyć szkiełka przedmiotowe, i inkubować je w roztworze kwasu przez noc w następnym dniu. Przemyć szkiełka trzykrotnie, zanurzając je w świeżej wodzie dejonizowanej przez pięć minut za każdym razem. Po wypłukaniu zanurzyć szkiełka w acetonie na 30 minut, a następnie na noc w roztworze 6% triaminopropylotrietoksysilanu w acetonie.Następnie wypłucz preparaty trzy razy w czystym acetonie przez pięć minut, wymieniając aceton po każdym płukaniu. Potem przemyj preparaty trzy razy w wodzie dejonizowanej przez pięć minut, wymieniając wodę dejonizowaną po każdym płukaniu. Następnie zanurz preparaty w 1,5% glutaraldehydzie i pozostaw je w roztworze na 60 minut.Po usieciowaniu przemyj preparaty dwukrotnie w wodzie dejonizowanej, wymieniając wodę dejonizowaną po każdym płukaniu, a następnie umieść preparaty w 70% etanolu na 30 minut w celu ich sterylizacji. Usuń etanol i pozwól, aby wszelkie pozostałości odparowały z preparatów. Po wyschnięciu nawodnij preparaty, umieszczając je na krótko w sterylnej wodzie dejonizowanej.Następnie wyjmij uchwyt do szkiełek i umieść go w kwadratowej szalce Petriego o wymiarach 100 mm na 100 mm. W komorze z laminarnym przepływem powietrza pokryj funkcjonalizowane szkiełko 1 mL roztworu fibronektyny o stężeniu 25 µg/mL, pokrywając obszar, który będzie wystawiony na działanie komory hodowli komórkowej. Następnie przykryj szalkę i inkubuj szkiełka w temperaturze 37 °C przez jedną do dwóch godzin. Po inkubacji odessaj pozostały roztwór i zasiaj 600 000 komórek śródbłonka w 1 mL DMEM z 10% FBS na pokrytą stronę szkiełka.Przykryj komorę, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 120 minut. Następnie dodaj do komórek dodatkową pożywkę i kontynuuj inkubację do momentu uzyskania 70 do 80% konfluencji. Podłącz obwód przepływowy zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym oraz jak pokazano tutaj; upewnij się, że komora tłumiąca i ultradźwiękowy przepływomierz są ułożone w odpowiednim kierunku przepływu.Następnie wypełnij układ przepływowy, obwód i zbiornik wodą dejonizowaną. Upewnij się, że rurka wylotowa zbiornika jest zanurzona w jego objętości. Następnie zwizualizuj przebieg fali przepływu za pomocą przepływomierza.Otwórz zawór upustowy powietrza w komorze tłumiącej, aby zmienić stosunek objętości cieczy do powietrza. Zamykaj zawór upustowy powietrza w różnych odstępach poziomu cieczy i oblicz indeks pulsacyjny. Aby obliczyć ten indeks, oceń przebieg fali przepływu, przyjmując, że szczyt reprezentuje VM max.Koryto reprezentuje v min, a V mean to średnia z zapisu sygnału. Wartości indeksu pulsacyjności w zeszycie. Zaznacz uzyskany poziom cieczy i indeks pulsacyjności na komorze tłumiącej za pomocą permanentnego pisaka z filcem do przyszłego wykorzystania.Wyznacz pożądane poziomy indeksu pulsacyjności z literatury patologicznej przywołanej w towarzyszącym protokole tekstowym, przygotowując rozgrzewanie komory przepływowej. DMEM uzupełniony o 1% FBS w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Wyjmij jedno z wysuwek pokrytych komórkami z pożywki, gdy osiągną one 70–80% konfluencji, i umieść uszczelkę na stronie z naniesionymi komórkami.Następnie należy dopasować kanał próżniowy komory przepływowej do otworów w uszczelce. Potem podłącz wężyki próżniowe do portów próżniowych, upewniając się, że medium nie wycieka do układu próżniowego. Pod szkiełko przedmiotowe należy umieścić arkusz z poliwęglanu, a następnie przymocować zespół komory przepływowej za pomocą jednego zacisku sprężynowego na każdej z krótkich krawędzi oraz dwóch zacisków sprężynowych wzdłuż długich krawędzi komory przepływowej.Następnie podłącz komorę przepływową oraz wlot i wylot do obwodu przepływowego. Umieść system przepływowy w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% carbon dioxide, a następnie napełnij obwód uprzednio ogrzaną pożywką, napełniając zbiornik pożywką i pompując ją z niską pulsacyjnością. Utrzymuj ten przepływ przez cztery godziny w celu wstępnego przygotowania komórek.Następnie należy dostosować objętość cieczy w komorze tłumiącej do wcześniej zaznaczonego poziomu indeksu pulsacyjności i inkubować komórki przez pożądany czas. Przedstawione tutaj komórki śródbłonka hodowano w warunkach braku przepływu, przepływu stałego oraz przepływu pulsacyjnego.Zmiany morfologiczne mogą przejść od typowej morfologii komórek śródbłonka do morfologii bardziej wrzecionowatej po 24 godzinach ekspozycji na wysoki przepływ pulsacyjny. W przypadku przepływu statycznego i stałego obserwuje się niewielkie różnice w morfologii lub ich całkowity brak. Komórki mięśni gładkich są również pod wpływem kokultury z komórkami śródbłonka eksponowanymi na wysoki przepływ pulsacyjny, co jest tutaj wskazane przez różne poziomy alfa-aktyny mięśni gładkich oraz ciężkich łańcuchów miozyny.Przy różnych warunkach przepływu komórki poddane przepływowi pulsacyjnemu wykazały najwyższą zawartość obu białek, co wskazuje na przerost oraz kurczliwość. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu szczelności wszystkich uszczelnień i zapewnieniu stałego poziomu cieczy po zakończeniu czynności. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak oddziaływania międzykomórkowe, można zastosować inne metody, np. kokulturę komórek śródbłonka i komórek naczyniowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak złożyć obwód przepływowy, kontrolować indeks oraz poddać komórki śródbłonka działaniu przepływu pulsatylnego.

in-vitro-model-physiological-pathological-blood-flow-with-application

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Brakuje dostępu do wiarygodnych modeli do badania interakcji naczyniowych krwi u ludzi. Przedstawiamy model in vitro hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka w połączeniu z ludzką krwią pełną w celu zbadania interakcji komórkowych zarówno we krwi (ELISA), jak i w przedziale naczyniowym (mikroskopia).

Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem

Aby zbadać interakcję bakterii z naczyniami krwionośnymi pod wpływem naprężeń ścinających, opisano komorę przepływową oraz model mikroskopii przyżyciowej in vivo, które pozwalają na analizę czynników bakteryjnych i gospodarza przyczyniających się do adhezji naczyniowej.

Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Tutaj prezentujemy nowy protokół do badania i mapowania celowego osadzania nośników leków na komórkach śródbłonka w sfabrykowanych, rzeczywistych rozmiarach, trójwymiarowych modelach tętnic ludzkich pod przepływem fizjologicznym. Przedstawiona metoda może posłużyć jako nowa platforma do celowania w nosicieli leków w obrębie układu naczyniowego.

Modele tętnicze in vitro 3D z hodowlą komórkową do badania kierowania leków naczyniowych pod przepływem

Ten protokół przedstawia konfigurację i działanie nowo opracowanego, wydrukowanego w 3D bioreaktora do hodowli ex vivo naczyń krwionośnych w trakcie perfuzji. System został zaprojektowany tak, aby mógł być łatwo przyjęty przez innych użytkowników, praktyczny, niedrogi i możliwy do dostosowania do różnych zastosowań eksperymentalnych, takich jak podstawowa biologia i badania farmakologiczne.

Ex vivo Kultura perfuzyjna dużych naczyń krwionośnych w bioreaktorze wydrukowanym w 3D

Opisano tutaj prosty proces różnicowania komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie szczegółowy protokół ich mechanicznej stymulacji. Pozwala to na badanie mechanobiologii rozwojowej komórek śródbłonka. Podejście to jest kompatybilne z dalszymi testami żywych komórek pobranych z chipa hodowlanego po stymulacji mechanicznej.

In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

Poznaj model in vitro przepływu krwi do badania odpowiedzi komórek śródbłonka na zmiany morfologii i ekspresji białek. Ta metoda pozwala symulować warunki fizjologiczne i patologiczne.

In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Przeglądaj więcej filmów