In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja wpływu różnych patologii przepływu pulsacyjnego na komórki śródbłonka. In vitro. Osiąga się to poprzez wstępną obróbkę chemiczną szkiełka szklane i pokrycie ich białkiem, aby zapewnić przyczepienie komórek podczas ekspozycji na przepływ.

Drugim krokiem jest wyznaczanie wskaźnika pulsatywności przepływu, który pozwala na porównanie przepływu in vitro z wartościami opisanymi w literaturze. Następnie szkiełka osadzone w komorze są podłączane do systemu przepływu w celu zmierzenia odpowiedzi komórek na patologie przepływu. Wyniki pokazują zmiany w morfologii i ekspresji białek w oparciu o profile przepływu przy użyciu mikroskopii optycznej i barwienia immunofluorescencyjnego.

Główną przewagą tej techniki nad pompą perystaltyczną lub pulsacyjną jest możliwość dostosowania pulsacji przepływu w celu naśladowania chorej lub zdrowej reakcji. Może to pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chorób tętnic. Na początek umieść nowe szkiełka o wymiarach 75 milimetrów na 50 milimetrów na jeden milimetr w czystym szklanym naczyniu do barwienia szkiełek.

Następnie dodaj tyle 20% roztworu kwasu siarkowego, aby całkowicie zanurzyć szkiełka i inkubować je w roztworze kwasu przez noc następnego dnia. Umyj szkiełka trzy razy, zanurzając je za każdym razem w świeżej wodzie dejonizowanej na pięć minut. Po spłukaniu zanurz szkiełka w acetonie na 30 minut, a następnie na noc w roztworze 6%trzy aminopropylotrixi seline w acetonie.

Następnie opłucz szkiełka trzy razy w czystym acetonie przez pięć minut, zmieniając aceton po każdym praniu. Następnie umyj szkiełka trzy razy w wodzie dejonizowanej przez pięć minut, zmieniając wodę dejonizowaną po każdym praniu. Następnie zanurz szkiełka w 1,5% aldehydzie glutarowym i pozostaw je zanurzone na 60 minut.

Po usieciowaniu umyj szkiełka dwukrotnie w wodzie dejonizowanej, zmieniając wodę dejonizowaną Po każdym myciu, a następnie umieść szkiełka w 70% etanolu na 30 minut, aby je wysterylizować. Usunąć etanol i pozwolić, aby wszelkie pozostałe pozostałości odparowały ze szkiełek. Po wyschnięciu należy nawodnić szkiełka, umieszczając je na krótko w sterylnej wodzie dejonizowanej.

Następnie wyjmij uchwyt szkiełkowy i umieść go na kwadratowej szalce Petriego o wymiarach 100 milimetrów na 100 milimetrów. W kapturze z przepływem laminarnym pokryj funkcjonalizowane szkiełko jednym mililitrem roztworu fibronektyny o stężeniu 25 mikrogramów na mililitr, pokrywając przybliżony obszar, który zostanie wystawiony na działanie komory hodowli komórkowej. Następnie przykryj naczynie i inkubuj szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin Po inkubacji odessać pozostały roztwór i wysiać 600 000 komórek śródbłonka w jednym mililitrze DMEM z 10% FBS na powlekanej stronie szkiełka.

Przykryj komorę, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 120 minut. Następnie przykryj komórki dodatkowym podłożem i kontynuuj ich inkubację, aż zlewają się w 70 do 80%. Podłączyć obwód przepływu zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym i jak pokazano tutaj, upewnić się, że komora tłumienia i przepływomierz ultradźwiękowy są ustawione we właściwym kierunku przepływu.

Następnie napełnij przepływ, obwód i zbiornik wodą dejonizowaną. Upewnij się, że rurka wylotowa zbiornika jest zanurzona w objętości zbiornika. Następnie zwizualizuj przebieg przepływu za pomocą przepływomierza.

Otwórz zawór spustowy powietrza na komorze tłumienia, aby zmienić stosunek objętości płynu do powietrza. Zamknij zawór spustowy powietrza w różnych odstępach czasu i oblicz wskaźnik pulsacji. Aby obliczyć indeks, oceń przebieg przepływu, ponieważ szczyt reprezentuje maksimum maszyny wirtualnej.

Minimalna wartość reprezentuje v min, a średnia V jest średnią zapisu sygnału. Wartości indeksu tętna w notatniku. Zaznacz wynikowy poziom płynu i wskaźnik pulsacji na komorze tłumienia za pomocą pisaka z filcową końcówką do trwałego atramentu do wykorzystania w przyszłości.

Określ pożądane poziomy wskaźnika pulsatywności na podstawie literatury patologicznej, do której odwołuje się dołączony protokół tekstowy, podczas przygotowywania rozgrzewki w komorze przepływowej. DMEM uzupełniony 1%FBS w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjmij jedną z prowadnic pokrytych komórkami z nośnika, gdy zlewają się w 70 do 80% i umieść uszczelkę na wierzchu strony osadzonej w komórce.

Następnie wyrównaj kanał podciśnieniowy komory przepływowej z otworami w uszczelce. Następnie podłącz rurkę próżniową do portów próżniowych, upewniając się, że żadne media nie przeciekają do próżni. Umieść arkusz poliwęglanu pod szklanym szkiełkiem i clamp zespół komory przepływowej z jedną sprężyną clamp na każdym z krótszych boków i dwie sprężyny clamp wzdłuż dłuższych boków komory przepływowej.

Następnie podłącz komorę przepływu, wlot i wylot do obwodu przepływu. Umieść układ przepływowy w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i napełnij obwód wstępnie podgrzanym medium, napełniając zbiornik pożywką i pompując ją z niską pulsacją. Utrzymuj ten przepływ przez cztery godziny, aby wstępnie kondycjonować komórki.

Następnie dostosuj objętość płynu w komorze tłumienia do wcześniej oznaczonego poziomu wskaźnika pulsacji i hodowli. Komórki na żądany czas trwania. Pokazane tutaj komórki śródbłonka były hodowane bez przepływu, z ciągłym przepływem i przepływem pulsacyjnym.

Zmiany w morfologii można zaobserwować od typowej morfologii komórek śródbłonka do morfologii bardziej wrzecionowatej po 24 godzinach ekspozycji na wysoki przepływ pulsacyjny. Podczas gdy zarówno statyczny, jak i stały przepływ wykazują niewielką lub żadną różnicę w morfologii. Na komórki mięśni gładkich wpływa również kohodowla z komórkami śródbłonka narażonymi na wysoki przepływ pulsacyjny, na co wskazują tutaj różne poziomy alfa, aktyny mięśni gładkich i łańcucha ciężkiego miozyny.

W różnych warunkach przepływu komórki, które były wystawione na pulsacyjny przepływ, wykazywały największe ilości obu białek, co wskazuje na hipertrofię i kurczliwość. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymaniu wszystkich uszczelek i upewnieniu się, że poziom płynów pozostaje stały po tej procedurze. Inne metody, takie jak hodowla komórek śródbłonka, komórek naczyniowych, mogą być przeprowadzone w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak interakcje między komórkami.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zmontować obwód przepływu, kontrolować indeks i wystawić komórki śródbłonka na pulsacyjny przepływ.