In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obserwacja wpływu różnych patologii przepływu pulsacyjnego na komórki śródbłonka in vitro. Jest to realizowane poprzez wstępną obróbkę chemiczną szkiełek przedmiotowych i pokrycie ich białkiem, aby zapewnić przyleganie komórek podczas ekspozycji na przepływ.

W drugim kroku wyznaczany jest indeks pulsacyjności przepływu, co pozwala na porównanie przepływu in vitro z wartościami opisanymi w literaturze. Następnie preparaty z osadzonymi komórkami są podłączane do systemu przepływowego w celu pomiaru odpowiedzi komórkowej na patologie przepływu. Wyniki wykazują zmiany w morfologii i ekspresji białek w zależności od profili przepływu, przy zastosowaniu mikroskopii optycznej oraz barwienia immunofluorescencyjnego.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do pompy perystaltycznej lub pulsacyjnej jest możliwość regulacji pulsacji przepływu w celu odtworzenia odpowiedzi charakterystycznej dla stanu chorobowego lub zdrowego. Może to pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chorób tętnic. Aby rozpocząć, należy umieścić nowe szkiełka przedmiotowe o wymiarach 75 milimetrów na 50 milimetrów na jeden milimetr w czystej szklanej kuwecie do barwienia szkiełek.

Następnie dodać odpowiednią ilość 20% roztworu kwasu siarkowego, aby całkowicie zanurzyć szkiełka przedmiotowe, i inkubować je w roztworze kwasu przez noc w następnym dniu. Przemyć szkiełka trzykrotnie, zanurzając je w świeżej wodzie dejonizowanej przez pięć minut za każdym razem. Po wypłukaniu zanurzyć szkiełka w acetonie na 30 minut, a następnie na noc w roztworze 6% triaminopropylotrietoksysilanu w acetonie.

Następnie wypłucz preparaty trzy razy w czystym acetonie przez pięć minut, wymieniając aceton po każdym płukaniu. Potem przemyj preparaty trzy razy w wodzie dejonizowanej przez pięć minut, wymieniając wodę dejonizowaną po każdym płukaniu. Następnie zanurz preparaty w 1,5% glutaraldehydzie i pozostaw je w roztworze na 60 minut.

Po usieciowaniu przemyj preparaty dwukrotnie w wodzie dejonizowanej, wymieniając wodę dejonizowaną po każdym płukaniu, a następnie umieść preparaty w 70% etanolu na 30 minut w celu ich sterylizacji. Usuń etanol i pozwól, aby wszelkie pozostałości odparowały z preparatów. Po wyschnięciu nawodnij preparaty, umieszczając je na krótko w sterylnej wodzie dejonizowanej.

Następnie wyjmij uchwyt do szkiełek i umieść go w kwadratowej szalce Petriego o wymiarach 100 mm na 100 mm. W komorze z laminarnym przepływem powietrza pokryj funkcjonalizowane szkiełko 1 mL roztworu fibronektyny o stężeniu 25 µg/mL, pokrywając obszar, który będzie wystawiony na działanie komory hodowli komórkowej. Następnie przykryj szalkę i inkubuj szkiełka w temperaturze 37 °C przez jedną do dwóch godzin. Po inkubacji odessaj pozostały roztwór i zasiaj 600 000 komórek śródbłonka w 1 mL DMEM z 10% FBS na pokrytą stronę szkiełka.

Przykryj komorę, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 120 minut. Następnie dodaj do komórek dodatkową pożywkę i kontynuuj inkubację do momentu uzyskania 70 do 80% konfluencji. Podłącz obwód przepływowy zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym oraz jak pokazano tutaj; upewnij się, że komora tłumiąca i ultradźwiękowy przepływomierz są ułożone w odpowiednim kierunku przepływu.

Następnie wypełnij układ przepływowy, obwód i zbiornik wodą dejonizowaną. Upewnij się, że rurka wylotowa zbiornika jest zanurzona w jego objętości. Następnie zwizualizuj przebieg fali przepływu za pomocą przepływomierza.

Otwórz zawór upustowy powietrza w komorze tłumiącej, aby zmienić stosunek objętości cieczy do powietrza. Zamykaj zawór upustowy powietrza w różnych odstępach poziomu cieczy i oblicz indeks pulsacyjny. Aby obliczyć ten indeks, oceń przebieg fali przepływu, przyjmując, że szczyt reprezentuje VM max.

Koryto reprezentuje v min, a V mean to średnia z zapisu sygnału. Wartości indeksu pulsacyjności w zeszycie. Zaznacz uzyskany poziom cieczy i indeks pulsacyjności na komorze tłumiącej za pomocą permanentnego pisaka z filcem do przyszłego wykorzystania.

Wyznacz pożądane poziomy indeksu pulsacyjności z literatury patologicznej przywołanej w towarzyszącym protokole tekstowym, przygotowując rozgrzewanie komory przepływowej. DMEM uzupełniony o 1% FBS w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Wyjmij jedno z wysuwek pokrytych komórkami z pożywki, gdy osiągną one 70–80% konfluencji, i umieść uszczelkę na stronie z naniesionymi komórkami.

Następnie należy dopasować kanał próżniowy komory przepływowej do otworów w uszczelce. Potem podłącz wężyki próżniowe do portów próżniowych, upewniając się, że medium nie wycieka do układu próżniowego. Pod szkiełko przedmiotowe należy umieścić arkusz z poliwęglanu, a następnie przymocować zespół komory przepływowej za pomocą jednego zacisku sprężynowego na każdej z krótkich krawędzi oraz dwóch zacisków sprężynowych wzdłuż długich krawędzi komory przepływowej.

Następnie podłącz komorę przepływową oraz wlot i wylot do obwodu przepływowego. Umieść system przepływowy w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% carbon dioxide, a następnie napełnij obwód uprzednio ogrzaną pożywką, napełniając zbiornik pożywką i pompując ją z niską pulsacyjnością. Utrzymuj ten przepływ przez cztery godziny w celu wstępnego przygotowania komórek.

Następnie należy dostosować objętość cieczy w komorze tłumiącej do wcześniej zaznaczonego poziomu indeksu pulsacyjności i inkubować komórki przez pożądany czas. Przedstawione tutaj komórki śródbłonka hodowano w warunkach braku przepływu, przepływu stałego oraz przepływu pulsacyjnego.

Zmiany morfologiczne mogą przejść od typowej morfologii komórek śródbłonka do morfologii bardziej wrzecionowatej po 24 godzinach ekspozycji na wysoki przepływ pulsacyjny. W przypadku przepływu statycznego i stałego obserwuje się niewielkie różnice w morfologii lub ich całkowity brak. Komórki mięśni gładkich są również pod wpływem kokultury z komórkami śródbłonka eksponowanymi na wysoki przepływ pulsacyjny, co jest tutaj wskazane przez różne poziomy alfa-aktyny mięśni gładkich oraz ciężkich łańcuchów miozyny.

Przy różnych warunkach przepływu komórki poddane przepływowi pulsacyjnemu wykazały najwyższą zawartość obu białek, co wskazuje na przerost oraz kurczliwość. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu szczelności wszystkich uszczelnień i zapewnieniu stałego poziomu cieczy po zakończeniu czynności. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak oddziaływania międzykomórkowe, można zastosować inne metody, np. kokulturę komórek śródbłonka i komórek naczyniowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak złożyć obwód przepływowy, kontrolować indeks oraz poddać komórki śródbłonka działaniu przepływu pulsatylnego.