Name: Przeciwzjadliwe rozbijanie patogennych biofilmów za pomocą zaprojektowanych laktonaz gaszących kworum (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę rozbijania patogennych biofilmów bakteryjnych za pomocą zaprojektowanych laktonaz gaszących kworum. Technika ta pozwala na bezpośrednie dodanie enzymów do hodowli in vitro i łatwą kwantyfikację efektów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Funduszu Badań Akademickich Ministerstwa Edukacji, Narodowej Rady Badań Medycznych i Narodowej Fundacji Badawczej w Singapurze.

1. Kwantyfikacja powstawania biofilmu w fiolecie krystalicznym u A. baumannii S1
<ol>
	<li>Hodować 5 ml kultury A. baumannii S1 w bulionie lizogennym (LB) (trypton 10 g/l, ekstrakt drożdżowy 5 g/l) w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (220 obr./min) przez 16 godzin.</li>
	<li>Dostosuj kulturę A. baumannii S1 do pożądanego OD600 0,8. Używając płytki 96-dołkowej, zaszczepić kulturę bakterii (rozcieńczenie 1:100) do świeżego LB zawierającego 10 μl oczyszczonego enzymu GKL (40 mg/ml); Ostateczna objętość nowej kultury wynosi 100 μl.</li>
	<li>Przygotuj również kulturę kontrolną, która nie będzie zawierała żadnego enzymu. Powtórz podobne warunki, aby uzyskać żądaną liczbę powtórzeń.</li>
	<li>Przykryj talerz pokrywką i umieść go w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku o pojemności 10 litrów. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez 3 godziny przed delikatnym usunięciem pożywki.</li>
	<li>Dodać kolejne 100 μl świeżej pożywki LB do dołka i inkubować płytkę przez 21 godzin w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Po drugim okresie inkubacji delikatnie usuń wszystkie podłoża. Umyj komórkę bakterii planktonowej 200 μl sterylnej wody. Upewnij się, że podczas prania komórki są tylko minimalnie zakłócane.</li>
	<li>Dodać 100 μl 1% roztworu fioletu krystalicznego do każdego dołka i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór fioletu krystalicznego, przemywając studzienkę 200 μl sterylnej wody. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Dodać 100 μl 33% kwasu octowego do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut, delikatnie wstrząsając, co spowoduje rozpuszczenie barwnika.</li>
	<li>Określić ilościowo ilość utworzonego biofilmu, mierząc absorbancję fioletu krystalicznego przy długości fali 600 nm. Ilość fioletu krystalicznego jest proporcjonalna do ilości powstałego biofilmu.</li>
</ol>
2. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa biofilmu A. baumannii S1
<ol>
	<li>Hodować 5 ml kultury A. baumannii S1 w LB w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (220 obr./min) przez 16 godzin.</li>
	<li>Dostosuj kulturę A. baumannii S1 do pożądanego OD600 0,8. Używając 35-milimetrowej płytki do μ ze szklanym dnem, zaszczepić kulturę bakterii (rozcieńczenie 1:100) do świeżego LB zawierającego 30 μl oczyszczonego enzymu GKL (40 mg/ml); Ostateczna objętość nowej kultury wynosi 1 ml.</li>
	<li>Przykryj μ-Dish pokrywką i umieść je w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku o pojemności 10 l. Inkubować półmiskę μ w temperaturze 30 °C przez 3 godziny, a następnie delikatnie wyjąć podłoże. Dodać 30 μl oczyszczonego enzymu GKL i świeżej pożywki, uzyskując całkowitą objętość 1 ml. Inkubować przez kolejne 21 godzin w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.3 i inkubować półmisek μ przez kolejne 24 godziny w temperaturze 30 °C. Następnie delikatnie wyjmij nośnik.</li>
	<li>Dodać 500 μl 5 μg/ml aglutyniny (WGA) z kiełków pszenicy Alex Fluo 488 rozpuszczonej w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) do naczynia μ i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut; spowoduje to zabarwienie utworzonego biofilmu. Usuń roztwór barwiący i umyj naczynie μ 2 ml HBSS. Powtórz krok prania jeszcze raz.</li>
	<li>Dodać 500 μl 3,7 % formaldehydu rozpuszczonego w HBSS i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut; w ten sposób utrwalony zostanie biofilm na szalce μ. Umyj naczynie μ raz 2 ml HBSS, a następnie całkowicie usuń roztwór. Naczynie μ-Time z utrwalonym biofilmem może być przechowywane w ciemności w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem CLSM.</li>
	<li>W przypadku obrazowania i analizy CLSM użyj 63-krotnego powiększenia, aby wygenerować 97 stosów na obraz w odstępie 0,21 μm na stos.</li>
</ol>

<ol><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antibiotics%3A+are+we+in+the+post-antibiotic+era%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?</a> Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).</li>
<li>Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+future+prospects+of+antivirulence+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biology and future prospects of antivirulence therapies.</a> Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).</li>
<li>LaSarre, B., Federle, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+quorum+sensing+to+confuse+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).</li>
<li>Waters, C. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).</li>
<li>Lazar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+in+biofilms--how+to+destroy+the+bacterial+citadels+or+their+cohesion%2Fpower%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?</a> Anaerobe. 17, 280-285 (2011).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Perez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+challenge+of+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).</li>
<li>Tay, S. B., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+quorum-based+anti-virulence+therapeutics+targeting+Gram-negative+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens.</a> International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).</li>
<li>Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIgarashi%2C+J+%22Quorum+Sensing%22">Quorum Sensing</a>. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).</li>
<li>Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phosphotriesterase-like+lactonase+from+Sulfolobus+solfataricus+and+its+immobilization+for+disruption+of+quorum+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).</li>
<li>Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+quorum+sensing+in+the+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+non-native+N-Acyl+homoserine+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones.</a> ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).</li>
<li>Chow, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+thermostable+quorum-quenching+lactonase+from+the+amidohydrolase+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).</li>
<li>Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+biofilm+formation+by+the+human+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+engineered+quorum-quenching+lactonases%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).</li>
<li>Pour, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Acinetobacter+baumannii+strains+isolated+from+urinary+tract+infection+and+urinary+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+immunology+and+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters.</a> FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W obu zestawach eksperymentów A. baumannii S1 hodowano w pożywkach LB bez NaCl, ponieważ wysokie stężenie soli może zmniejszyć ilość biofilmu utworzonego przez bakterie15. Obecność takiego artefaktu może zaniżać ilość powstałego biofilmu, a także wpływ enzymów gaszących kworum w różnych warunkach leczenia. Zastosowanie katalitycznie nieaktywnego enzymu jest ważne jako kontrola negatywna w celu wyeliminowania możliwych skutków sekwestracji enzymów. Rysunek 1 pokazuje, że nawet jeśli ni...

Opcje leczenia chorób zakaźnych zostały skomplikowane przez szybki wzrost liczby bakterii wielolekoopornych, które są odporne na szeroki zakres antybiotyków1. Ze względu na wysokie wskaźniki zachorowalności i śmiertelności z powodu zakażeń wywołanych przez oporne bakterie, istnieje potrzeba eskalacji procesów opracowywania leków i/lub zbadania lepszych alternatyw przeciwbakteryjnych w celu poprawy opcji terapeutycznych. Ostatnio podejście przeciwzjadliwe zyskuje na popularności ze względu na jego potencjał w zapobieganiu zjadliwości metodami niebakteriobójczymi, a tym samym ograniczaniu ryzyka mechanizmów oporności2.
Quorum-sensing to 'główny przełącznik' w zjadliwości bakterii, a zakłócenie tego zjawiska sygnalizacji jest obiecującą metodą anty-wirulencyjną przeciwko patogenezie3. Początek zjadliwości wymaga akumulacji cząsteczek kworum w środowisku zewnątrzkomórkowym po osiągnięciu krytycznej gęstości populacji bakterii. Ponieważ cząsteczki kworum dyfundują z powrotem do macierzy wewnątrzkomórkowej, wiązanie się z pokrewnymi receptorami prowadzi do aktywacji czynników wirulencji, a także genów związanych z opornością na antybiotyki i tworzeniem biofilmu4. Ogólnie rzecz biorąc, zakłócenie quorum-sensing polega na hamowaniu interakcji cząsteczki kworum i receptora bez wpływu na pierwotne szlaki metaboliczne. W związku z tym nie ma to bezpośredniego wpływu na wzrost komórek. Ponieważ sprawność fizyczna nie jest zagrożona, istnieje minimalna presja selekcyjna, aby bakterie ewoluowały i uodparniały się na takie zabiegi5. Ponadto zakłócenie quorum-sensing może zakłócać wrodzone bakteryjne mechanizmy ochronne, jak w przypadku tworzenia biofilmu, który zapewnia ochronę przed środkami przeciwbakteryjnymi i odpowiedziami immunologicznymi gospodarza.
Szacuje się, że 99% mikrobów na Ziemi występuje w skomplikowanych matrycach przypominających biofilm, co daje kluczowe korzyści w przetrwaniu mikroorganizmom żyjącym w tych strukturach6. Co ważniejsze, powstawanie tych domen siedzących jest przyczyną większości uporczywych i przewlekłych zakażeń szpitalnych7. Acinetobacter baumannii jest jednym z głównych ludzkich patogenów, który jest związany z globalnymi zakażeniami szpitalnymi, a jego zjadliwość jest w dużej mierze przypisywanatworzeniu się biofilmu za pośrednictwem quorum-sensing8. Enzymy wygaszające kworum zostały z powodzeniem wykorzystane do zakłócania transdukcji sygnału za pośrednictwem kworum poprzez celowanie w grupę związków znanych jako laktony N-acylhomoseryny (AHL), które są wytwarzane przez bakterie Gram-ujemne9. W kilku badaniach rozszerzono również zastosowanie tych enzymów do blokowania patogenezy bakterii poprzez zmniejszenie ekspresji czynnika wirulencji i liczby komórek w biofilmach10,11. Niestety, nadal brakuje namacalnych dowodów na skuteczne stosowanie enzymów wygaszających kworum przeciwko tworzeniu się biofilmu przez patogeny bakteryjne. Podjęto próby użycia inhibitorów kworum (analogów AHL) zamiast enzymów wygaszających kworum, aby zakłócić tworzenie biofilmu A. baumannii 12. Chociaż ta metoda stosowania inhibitorów małych cząsteczek jest słusznym podejściem, utrzymanie jej biodostępności w zastosowaniach translacyjnych może być wyzwaniem. Wręcz przeciwnie, zastosowanie katalitycznych enzymów wygaszających kworum może obejść problem biodostępności, ponieważ enzymy są bardziej podatne na unieruchomienie na powierzchniach urządzeń biomedycznych w celu uzyskania efektów terapeutycznych.
Tutaj opisujemy ocenę wpływu inżynieryjnych laktonaz gaszących kworum z Geobacillus kaustophilus (GKL)13 na tworzenie biofilmu bakteryjnego, przy użyciu barwienia fioletem krystalicznym i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Badanie to jest pierwszą udaną demonstracją przerwania biofilmu w klinicznie istotnym szczepie A. baumannii S1 przy użyciu enzymów gaszących kworum. Metody opisane w tym badaniu są przydatne do oceny skuteczności innych enzymów wygaszających kworum w późniejszych wysiłkach terapeutycznych przeciwko patogennym bakteriom Gram-ujemnym.

<table><tbody><tr><td>Trypton&nbsp;</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Costar</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td> Kwas octowy Lab-Scan PLA00654X <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Uwaga: Łatwopalny</td></tr><tr><td>&mu;-Naczynie</td><td>Ibidi</td><td>80136</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluo 488-sprzężony WGA</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>141475095</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Uwaga:&nbsp;</td></tr><tr><td>Synergy HT Czytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X-81 Mikroskop odwróconej fluorescencji</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przeciwzjadliwe rozbijanie patogennych biofilmów za pomocą zaprojektowanych laktonaz gaszących kworum

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

Szybkie pojawienie się bakterii opornych na wiele leków przyspieszyło potrzebę nowych podejść terapeutycznych do zwalczania zagrażających życiu infekcji. Utrzymywanie się infekcji bakteryjnej jest często związane z tworzeniem biofilmu za pośrednictwem quorum-sensing. Tak więc zakłócenie tego obwodu sygnalizacyjnego stanowi atrakcyjną strategię antywirulencyjną. Doniesiono, że laktonazy wygaszające kworum skutecznie zakłócają obwody wyczuwania kworum. Pojawiło się jednak bardzo niewiele doniesień o skutecznym wykorzystaniu tych enzymów w zakłócaniu tworzenia biofilmu bakteryjnego. Protokół ten opisuje metodę zakłócania tworzenia biofilmu w klinicznie istotnym szczepie A. baumannii S1 poprzez zastosowanie zmodyfikowanej laktonazy gaszącej kworum. Acinetobacter baumannii jest głównym ludzkim patogenem związanym z poważnymi zakażeniami szpitalnymi na całym świecie, a jego zjadliwość przypisuje się głównie trwałości biofilmu. Zabieg z użyciem laktonazy pozwolił na znaczne zmniejszenie biofilmu A. baumannii S1. Badanie to wykazało również możliwość wykorzystania zmodyfikowanych enzymów wygaszających kworum w przyszłym leczeniu chorób bakteryjnych wywoływanych przez biofilm. Wreszcie, metoda ta może być wykorzystana do oceny kompetencji obiecujących enzymów wygaszających kworum.

W eksperymencie ilościowego oznaczania fioletem krystalicznym użyto dwóch enzymów typu quorum-quenching, aby wykazać możliwość zaburzenia tworzenia biofilmu: GKL typu dzikiego oraz ulepszonego podwójnego mutanta GKL (E101G/R230C). Wykazano, że oba enzymy wykazują aktywność laktonazy wobec 3-hydroksy-dekanoilo-L-homoseryny laktonu (3-OH-C10-HSL), głównej cząsteczki quorum stosowanej przez A. baumannii S114. W celu rzetelnej oceny zaburzenia biofilmu, jako kon...

Enzymy gaszące kworum są opcjami antyzjadliwymi i przeciwbakteryjnymi, które mogą łagodzić patogenezę bez ryzyka wystąpienia oporności, zapobiegając ekspresji czynników wirulencji i genów związanych z opornością na antybiotyki i tworzeniem biofilmu. W tym badaniu przedstawiamy metodę, która pokazuje skuteczność enzymów gaszących kworum w rozbijaniu biofilmu bakteryjnego.

Przeciwzjadliwe rozbijanie patogennych biofilmów za pomocą zaprojektowanych laktonaz gaszących kworum

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zademonstrowanie skuteczności enzymów quorum-quenching w rozrywaniu biofilmu bakteryjnego. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapeutyki antybakteryjnej oraz pomoże zrozumieć wpływ laktonaz quorum-quenching na bakterie patogenne w środowisku biofilmu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniego dodawania laktonaz quorum-quenching w środowisku in vitro.W związku z tym jego wpływ na rozbicie biofilmu można łatwo skwantyfikować. Procedurę tę demonstruje Terrence Tay, technik w naszym laboratorium. Aby rozpocząć, należy wyhodować 5 mililiter kultury A.baumannii S1 w podłożu LB w temperaturze 30 degrees Celsius w inkubatorze z wytrząsaniem przez 16 hours.Dostosować kulturę do wartości OD 600 wynoszącej 0.8. Następnie użyć świeżej pożywki LB zawierającej 4 mg/mL oczyszczonego enzymu GKL, aby rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:100. Do dołków płytki 96-dołkowej dodać 100 µL otrzymanego roztworu.Przykryj płytki pokrywkami i umieść je w plastikowym pojemniku o pojemności 10 litrów. Zamknij szczelnie pojemnik i inkubuj w temperaturze 30 °C przez trzy godziny, a następnie ostrożnie usuń medium. Do dołków dodaj kolejne 100 µl świeżego medium LB i inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przez 21 godzin.Po delikatnym usunięciu medium, należy użyć 200 µL sterylnej wody, aby delikatnie wypłukać planktoniczne komórki bakterii. Końcówkę pipety należy umieścić na dnie studni i ostrożnie usunąć medium w cieczy, aby zapewnić minimalne zaburzenia biofilmu uformowanego na granicy fazy powietrze-ciecz. Następnie do każdej studni dodaje się 100 µL 1% roztworu fioletu krystalicznego i inkubuje przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Usuń roztwór fioletu krystalicznego, przemywając studzienki trzy razy 200 µL sterylnej wody. Do każdej studzienki dodaj 100 µL 33% kwasu octowego i inkubuj przez 15 minut przy delikatnym wstrząsaniu, aby rozpuścić barwnik. Ilościowo określ ilość biofilmu, mierząc absorbancję fioletu krystalicznego przy 600 nm.Ilość fioletu krystalicznego jest proporcjonalna do ilości utworzonego biofilmu. Aby przeprowadzić konfokalną mikroskopię laserową (CLSM) biofilmu A.baumannii S1, należy wyhodować 5 ml kultury A.baumannii S1 w podłożu LB w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez 16 godzin. Następnie należy dostosować kulturę A.baumannii S1 do gęstości optycznej OD 600 wynoszącej 0,8.Następnie użyć świeżej pożywki LB zawierającej 1,2 mg/ml oczyszczonego enzymu GKL do rozcieńczenia hodowli w stosunku 1:100 i dodać 1 ml do 35 ml szklanego mikronaczynia z płaskim dnem. Przykryć mikronaczynie pokrywką, umieścić je w 10 l plastikowym pojemniku i szczelnie zamknąć przed inkubacją naczynia w temperaturze 30 °C przez trzy godziny. Po delikatnym usunięciu pożywki dodać 1 ml świeżej pożywki zawierającej 30 µl oczyszczonego enzymu GKL, a następnie inkubować w temperaturze 30 °C przez kolejne 21 godzin.Ponownie ostrożnie usuń medium i zastąp je kolejnym 1 mL enzymu GKL w świeżym medium. Inkubuj w temperaturze 30 °C przez 24 h. Po inkubacji ostrożnie usuń medium i dodaj 500 µL roztworu aglutyniny z zarodków pszenicy sprzężonej z Alexa Fluor 488 o stężeniu 5 µg/mL rozpuszczonej w HBSS.Inkubuj mikroprobówkę w temperaturze 37°C przez 30 minut, aby zabarwić biofilmy. Aby utrwalić biofilmy, dodaj 500 µL 3,7% formaldehydu rozpuszczonego w HBSS i inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 minut. Przemyj mikroprobówkę raz, używając 2 mL HBSS, a następnie całkowicie usuń roztwór.Przed obrazowaniem CLSM przechowuj szalkę w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Do obrazowania i analizy CLSM użyj obiektywu 63X, aby wygenerować 97 stosów na obraz z odstępem 0,21 mikrona na stos. W eksperymencie z oznaczaniem ilościowym fioletem krystalicznym wykorzystano enzymy quorum-quenching: GKL typu dzikiego oraz ulepszony podwójny mutant GKL do wykazania aktywności laktonazy przeciwko 3-hydroksydekanoilu homoserynowej laktonie lub 3OHC10HSL, głównej cząsteczce quorum stosowanej przez A.baumanii S1. Jak pokazano tutaj, oba enzymy były w stanie znacząco zredukować tworzenie biofilmów w uprzednio potraktowanych szczepach A.baumanii S1 typu dzikiego. Stopień rozpadu biofilmów wywołany przez oba enzymy nie jest proporcjonalny do ich skuteczności przeciwko 3OHC10HSL.Jak wynika z tej tabeli, liczba obrotów zmutowanego GKL jest sześciokrotnie większa niż w przypadku GKL typu dzikiego w reakcji z 3OHC10HSL. Jednak różnica w stopniu rozkładu biofilmu między tymi enzymami jest jedynie dwukrotna. W tym eksperymencie do porównania wykorzystano ulepszony zmutowany enzym GKL oraz jego enzym nieaktywny katecholowo.Niniejszy obraz DIC pokazuje, że traktowanie ulepszonym enzymem mutantem GKL doprowadziło do zmniejszenia rozmiaru biofilmu w porównaniu z enzymem nieaktywnym. Analiza obrazów fluorescencyjnych wykazała również redukcję powierzchni, biomasy oraz średniej grubości biofilmów po zastosowaniu ulepszonego enzymu mutanta GKL. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje od trzech do czterech godzin, nie licząc czasu inkubacji.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zminimalizowaniu usuwania i naruszania biofilmu w krokach płukania. Po zakończeniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak zliczanie komórek i testy stabilności enzymatycznej. Pozwoli to odpowiedzieć na dodatkowe pytania, dotyczące m.in. wpływu laktonaz quorum-quenching na populację komórek w obrębie biofilmu, a także czasu ich działania.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu leczenia chorób zakaźnych do zbadania wpływu potencjalnych laktonaz typu quorum-quenching na biofilm produkowany przez bakterie patogenne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić stopień przerwania biofilmu za pomocą barwienia fioletem krystalicznym oraz jak ocenić zmiany morfologiczne w biofilmie przy użyciu obrazowania konfokalnego. Należy pamiętać, że praca z materiałem patogennym może być niezwykle niebezpieczna.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak korzystanie z odpowiednich zaplecz do ograniczania ryzyka biologicznego.

anti-virulent-disruption-pathogenic-biofilms-using-engineered-quorum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Tay, S. B. i in. Antywirusowe zaburzenie biofilmów patogennych przy użyciu inżynierowanych laktonan gaśniczych kworum.  J. Vis. Exp. (2016)Film demonstruje metodę ilościowego określenia biomasy biofilmu w patogennej bakterii, porównując nieleczone grupy kontrolne z próbkami objętymi enzymem gaszczącym kworum. Enzym zakłóca sygnalizację bakteryjną podczas wczesnej inkubacji, zmniejszając przyczepność komórek. Po płukaniu i dalszej inkubacji studnie kontrolne tworzą gęste biofilmy,...

Ilościowe tłumienie biofilmu indukowanego enzymami u bakterii patogennych

Źródło: Tay, S. B., et.al. Antywirusowe zaburzenie biofilmów patogennych przy użyciu inżynierowanych laktonan gaśniczych kworum.  J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje proces hamowania tworzenia biofilmu poprzez wprowadzenie enzymu zakłócającego sygnalizację komórkową bakterii. Enzym ten zapobiega produkcji przez bakterie pozakomórkowych substancji polimerowych, co ogranicza rozwój biofilmu na mikromisce o szklanym dnie. Na koniec struktura biofilmu jest wizualizowana za pomocą...

Mikroskopowa ocena hamowania powstawania biofilmu przez enzymy

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Infekcje biofilmowe wykazują wysoką tolerancję na chemioterapię. Żaden pojedynczy test nie oddaje złożoności biofilmów. Zamiast tego potrzebne są testy uzupełniające. Przedstawiamy platformę przesiewową (opracowaną dla S. aureus), która łączy testy żywotności, biomasy i matrycy biofilmu. Pozwala to na odkrywanie leków przeciwbiofilmowych, w tym ocenę długoterminowych efektów chemioterapeutycznych.

Platforma testów antybiofilmowych dostosowana do eksploracji bibliotek związków naturalnych

Wywołane przez środki przeciwbakteryjne zmiany w architekturze biofilmu Pseudomonas aeruginosa różnią się między klinicznymi izolatami hodowanymi od pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłą infekcją płuc. Po mikroskopii konfokalnej oprogramowanie COMSTAT może być wykorzystane do ilościowego określenia zmian w architekturze biofilmu (np. powierzchni, grubości, biomasy) dla poszczególnych izolatów w celu oceny skuteczności środków przeciwinfekcyjnych.

Kwantyfikacja wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na architekturę biofilmu in vitro przy użyciu oprogramowania COMSTAT

Ten protokół przedstawia metodologię wykonywania pomiarów wzrostu biofilmu i biomasy przy użyciu samodzielnie zmontowanych urządzeń do płytek PCR z głębokiej studni do wysokoprzepustowego 96-dołkowego statycznego przesiewania biofilmu z pokrywą potwierdzoną.

Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Ten protokół opisuje podejście łączące metody statyczne i dynamiczne do oceny skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmów w przemyśle mleczarskim. Podejście to może być również wykorzystane do testowania skuteczności nowych preparatów biologicznych lub chemicznych w zwalczaniu biofilmów.

Ocena skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmu mlecznego przy użyciu podejścia łączącego metody statyczne i dynamiczne

Związki tiofenesulfonamidu są silnymi i specyficznymi inhibitorami regulatorów Vibrio quorum sensing LuxR/HapR, które blokują ich aktywność in vivo, zapobiegając w ten sposób transkrypcji genów zjadliwości, ruchliwości i biofilmów. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób związki te są syntetyzowane, modelowane in silico i oznaczane in vivo pod kątem aktywności przeciwko LuxR / HapR.

Synteza i test inhibitorów Vibrio Quorum Sensing

Celem niniejszego protokołu jest ilościowe określenie produkcji violaceiny przez Chromobacterium violaceum ATCC 12472 jako wskaźnika zastępczego do oceny hamowania przez quorum sensing przez związki bioaktywne.

Kwantyfikacja violaceiny w Chromobacterium violaceum i jej hamowanie przez związki bioaktywne

Biofilmy mikrobiologiczne są zazwyczaj tworzone przez odrębne subpopulacje wyspecjalizowanych komórek. Analiza pojedynczych komórek w tych subpopulacjach wymaga zastosowania reporterów fluorescencyjnych. W niniejszym protokole opisujemy metodę wizualizacji i monitorowania kilku subpopulacji w biofilmach B. subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Analiza pojedynczych komórek biofilmu Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej

Poznaj metodę rozbijania patogennych biofilmów bakteryjnych za pomocą zaprojektowanych laktonaz gaszących kworum. Technika ta pozwala na bezpośrednie dodanie enzymów do hodowli in vitro i łatwą kwantyfikację efektów.

Przeciwzjadliwe rozbijanie patogennych biofilmów za pomocą zaprojektowanych laktonaz gaszących kworum

Przeglądaj więcej filmów