Przeciwzjadliwe rozbijanie patogennych biofilmów za pomocą zaprojektowanych laktonaz gaszących kworum

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykazanie skuteczności enzymów gaszących kworum w rozbijaniu biofilmu bakteryjnego. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii przeciwbakteryjnych oraz pomoże zrozumieć wpływ laktonaz gaszących kworum na bakterie chorobotwórcze w środowisku biofilmu. Główną zaletą tej techniki jest to, że laktonazy wygaszające kworum mogą być dodawane bezpośrednio w środowisku in vitro.

W ten sposób jego wpływ na rozerwanie biofilmu można łatwo określić ilościowo. Demonstruje tę procedurę Terrence Tay, technik w naszym laboratorium. Na początek hoduj 5-mililitrową kulturę A.baumannii S1 w LB w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem przez 16 godzin.

Dostosuj kulturę do OD 600 wynoszącej 0,8. Następnie użyj świeżego LB zawierającego 4 miligramy na mililitr oczyszczonego enzymu GKL, aby rozcieńczyć kulturę od jednego do 100. I dodaj 100 mikrolitrów do dołków 96-dołkowej płytki.

Użyj pokrywek, aby przykryć talerze i umieść je w 10-litrowym plastikowym pojemniku. Zamknij pojemnik i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy godziny, a następnie delikatnie wyjmij pożywkę. Dodaj kolejne 100 mikrolitrów świeżej pożywki LB do dołków i inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 21 godzin.

Po delikatnym usunięciu pożywki użyj 200 mikrolitrów sterylnej wody, aby delikatnie umyć komórki bakterii planktonowych. Umieść końcówkę pipety na dnie studzienki i ostrożnie usuń płynne podłoże, aby zapewnić minimalne zakłócenia biofilmu obcego między granicą powietrza i cieczy. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 1% roztworu fioletu krystalicznego do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Usuń roztwór fioletu krystalicznego, używając 200 mikrolitrów sterylnej wody, aby trzykrotnie umyć studzienki. Dodaj 100 mikrolitrów 33% kwasu octowego do każdej studzienki i inkubuj z delikatnym wstrząsaniem przez 15 minut, aby rozpuścić barwnik. Określ ilościowo ilość biofilmu, mierząc absorbancję fioletu krystalicznego przy 600 nanometrach.

Ilość fioletu krystalicznego jest proporcjonalna do ilości powstałego biofilmu. Aby przeprowadzić konfokalną laserową mikroskopię skaningową lub CLSM biofilmów A.baumannii S1, hoduj pięciomililitrową kulturę A.baumannii S1 w LB w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze wstrząsającym przez 16 godzin. Dostosuj kulturę A.baumannii S1 do OD 600 wynoszącego 0,8.

Następnie użyj świeżego LB zawierającego 1,2 miligrama na mililek oczyszczonego enzymu GKL, aby rozcieńczyć kulturę, jeden do 100, i dodać jeden mililitr do 35-mililitrowego mikronaczynia ze szklanym dnem. Przykryj mikronaczynie pokrywką i umieść je w 10-litrowym plastikowym pojemniku i zamknij przed inkubacją naczynia w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po delikatnym usunięciu pożywki dodaj jeden mililitr świeżej pożywki zawierającej 30 mikrolitrów oczyszczonego enzymu GKL, a następnie inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez kolejne 21 godzin.

Delikatnie usuń pożywkę po raz drugi i zastąp ją kolejnym mililitrem enzymu GKL w świeżej pożywce. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji delikatnie usunąć pożywkę i dodać 500 mikrolitrów po pięć mikrogramów na mililitr sprzężonej aglutyniny z kiełków pszenicy Alexa Fluor 488 rozpuszczonej w HBSS.

Inkubuj mikronaczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby zabarwić biofilmy. Aby utrwalić biofilmy, dodaj 500 mikrolitrów 3,7% formaldehydu rozpuszczonego w HBSS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Użyj dwóch mililitrów HBSS, aby raz umyć mikronaczynie, a następnie całkowicie usuń roztwór.

Przechowuj naczynie w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed obrazowaniem CLSM. Do obrazowania i analizy CLSM użyj obiektywu 63X, aby wygenerować 97 stosów na obraz w odstępie 0,21 mikrona na stos. W eksperymencie ilościowym fioletu krystalicznego, GKL typu dzikiego i ulepszony podwójnie zmutowany enzym gaszenia kworum GKL użyto do aktywności laktonazy przeciwko laktonowi trzech hydroksydekanoilo-l homoseryny lub 3OHC10HSL, głównej cząsteczce kworum używanej przez A. baumanii S1.As pokazanej tutaj, oba enzymy były w stanie znacznie zmniejszyć tworzenie biofilmów we wstępnie potraktowanym A.baumanii S1 typu dzikiego. Stopień rozerwania biofilmu przez oba enzymy nie jest proporcjonalny do ich skuteczności wobec 3OHC10HSL.

Jak widać w tej tabeli, tempo rotacji zmutowanego GKL jest sześciokrotnie szybsze niż GKL typu dzikiego w porównaniu z 3OHC10HSL. Jednak różnica w zakresie rozerwania biofilmów między enzymami jest tylko dwojaka. W tym eksperymencie do porównania wykorzystano ulepszony zmutowany enzym GKL i jego katecholijnie nieaktywny enzym.

Ten obraz DIC pokazuje, że leczenie ulepszonym zmutowanym enzymem GKL spowodowało zmniejszenie rozmiaru biofilmu w porównaniu z nieaktywnym enzymem. Analiza obrazów fluorescencyjnych wykazała również, że nastąpiło zmniejszenie powierzchni, biomasy i średniej grubości biofilmów po potraktowaniu ulepszonym zmutowanym enzymem GKL. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, z wyłączeniem czasu inkubacji, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zminimalizowaniu usuwania i przerywania biofilmu podczas etapów mycia. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak zliczanie komórek i testy stabilności enzymów. Pozwoli to odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ laktonaz wygaszających kworum na populację komórek w biofilmie, a także czas ich działania.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się leczeniem chorób zakaźnych do zbadania wpływu laktonaz potencjalnie gaszących kworum na biofilm wytwarzany przez bakterie chorobotwórcze. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo rozerwanie biofilmu przez barwienie fioletem krystalicznym oraz ocenić zmiany morfologiczne w biofilmie za pomocą obrazowania konfokalnego. Nie zapominaj, że praca z materiałem chorobotwórczym może być bardzo niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiednich urządzeń do ograniczania ryzyka biologicznego.