Name: Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną, modułową metodę przesiewową egzopolisacharydów mikroorganizmów z analizą odcisków palców węglowodanów. To podejście przyspiesza badania polimerów i identyfikację nowych wariantów polisacharydów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy Thomasowi Howe'owi i Jörgowi Carstenowi za programowanie i wsparcie techniczne przy systemach obsługi cieczy.

<ol><li>Milani, J., Maleki, G. Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilani%2C+J+%22Food+Industrial+Processes+-+Methods+and+Equipment%22">Food Industrial Processes - Methods and Equipment</a>. Valdez, B. 2, InTech. (2012).</li>
<li>Thibodeau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+the+skin+from+environmental+stresses+with+an+exopolysaccharide+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cosmet+Toiletries%22%5BJournal%5D)">Protecting the skin from environmental stresses with an exopolysaccharide formulation.</a> Cosmet Toiletries. 120 (12), 81-90 (2005).</li>
<li>Prajapati, V. D., Jani, G. K., Zala, B. S., Khutliwala, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+emerging+exopolysaccharide+gellan+gum+as+a+novel+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">An insight into the emerging exopolysaccharide gellan gum as a novel polymer.</a> Carbohydr Polym. 93 (2), 670-678 (2013).</li>
<li>Schmidt, W., Brouwers, H. J. H., Kuehne, H. C., Meng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+working+mechanism+of+starch+and+diutan+gum+in+cementitious+and+limestone+dispersions+in+presence+of+polycarboxylate+ether+superplasticizers%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Rheol%22%5BJournal%5D)">The working mechanism of starch and diutan gum in cementitious and limestone dispersions in presence of polycarboxylate ether superplasticizers.</a> Appl. Rheol. 23 (5), 52903(2013).</li>
<li>Srinivasan, R. Natural Polysaccharides as Treatment Agents for Wastewater. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSrinivasan%2C+R+%22Green+Materials+for+Sustainable+Water+Remediation+and+Treatment%22">Green Materials for Sustainable Water Remediation and Treatment</a>. , The Royal Society of Chemistry. 51-81 (2013).</li>
<li>Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+exopolysaccharide+screening+platform%3A+From+strain+cultivation+to+monosaccharide+composition+and+carbohydrate+fingerprinting+in+one+day%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">High throughput exopolysaccharide screening platform: From strain cultivation to monosaccharide composition and carbohydrate fingerprinting in one day.</a> Carbohydr Polym. 122, 212-220 (2015).</li>
<li>Ortega-Morales, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+polymers+synthesized+by+tropical+intertidal+biofilm+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular polymers synthesized by tropical intertidal biofilm bacteria.</a> J Appl Microbiol. 102 (1), 254-264 (2007).</li>
<li>Xu, R., Ma, S., Wang, Y., Liu, L., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+identification+and+statistic+optimization+of+a+novel+exopolysaccharide+producing+Lactobacillus+paracasei+HCT%5BTitle%5D)+AND+%22Afr.+J.+Microbiol.+Res%22%5BJournal%5D)">Screening identification and statistic optimization of a novel exopolysaccharide producing Lactobacillus paracasei HCT.</a> Afr. J. Microbiol. Res. 4 (9), 783-795 (2010).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal. Chem. 28 (3), 350-356 (1956).</li>
<li>Masuko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+analysis+by+a+phenol-sulfuric+acid+method+in+microplate+format%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format.</a> Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).</li>
<li>Geater, C. W., Fehr, W. R., Wilson, L. A., Robyt, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+rapid+method+of+total+sugar+analysis+for+soybean+seed%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">A more rapid method of total sugar analysis for soybean seed.</a> Crop Sci. 41 (1), 250-252 (2001).</li>
<li>Sutherland, I. W. Ch 16, Microbial Exopolysaccharides. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSutherland%2C+IW+%22Polysaccharides+Structural+Diversity+and+Functional+Versatility%22">Polysaccharides Structural Diversity and Functional Versatility</a>. Dumitriu, S. , Marcel Dekker. 431-457 (2005).</li>
<li>Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances?. Microbial extracellular polymeric substances: characterization, structure and function. Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. , Springer. 258(1999).</li>
<li>Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+carbohydrate+analysis+via+liquid+chromatography+coupled+with+ultra+violet+and+electrospray+ionization+ion+trap+detection+in+96-well+format%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fast carbohydrate analysis via liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection in 96-well format.</a> J. Chromatogr. A. 1350, 44-50 (2014).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Wykrywanie polisacharydów metodą fenolowo-siarkową: Różne monosacharydy wykazują różne maksima absorpcji i współczynniki ekstynkcji molowej przy zastosowaniu tej metody9. Powoduje to różne maksima wchłaniania polimerów, które zawierają kilka cukrów w różnych ilościach. Różne długości fal maksimów absorpcji dla 16 różnych dostępnych na rynku polimerów podano w tabeli 5. Polimery rozpuszczono (1 g/l) w ddH2O, wymieszano (150 obr./min) przez noc i zmierzono metodą fenolowo-siarkową. Guma Diutan wykazała najniższe maksima wchłanialności przy 470 nm, a skleroglukan i kwas hialuronowy najwyższe przy 484 nm. Na podstawie tych wyników wybrano 480 nm dla tej platformy przesiewowej. Absorbancję względną polimerów obliczono na podstawie absorbancji uzyskanej przy 1 g/l glukozy (ustawionej na 100%). Najniższe wyniki uzyskano w przypadku skleroglukanu i sukcynoglikanu, w obu przypadkach po 92%. Było to oczekiwane, ponieważ skleroglukan zawiera tylko glukozę, a sukcynoglikan zawiera glukozę i galaktozę w stosunku 7:1. Oba polimery handlowe mają różne straty wysuszenia i różną zawartość popiołu, co jest powodem, dla którego teoretyczna wartość ~110% nie została osiągnięta. Xylan wykazał najwyższą absorbancję względną na poziomie 311%. Powodem tego jest wysoki współczynnik ekstynkcji molowej osiągnięty z ksylozy ze względu na bardziej dominującą formę furanozy. Przy poziomie glukozy 0,1 g/l osiągnięto granicę oznaczalności, a także granicę wykrywalności przy stężeniu <0,05 g/l. Jednak granica wykrywalności dla szczepów dodatnich w badaniu przesiewowym jest wyższa niż 0,7 g/l, a zatem test wykazał dobrą wydajność. W celu uzyskania wiarygodnych wyników, pozostałą glukozę po filtracji żelowej oznaczono za pomocą testu glukozy i wartość tę odjęto od wartości z metody fenolowo-siarkowej.
Zautomatyzowane rozcieńczanie glukozy: Zbadano wydajność oznaczania glukozy po hodowli (rozcieńczenie 1:100). W tym celu 10 μl supernatantu przeniesiono do 990 μl ddH2O na płytce głębokiej studzienki i wymieszano przez dziesięciokrotne zasysanie i dozowanie 180 μl z tego rozcieńczenia. Drugim krytycznym krokiem było prawidłowe odpipetowanie tylko 5 μl podwielokrotności do rozcieńczenia 1:10 z testu glukozy po filtracji żelowej. W celu wytworzenia rozcieńczenia 25 μl ddH2O przeniesiono najpierw końcówką o wielkości 50 μl, a następnie odessano razem 20 μl ddH2O i 5 μl filtratu żelowego. Zapewnia to lepsze usunięcie 5 μl podwielokrotności z końcówki. Oba etapy rozcieńczania zostały zweryfikowane z różnymi standardami glukozy za pomocą testu glukozy. Wyniki dla dwóch przykładowych stężeń przedstawiono w tabeli 6. Rozcieńczenie 1:100 do oznaczania zawartości glukozy po hodowli wykazało wysoką precyzję dla obu wzorców z CV <1,2%. W tym samym czasie dokładność dla wyższego standardu wynosiła do 11,6 (błąd procentowy). Jest to jednak nieistotne, ponieważ oznaczanie glukozy reprezentuje tylko pozostałą zawartość glukozy po hodowli, a zatem nie jest ważne dla wykrywania polimerów. Rozcieńczenie 1:10 pozostałej glukozy po filtracji żelowej wykazało bardzo wiarygodne wyniki z CV <1,4% i błędem dokładności <2,1%.
Rozważenie parowania: Badanie przesiewowe wymaga 3,5 godziny od pierwszego kroku do pierwszego testu glukozy. Aby dowiedzieć się, czy ten przedział czasowy ma wpływ na nieograniczone przechowywanie MTP, 50 μl wzorców kalibracyjnych do oznaczania glukozy przechowywano z pokrywą i bez niej przez 3,5 godziny w karuzeli robota. W zakresie kalibracji (od 45 do 4,5 mg/l) stężenie próbki prawie nie wzrosło. Wzrost – spowodowany parowaniem – wynosił poniżej 2,1% i tylko dla dwóch najniższych stężeń (1,8 i 0,9 mg/L) osiągnął aż 12,4% (tab. 7).
Filtracja żelowa: Duże ilości niemetabolizowanej glukozy zakłócają ilościowe wykrywanie glukozy z hydrolizowanego polimeru. W związku z tym konieczne było przeprowadzenie etapu filtracji żelowej w celu usunięcia pozostałej glukozy po uprawie. Dodatkowo filtracja żelowa oczyszcza polimer zawierający supernatant z soli i monomerycznych związków węglowodanowych, innych niż glukoza, w celu zminimalizowania tła analitycznego w analizie monomerów. Na etapie filtracji żelowej 35 μl filtratu umieszczono w środku studni. W celu walidacji niezawodności filtracji żelowej w zautomatyzowanym systemie przefiltrowano osiem wzorców kalibracyjnych od 0,045 do 9 g/l glukozy (n = 8). Stężenie glukozy w każdym stężeniu było zawsze obniżone o więcej niż 95% wartości początkowej (tab. 8). W ten sposób filtracja żelowa wykazała bardzo dobre wyniki dla różnych stężeń glukozy. Dodatkowo, pozostała glukoza po filtracji żelowej została również oznaczona za pomocą testu glukozy i odjęta od oznaczenia fenolowo-siarkowo-kwasowego, aby otrzymać odpowiednią ilość ekwiwalentu glukozy dla hydrolizowanego polimeru.
Test pirogronianowy: Przede wszystkim zbadano, czy zneutralizowana i rozcieńczona (1:10) matryca TFA z etapu hydrolizy zakłóca reakcję enzymatyczną. W związku z tym pełny test został przeprowadzony dwukrotnie, raz z matrycą i jeden raz bez matrycy i wykazał wiarygodne wyniki. Na koniec udało się zmierzyć zawartość pirogronianu w 16 dostępnych na rynku polimerach, co przedstawiono na rysunku 3. Powszechnie wiadomo, że spośród tych 16 polimerów tylko sukcynoglikan i ksantan naturalnie zawierają pirogronian. W naszym teście pirogronianowym oba te polimery zostały prawidłowo zidentyfikowane. W skleroglukanie wykryto również znaczne ilości gumy welan i pirogronianu ksylanu. Ogólnie rzecz biorąc, możliwości tego podejścia zostały zweryfikowane, a test pirogronianowy wykazał wysoką wydajność. Okazało się, że jest on w stanie wykryć pirogronian w różnych polimerach po hydrolizie.
Odcisk palca węglowodanów: Po wykonaniu wszystkich modułów analitycznych w zautomatyzowanym badaniu przesiewowym, potencjalni producenci EPS zostali wybrani do analizy odcisków palców węglowodanów. W tym celu zastosowano kilka kryteriów: 1) Pozytywna obserwacja lepkości po odwirowaniu i/lub po filtracji. 2) Opady przed i po filtracji. Obserwowane włókna i płatki oceniono jako pozytywne. 3) Wartość ekwiwalentu glukozy z metody fenolowo-siarkowej. Wartości >700 mg/L zostały ocenione jako pozytywne, a wartości od 300 do 700 mg/L zostały ocenione jako przypuszczalni producenci EPS. Gdy dwa lub trzy kryteria zostały ocenione jako pozytywne, szczepy zostały wybrane do dalszej analizy odcisków palców węglowodanów. Kryteria można dostosować do indywidualnego celu przesiewania EPS (np. EPS o niskiej lepkości). Nasze podejście miało na celu znalezienie wydajnych producentów styropianu. W przypadku poszukiwania szczepów, które wytwarzają tylko niewielkie ilości EPS, należy zmniejszyć limit oceny ekwiwalentu glukozy.
Korzyści techniczne i przyszłe zastosowania: Jedną z interesujących cech tego protokołu jest modułowy charakter kroków i różnych modułów analitycznych. Można je łączyć na różne sposoby, dostosowywać do indywidualnych wymagań i łatwo wdrażać nowatorskie moduły. Ponadto moduły analityczne mogą być używane oddzielnie, np. moduł hydrolizy w połączeniu z modułem derywatyzacji HT-PMP jest w stanie przeprowadzić analizę składu monomerycznego z różnych roztworów polimerowych (1 g/l) w formacie 96-dołkowym. W przypadku laboratoriów, które nie mają dostępu do systemu obsługi cieczy, pełne przesiewanie może być wykonywane ręcznie bez żadnych zmian w schemacie pipetowania. Jednak zastosowanie systemu obsługi cieczy zwiększa przepustowość do 768 szczepów (zamiast 192 szczepów w przypadku ręcznego przesiewania) dziennie. Opisany tutaj protokół umożliwia badanie przesiewowe różnych rodzajów, a tym samym badanie przesiewowe dużych kolekcji szczepów w celu zidentyfikowania nowych producentów EPS i przeanalizowania ich odcisku palca węglowodanów w jednym podejściu (ryc. 4). Co więcej, za pomocą szczegółowej analizy monosacharydów można przeprowadzić ukierunkowane badania przesiewowe pod kątem polisacharydów zawierających rzadkie cukry, takie jak fukoza, kwasy uronowe, a nawet nieznane cukry. Można również wykryć różne kombinacje cukrów w określonych proporcjach. Umożliwia to prostą identyfikację strukturalnie powiązanych wariantów już znanego EPS lub nowatorskiego EPS.

Mikrobiologiczne egzopolisacharydy (EPS) to strukturalnie bardzo zróżnicowana grupa polimerów, które spełniają różne funkcje biologiczne. Zwykle są one zbudowane ze złożonych jednostek powtórzeniowych, które wyróżniają się różnymi rodzajami monomerów (cukier, pochodne cukru, kwasy cukrowe), wiązaniami między tymi monomerami i ich podstawieniami. Różnorodność strukturalna polisacharydów mikrobiologicznych nadaje raczej różne cechy członkom tej klasy cząsteczek, co pozwala na ich zastosowanie w różnych dziedzinach, takich jak żywność1, kosmetyki2,3, chemia budowlana4 lub uzdatnianie wody5. Aby jeszcze bardziej poszerzyć zakres zastosowań tych biopochodnych i takich zrównoważonych polimerów, identyfikacja nowych naturalnych polisacharydów mikrobiologicznych, a także inżynieria wariantów strukturalnych stanowią obiecujące podejście. Tak czy inaczej, wymagana jest szybka metoda przesiewowa, aby szybko zeskanować ogromną liczbę szczepów drobnoustrojów pod kątem tworzenia polisacharydów i przeanalizować ich produkty. W związku z tym opracowaliśmy niedawno 96-dołkową platformę przesiewową HT do analizy produkcji polisacharydów mikrobiologicznych z naturalnych izolatów lub zmodyfikowanych wariantów szczepów, która obejmuje identyfikację składu monomerycznego6.
Zastosowanie tej platformy do pierwszej rundy badań przesiewowych ~500 naturalnych izolatów pozwoliło nam zidentyfikować tylko około 10 do 20% izolowanych szczepów jako zdolnych do produkcji EPS (dane nie pokazane). Oznacza to, że 80-90% analizowanych szczepów nie wytwarzało EPS w zastosowanych warunkach, a zatem dalsza analiza szczegółowego odcisku palca węglowodanów nie była konieczna. Ponieważ ta wysoce wyrafinowana identyfikacja składu monomerycznego jest procesem czasochłonnym, zwłaszcza w przypadku analizy danych, szybka metoda wstępnego badania przesiewowego w celu identyfikacji szczepów dodatnich w produkcji EPS drastycznie zwiększyłaby wydajność. Ponadto odczynniki, materiały eksploatacyjne i czas pomiaru w UHPLC-UV-ESI-MS zostałyby zredukowane. Ponadto różne moduły analityczne z jednej strony sprawiają, że metoda jest wysoce niezawodna, ale z drugiej strony komplikują ręczną obsługę więcej niż dwóch 96-dołkowych płytek równolegle, a tym samym ograniczają pełny potencjał metody. Z tych powodów zdecydowaliśmy się na opracowanie zautomatyzowanej platformy przesiewowej. W związku z tym połączyliśmy modułowy format istniejącej techniki odcisków palców węglowodanów z w pełni zautomatyzowaną metodą szybkiego wykrywania całkowitej zawartości cukru, opartą na pomiarze absorbancji.
Metoda kwasu fenolowo-siarkowego nadal stanowi metodę wyboru do szybkiego oznaczania całkowitej zawartości węglowodanów w bakteryjnych i roślinnych polisacharydach7,8. Metoda ta została po raz pierwszy opisana przez Dubois i wsp. 9 i dostosowane do różnych zastosowań i wielkości próbek, nawet dla małych skali na płytkach 96-dołkowych10,11. Metoda kwasu fenolowo-siarkowego mierzy całkowitą zawartość węglowodanów za pomocą jednej wartości, sumując wszystkie węglowodany monomeryczne, oligomeryczne i polimerowe w próbkach.
Biorąc pod uwagę te aspekty, wybór odpowiedniego podłoża uprawowego jest niezbędny do zastosowania tej metody. Złożone podłoża zawierające oligomeryczne lub polimerowe związki węglowodanowe, takie jak ekstrakt drożdżowy, mogą prowadzić do zmiany zawartości polimeru i dlatego należy ich bezwzględnie unikać. Ponadto duże ilości cukrów są wykorzystywane jako źródło C do uprawy szczepów. Wysoki poziom węglowodanów pozostałych w procesie uprawy może negatywnie wpływać na pomiar zawartości EPS.
Dlatego zaleca się stosowanie zdefiniowanych i czystych cukrów. W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy glukozę do hodowli komórek. Pozostała glukoza po hodowli została zredukowana przez filtrację żelową i oznaczona za pomocą testu glukozy. Na koniec obliczono ekwiwalenty glukozy polisacharydów, odejmując pozostałą glukozę po filtracji żelowej od całkowitej zawartości węglowodanów, która została wykryta metodą fenolowo-siarkową. Filtracja żelowa i test glukozy w połączeniu z metodą fenolowo-siarkową zapewniają wiarygodne wyniki i mogą być naszym pierwszym, całkowicie zautomatyzowanym systemem wykrywania.
Dwa nowe moduły analityczne zostały włączone do zautomatyzowanej platformy przesiewowej, aby zwiększyć ilość informacji z systemu wykrywania EPS: opady i obserwacja wzrostu lepkości.
Wiele różnych EPS - np. sukcynoglikan, ksantan i kwas okrężnicy12 - są modyfikowane niewęglowodanowym ketalem pirogronianowym na pozycjach cukru C4 i C6. Te ketale pirogronianowe (podobnie jak półestry sukcynylu i kwasy uronowe) przyczyniają się do charakteru polianionowego, a tym samym do właściwości fizycznych polimeru poprzez oddziaływanie za pośrednictwem dwuwartościowych mostków kationowych13. W celu zidentyfikowania tych konkretnych polimerów ustalono oznaczanie pirogronianu jako kolejnego dodatkowego modułu analitycznego. Zwiększa to informacje o podstawnikach polisacharydowych i ich potencjalnych właściwościach makroskopowych.
Połączenie wszystkich modułów umożliwia identyfikację różnych EPS, jak również szybkie i efektywne określenie producentów EPS. W ten sposób platformę przesiewową można podzielić na dwie główne części (rys. 1). W ramach zautomatyzowanego przesiewania (część I) przepływ pracy jest w pełni zautomatyzowany (Tabela 1) w celu szybkiej wstępnej selekcji szczepów wytwarzających EPS. Analiza odcisków palców węglowodanów (część II) ilościowo określa skład monomerów EPS wytwarzanych przez wstępnie wybrane szczepy. W ten sposób analiza danych została zminimalizowana w celu optymalizacji badań przesiewowych dużych zbiorów szczepów. Daje to możliwość analizy 384 szczepów w jednym zautomatyzowanym cyklu przesiewowym oraz przy dwóch możliwych seriach dziennie po 768 szczepów dziennie. Dodatkowo, analiza odcisków palców węglowodanów daje jeszcze bardziej szczegółowy przegląd wszystkich zidentyfikowanych EPS. Umożliwia to ukierunkowaną analizę i identyfikację tylko nieznacznie różniących się wariantów EPS lub zupełnie nowych w porównaniu z opisanymi już strukturami chemicznymi EPS.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa płytka głębinowa 2,0 ml (DWP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780271</td><td>Kultura główna (CP 1-1 do 1-4), płytki równowagowe do filtracji żelowej (CP 1-6, 1-7, 2-6 i 2-7), rozcieńczenie 1:100 do oznaczania glukozy (CP 4-1 do 4-4) zawierające 990&nbsp; &mikro; l z ddH2O</td></tr><tr><td>Oddychająca folia uszczelniająca</td><td>Axygen</td><td>BF-400-S Folia</td><td>inkubacyjna do hodowli wstępnej i głównej Aluminiowa</td></tr><tr><td>folia uszczelniająca</td> DWP <td>Axygen</td><td>PCR-AS-200-80</td> <td>&deg; Folia do przechowywania C do płytek z glicerolem</td></tr><tr><td>MCA96 Zagnieżdżone jednorazowe końcówki 200 i mikro; l</td><td>TECAN</td><td>30038619</td><td>Pozycja stołu roboczego (WTP 2-1 do 2-4)</td></tr><tr><td>A/B szklana płyta filtracyjna 1&nbsp; &mikro; m</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8031</td><td>Przechowywany na płytce kolektora (CP 2-1 do 2-4)</td></tr> <tr><td>96-dołkowa mikro płytka miareczkowa V-Bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>Płytka kolektora do płytki filtracyjnej (CP 2-1 do 2-4)</td></tr><tr><td>96-dołkowa kolumna spinowa G-25</td><td>Aparat Harvard</td><td>74-5612</td><td>Przechowywana na myciu DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 i 2-7)</td></tr><tr><td>96-dołkowa mikro płytka miareczkowa V-Bottom</td><td>Nunc</td><td>249944</td><td>Płytka kolektora do płyty do filtracji żelowej (CP 3-1 do 3-4)</td></tr><tr><td>Zagnieżdżone końcówki jednorazowe SBS 50 &micro; l końcówki</td><td>TECAN</td><td>30038609</td><td>Pozycja karuzelowa (CP 4-6, 4-7 i 5-1 do 5-6)</td></tr><tr><td>Koryto 250 ml</td><td>Axygen</td><td>Res-SW96-HP</td><td>Woda WTP 1-1, Mieszanina odczynników do oznaczania glukozy WPT 1-2, bufor octanu amonu pH 5,6 (CP 5-7)</td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka miareczkowa F-Bottom (MTP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>strącanie 1 (CP 6-1 do 6-4), wartość pH (CP 7-1 do 7-4), wytrącanie 2 (CP 8-1 do 8-4), metoda kwasu fenolowo-siarkowego (CP 8-5 do 8-8), test glukozy (CP 9-1 do 9-9), płytki atrapy (WTP 3-1, 3-2)</td></tr><tr><td>96-dołkowa mata silikonowa&nbsp;</td><td>Whatmann</td><td>7704-0105</td><td>Mata ochronna do MTP</td></tr><tr><td>200 &micro; l końcówki do pipet</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>Do ręcznej obsługi</td></tr><tr><td>1 000 &mikro; l końcówki do pipet</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>Do ręcznej obsługi</td></tr><tr><td>96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania PCR&nbsp;</td><td>Marka</td><td>781350</td><td>Hydroliza, derywatyzacja PMP</td></tr><tr><td>TPE (elastomer termoplastyczny) mata do czapek&nbsp;</td><td>Marka</td><td>781405</td><td>Hydroliza, PMP-derywatyzacja</td></tr><tr><td>Płyta filtracyjna 0,2&nbsp; &mikro; m Supor</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8019</td><td>Filtracja próbek do analizy UHPLC-ESI-MS z płytką kolektora MTP</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet LHS 5-300&nbsp; &mikro; l</td><td>Marka</td><td>732150</td><td>Markowy system LHS</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td>Test glukozy</td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanowa&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Test glukozy, test pirowatowy</td></tr><tr><td>DA-64 (N-(sól sodowa karboksymetyloaminokarbonylo)-4,4'-bis(dimetyloamino)-difenyloamina)Wako</td> <td>Chemicals GmbH</td><td>043-22351</td><td>Test pirogronianowy</td></tr><tr><td>Oksydaza pirogronianowa&nbsp;</td><td>Test Sigma-Aldrich</td><td>P4591</td><td>Test pirowatowy</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Carl-Roth</td><td>P749.3</td><td>Test pirowatu i glukozy</td></tr><tr><td>Jednozasadowy fosforan potasu</td><td>Carl-Roth</td><td>3904.3</td><td>Test pirogronowy i glukozy</td></tr><tr><td>Pirofosforan tiaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754</td><td>Test pirowata:</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31413</td><td>Test pirogronowy</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>VWR</td><td>20922.466</td><td>Strącanie</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>VWR</td><td>20599.231</td><td>Metoda fenolowo-siarkowa</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Carl-Roth</td><td>4623.4</td><td>Metoda fenolowo-siarkowa</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>Hydroliza</td></tr><tr><td>Roztwór amonu</td><td>Carl-Roth</td><td>P093.1</td><td>Hydroliza, PMP-derywatyzacja</td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>Hydroliza, PMP-derywatyzacja</td></tr><tr><td>Fenol czerwony&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21710</td><td>Hydroliza, PMP-derywatyzacja</td></tr><tr><td>1-fenylo-3-metylo-5-pirazolon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M70800</td><td>PMP-derywatyzacja</td></tr><tr><td>Metanol LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.320</td><td>PMP-derywatyzacja</td></tr><tr><td>Acetonitryl LC-MS</td><td>VWR</td><td>83040.320</td><td>PMP-derywatyzacja</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338826</td><td>PMP-derywatyzacja</td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>PMP-derywatyzacja</td></tr><tr><td>Czerwień metylowa</td><td>Alfa Aesar</td><td>36667</td><td>Wartość pH</td></tr><tr><td>Zrobotyzowany system obsługi cieczy&nbsp;</td>Konfiguracja stołu roboczego <td>Tecan</td><td>Freedom EVO</td><td>w <mocny>Rysunek 2</mocny></td></tr><tr><td>Stacja obsługi cieczy Marka LHS</td><td></td><td>709400</td><td>Konfiguracja stołu roboczego w <mocny>Rysunek 2</mocny></td></tr><tr><td>Adapter końcówki</td><td>Marka</td><td>709434</td><td>Konfiguracja stołu roboczego w <silny>Rysunek 2</mocny></td></tr><tr><td>Płyn kończy się MC 20-300&nbsp; &mikro; l</td><td>Marka</td><td>709416</td><td>Konfiguracja stołu roboczego w <silny>Rysunek 2< / mocny></td></tr><tr><td>Adapter 60 mm</td><td>Marka</td><td>709430</td><td>Konfiguracja stołu roboczego w <mocny>Rysunek 2< / silny></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Wiele mikroorganizmów jest zdolnych do produkcji i wydzielania egzopolisacharydów (EPS), które mają ważne implikacje w dziedzinach medycyny, zastosowań spożywczych lub w zastępowaniu chemikaliów na bazie ropy naftowej. Opisujemy platformę analityczną, która ma być zautomatyzowana w systemie obsługi cieczy, która umożliwia szybką i niezawodną analizę rodzaju i ilości EPS wytwarzanego przez mikroorganizmy. Umożliwia użytkownikowi identyfikację nowych naturalnych mikrobiologicznych producentów egzopolisacharydów oraz analizę odcisku palca węglowodanów odpowiednich polimerów w ciągu jednego dnia w wysokiej przepustowości (HT). Za pomocą tej platformy można badać kolekcje szczepów, a także biblioteki wariantów szczepów, które można uzyskać w podejściach inżynieryjnych. Platforma ma modułową konfigurację, która pozwala na rozdzielenie protokołu na dwie główne części. Po pierwsze, istnieje zautomatyzowany system przesiewowy, który łączy w sobie różne moduły wykrywania polisacharydów: półilościową analizę tworzenia lepkości na etapie wirowania, analizę tworzenia polimerów poprzez wytrącanie alkoholu oraz oznaczanie całkowitej zawartości węglowodanów poprzez przemianę fenolowo-siarkowo-kwasową. W tym przypadku możliwe jest przesiewanie do 384 szczepów na cykl. Druga część zawiera szczegółową analizę monosacharydów dla wszystkich wybranych producentów EPS zidentyfikowanych w pierwszej części poprzez połączenie dwóch podstawowych modułów: analizy pełnego składu monomerów za pomocą ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z wykrywaniem pułapki jonowej w ultrafiolecie i jonizacji elektrorozpylanej (UHPLC-UV-ESI-MS) oraz oznaczania pirogronianu jako podstawnika polimerowego (obecność ketalu pirogronianowego) poprzez utlenianie enzymatyczne, które jest sprzężone z tworzeniem koloru. Wszystkie moduły analityczne tej platformy przesiewowej można łączyć na różne sposoby i dostosowywać do indywidualnych wymagań. Dodatkowo wszystkie mogą być obsługiwane ręcznie lub wykonywane za pomocą systemu obsługi cieczy. W ten sposób platforma przesiewowa zapewnia ogromną elastyczność w identyfikacji różnych EPS.

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Ogólnym celem tego podejścia jest szybkie i wiarygodne badanie przesiewowe producentów egzopolisacharydów drobnoustrojów oraz identyfikacja ich odcisków palców węglowodanów. Jest to niezbędny krok w celu wykorzystania niezbadanej różnorodności egzopolisacharydów. Nasza metoda może przyczynić się do przyspieszenia badań nad polimerami w dziedzinie mikrobiologicznych egzopolisacharydów.Umożliwia szybką identyfikację nowych wariantów polisacharydów o różnych właściwościach do konkretnych zastosowań. Główną zaletą tej techniki jest połączenie różnych systemów wykrywania egzopolisacharydów w modułowej i całkowicie zautomatyzowanej koncepcji badań przesiewowych. To sprawia, że jest niezwykle szybki i niezawodny.Technika ta może być również wykonywana ręcznie w laboratoriach, w których nie ma dostępnej platformy automatyzacji, dzięki czemu jej zastosowanie jest bardzo elastyczne i można je dostosować do różnych potrzeb przesiewowych. Ta platforma przesiewowa egzopolisacharydów (EPS) ma modułową konfigurację, która umożliwia rozdzielenie protokołu na dwie główne części: zautomatyzowane badania przesiewowe i odciski palców węglowodanów. Pierwszym zadaniem jest wyhodowanie szczepów do przesiewania i usunięcie komórek przez odwirowanie.Szczepy są hodowane na glukozie jako źródle węgla w 96-dołkowych płytkach pokrytych oddychającą folią uszczelniającą na wytrząsarce z mikro płytką w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 1 000 obr./min. W dniu ekranu przygotuj stół roboczy robota i karuzelę magazynową zgodnie z opisem w tekście protokołu. Usuń oddychającą folię uszczelniającą z płytek i umieść główne kultury w pozycjach karuzeli od 1-1 do 1-4.Uruchom zautomatyzowany program robotyczny. Aby usunąć komórki po hodowli, przenieś główne płytki z głębokiej studzienki kulturowej z karuzeli do wirówki i odwiruj przy 4, 300 x g i 20 stopniach Celsjusza przez 30 minut. W celu wytrącenia przed filtracją należy przesunąć płytki z mikromiareczkowaniem, a także płytki z mikromiareczkowaniem ze wskaźnikiem pH, z karuzeli na stół roboczy.Przenieś również płyty filtracyjne, które zapewniają całkowite usunięcie wszystkich komórek bakteryjnych, wraz z płytami kolektora do ich pozycji stołu roboczego. Po odwirowaniu przenieść 180 mikrolitrów głównego supernatantu kulturowego na płytkę filtracyjną. Odessać 150 mikrolitrów z supernatantu z kultury głównej i dozować 50 mikrolitrów do płytki mikromiareczkowej w celu wytrącenia przed filtracją i 100 mikrolitrów do płytki wskaźnika pH.Wytrącanie supernatantu za pomocą 2-propanolu przeprowadza się w celu oceny produkcji EPS. Użyj 12,5-mililitrowej pipety wieloetapowej, aby ręcznie dodać 150 mikrolitrów 2-propanolu do każdej studzienki. Po potrząśnięciu mikropłytkami miareczkowymi w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 900 obr./min, obserwuj wzrokowo formacje włókien lub płatków, które wskazują na produkcję EPS.Po tym, jak główne płytki hodowlane zostaną umieszczone z powrotem w karuzeli, zbadaj buliony fermentacyjne, które powinny wykazywać zmniejszoną sedymentację po odwirowaniu. Wzrost lepkości jest kolejnym wskaźnikiem produkcji EPS. Drugim zadaniem jest zapewnienie całkowitego usunięcia komórek z lepkiego bulionu fermentacyjnego poprzez 96-dołkową filtrację.Odwirować płytki filtracyjne przy 3 000 x g i temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie przywróć płytki do pozycji wyjściowej karuzeli i wykonaj równoważenie filtracji żelowej zgodnie z opisem w tekście protokołu. Następnie odpipetować 35 mikrolitrów filtratu do środka zrównoważonej płytki żelowo-filtracyjnej i 50 mikrolitrów do płytki do mikromiareczkowania, która jest używana do wytrącania.Przenieś płytki do filtracji żelu do wirówki, a wszystkie inne płytki ze stołu roboczego przesuń z powrotem do pozycji początkowych w karuzeli. Po umieszczeniu wszystkich płytek z powrotem w karuzeli, należy zwrócić uwagę na supernatanty o wysokiej lepkości, na co wskazują pozostałości w płycie filtracyjnej. Brak filtratu może prowadzić do fałszywie ujemnych wyników w następujących modułach analitycznych.Trzecim zadaniem w zautomatyzowanych badaniach przesiewowych jest usunięcie pozostałych cukrów monomerycznych z pożywki wzrostowej za pomocą 96-dołkowej filtracji żelowej. Odwirować żelowe płytki filtracyjne o sile 1 000 x g i temperaturze 20 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Przygotuj stół roboczy za pomocą manipulatora robota do przetwarzania filtratów żelowych.Aby wykryć pozostałą glukozę po filtracji żelowej, używamy końcówek o pojemności 50 mikrolitrów, aby przenieść 25 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody na świeżą płytkę z mikromiareczkowaniem. Odessać 20 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody, pięć mikrolitrów powietrza i 5 mikrolitrów filtratu żelowego i dozować do tej samej płytki. Weź końcówki o pojemności 200 mikrolitrów i odessaj 50 mikrolitrów mieszaniny odczynników do oznaczania glukozy z pozycji stołu roboczego 1-2, aby rozpocząć pierwszy test.Przenieś płytki z mikromiareczkowaniem do inkubatora. Po 30 minutach inkubacji przenieś płytki z inkubatora do czytnika mikromiana i zapisz absorbancję przy 418 i 480 nanometrach. Aby oznaczyć całkowitą zawartość węglowodanów metodą fenolowo-siarkową, należy odpipetować 20 mikrolitrów filtratu żelowego do płytek z mikromiareczkiem.Ręcznie wyjmij talerze z karuzeli i umieść je w stacji obsługi cieczy. Dołączyć płytkę kalibracyjną z 20 mikrolitrami o różnych stężeniach glukozy w trzech egzemplarzach. Umieść pojemnik na odpady w pozycji 1, pojemnik na końcówki o pojemności 300 mikrolitrów w pozycji 2 i 250-mililitrowe koryto ze 110 mililitrami świeżo przygotowanego kwasu fenolowo-siarkowego w pozycji 3.Użyj 8-kanałowej pipety z końcówkami o pojemności 300 mikrolitrów, aby przenieść 180 mikrolitrów kwasu fenolowo-siarkowego do każdego rzędu wszystkich płytek. Przykryj wszystkie płytki mikromiareczkowania pokrywkami i mieszaj, potrząsając przez pięć minut z prędkością 900 obr./min w temperaturze pokojowej. Inkubować przez 35 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza w piekarniku w celu uzyskania reakcji barwnej.Po schłodzeniu płytek pod wyciągiem zmierz wygaszanie na 480 nanometrach. Szczepy z automatycznych badań przesiewowych są oznaczane jako dodatnie pod względem EPS, jeśli spełniają co najmniej dwa z poniższych trzech kryteriów. Kontrola lepkości, wykrywanie polimeru i obliczanie ekwiwalentu glukozy.Ekwiwalent glukozy oblicza się przy użyciu tego równania. Odcisk palca węglowodanów platformy przesiewowej zawiera trzy ostatnie zadania, które są wykonywane ręcznie. Pozostały filtrat z dodatnich trafień z zadania drugiego stanowi podstawę dla filtratu żelowego w zadaniu piątym.Zadanie szóste to 96-dołkowa mikrohydoliza filtratu żelowego. Aby to osiągnąć, najpierw użyj 12-kanałowej pipety o pojemności 50 mikrolitrów, aby przenieść 20 mikrolitrów filtratu żelowego na nową płytkę PCR. Następnie użyj 1,25-mililitrowej pipety wieloetapowej, aby dodać 20 mikrolitrów czterech molowych kwasów trifluorooctowych do każdego dołka.Przykryj płytkę PCR matą z termoplastycznego elastomeru i umieść płytkę PCR w specjalnym urządzeniu zaciskowym. Wymieszaj roztwory, obracając 10-krotnie urządzenie mocujące. Po odwirowaniu płytki PCR i zabezpieczeniu jej w urządzeniu zaciskowym, należy umieścić zabezpieczone urządzenie mocujące w podgrzanej łaźni piaskowej i inkubować w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 90 minut.Używając 12-kanałowej pipety o pojemności 200 mikrolitrów, dodaj 3,2% roztwór amoniaku, aby dostosować pH do około ośmiu. Przykryj płytkę PCR matą z termoplastycznego elastomeru i potrząśnij nią ręcznie za pomocą urządzenia zaciskowego. Ostatnim zadaniem jest analiza węglowodanowego odcisku palca za pomocą wysokoprzepustowej metody 1-fenylo-3-metylo-5-pirazolonu lub HTPMP.Aby rozpocząć tę procedurę, użyj 12-kanałowej pipety o pojemności 50 mikrolitrów, aby przenieść 25 mikrolitrów zobojętnionego hydrolizatu na świeżą płytkę PCR. Dodać 75 mikrolitrów mieszaniny odczynników do derywatyzacji i przykryć płytkę matą z termoplastycznego elastomeru. Umieść płytkę PCR w cyklerze PCR w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 100 minut, a następnie schładzaj do 20 stopni Celsjusza.Przenieś podwielokrotność 20 mikrolitrów do nowej płytki do mikromiareczkowania, a następnie użyj 12-kanałowej pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby dodać 130 mikrolitrów 19,23 milimolowego kwasu octowego do każdej linii. Wymieszać bezpośrednio przez zasysanie i dozowanie co najmniej sześć razy, a następnie przenieść całą ciecz na 0,2-mikrometrową płytkę filtracyjną z płytką kolektora z mikromiareczkiem. Odwirować płytkę o masie 1 000 x g przez pięć minut, wyjąć płytkę filtracyjną i uszczelnić płytkę kolektora mikromiareczkowego silikonową matą z nasadką.Umieścić mikropłytkę miareczkową w UHPLC-UV-ESI-MS w celu wyznaczenia odcisku palca węglowodanów. Poniższa tabela przedstawia wyniki trzech przykładowych nowych szczepów, które udało się zidentyfikować za pomocą tej platformy przesiewowej. W lewej części tabeli przedstawiono wyniki zautomatyzowanych modułów przesiewowych dotyczących tworzenia lepkości, produkcji polimerów oraz ekwiwalentu glukozy z całkowitej hydrolizy, które wykorzystano jako parametry oceny do szczegółowej analizy węglowodanowych odcisków palców.Węglowodanowy odcisk palca oparty na skalibrowanych cukrach, a także nieznanych cukrach, dimerach i podstawnikach znajduje się w prawej części tabeli. Korzystając z tych informacji, można obliczyć skład monomeryczny i porównać go ze znanymi już strukturami polimerowymi. Ponadto można przeprowadzić ukierunkowane badania przesiewowe pod kątem interesujących kompozycji monomerycznych i rzadkich węglowodanów.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać dla 386 szczepów w ciągu zaledwie pięciu godzin. Zgodnie z tą procedurą, można dołączyć dodatkowe testy, takie jak już istniejący pirogronian lub dalsze testy na octany lub fosforany, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie dotyczące deklaracji egzopolisacharydów. Po opracowaniu, technika ta, dzięki swojej wysokiej czułości, utorowała drogę naszym badaniom w dziedzinie genetycznie modyfikowanych, mikrobiologicznych producentów egzopolisacharydów w celu zbadania wpływu zmienionych szlaków biosyntezy egzopolisacharydów na znajdującą się w nich strukturę chemiczną.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować nowych producentów egzopolisacharydów w bardzo szybki i niezawodny sposób.

automated-modular-high-throughput-exopolysaccharide-screening

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Opisano prostą i szybką metodę określania potencjału sacharyfikacji dla dużej liczby próbek biomasy roślinnej. Zautomatyzowana platforma do tej analizy obejmuje przygotowanie biomasy roślinnej do analizy w płytkach 96-dołkowych, a następnie przeprowadzenie obróbki wstępnej, hydrolizy oraz kwantyfikacji uwolnionych cukrów.

Wysokoprzepustowy test sacharyfikacji materiałów lignocelulozowych

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

W tym filmie demonstrujemy wysokoprzepustowy test do badania przesiewowego enzymów aktywnych węglowodanowo przy użyciu nierozpuszczalnych chromogennych substratów polimerowo-hydrożelowych. Enzym rozkłada te substraty do rozpuszczalnego kolorowego produktu, który można określić ilościowo, mierząc intensywność koloru produktu.

Test przesiewowy enzymów na bazie hydrożelu polimerowego chromogenicznego: wysokoprzepustowa metoda badania przesiewowego enzymów aktywnych węglowodanami przy użyciu substratów syntetycznych

Struktura ściany komórkowej roślin i cechy chemiczne są oceniane w celu zidentyfikowania idealnych surowców do produkcji biopaliw i biomateriałów. Standardowe metody mają ograniczenia, gdy są stosowane do dużych zestawów danych. Te wysokoprzepustowe metody obróbki wstępnej, scukrzania enzymatycznego i pirolizy ze spektrometrią mas wiązki molekularnej porównują dużą liczbę próbek biomasy przy skróconym czasie i kosztach eksperymentu.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Opisujemy tutaj wysokoprzepustowe wykrywanie i kwantyfikację fukozylowanych oligosacharydów mleka ludzkiego (HMO) za pomocą biosensora obejmującego całe komórki. Pokazujemy tutaj również adaptację tej platformy do analizy szczepów produkcyjnych HMO, koncentrując się na poprawie stosunku sygnału do szumu.

Analiza fukozylowanych trisacharydów mleka ludzkiego w kontekście biotechnologicznym z wykorzystaniem genetycznie kodowanych biosensorów

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

System do automatycznej i szybkiej analizy glikanów na białkach został wcześniej opracowany. W artykule przedstawiono protokół "analizy glikojakościowej", zoptymalizowany dla szerokiego spektrum użytkowników, takich jak osoby zajmujące się analizą struktur glikanów w biofarmaceutykach i innych materiałach glikokoniugatowych.

Szybka ocena glikojakościowa białek rekombinowanych przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj zautomatyzowaną, modułową metodę przesiewową egzopolisacharydów mikroorganizmów z analizą odcisków palców węglowodanów. To podejście przyspiesza badania polimerów i identyfikację nowych wariantów polisacharydów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów (Wideo) | JoVE Journal

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Przeglądaj więcej filmów