Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Ogólnym celem tego podejścia jest szybkie i wiarygodne badanie przesiewowe producentów egzopolisacharydów drobnoustrojów oraz identyfikacja ich odcisków palców węglowodanów. Jest to niezbędny krok w celu wykorzystania niezbadanej różnorodności egzopolisacharydów. Nasza metoda może przyczynić się do przyspieszenia badań nad polimerami w dziedzinie mikrobiologicznych egzopolisacharydów.

Umożliwia szybką identyfikację nowych wariantów polisacharydów o różnych właściwościach do konkretnych zastosowań. Główną zaletą tej techniki jest połączenie różnych systemów wykrywania egzopolisacharydów w modułowej i całkowicie zautomatyzowanej koncepcji badań przesiewowych. To sprawia, że jest niezwykle szybki i niezawodny.

Technika ta może być również wykonywana ręcznie w laboratoriach, w których nie ma dostępnej platformy automatyzacji, dzięki czemu jej zastosowanie jest bardzo elastyczne i można je dostosować do różnych potrzeb przesiewowych. Ta platforma przesiewowa egzopolisacharydów (EPS) ma modułową konfigurację, która umożliwia rozdzielenie protokołu na dwie główne części: zautomatyzowane badania przesiewowe i odciski palców węglowodanów. Pierwszym zadaniem jest wyhodowanie szczepów do przesiewania i usunięcie komórek przez odwirowanie.

Szczepy są hodowane na glukozie jako źródle węgla w 96-dołkowych płytkach pokrytych oddychającą folią uszczelniającą na wytrząsarce z mikro płytką w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 1 000 obr./min. W dniu ekranu przygotuj stół roboczy robota i karuzelę magazynową zgodnie z opisem w tekście protokołu. Usuń oddychającą folię uszczelniającą z płytek i umieść główne kultury w pozycjach karuzeli od 1-1 do 1-4.

Uruchom zautomatyzowany program robotyczny. Aby usunąć komórki po hodowli, przenieś główne płytki z głębokiej studzienki kulturowej z karuzeli do wirówki i odwiruj przy 4, 300 x g i 20 stopniach Celsjusza przez 30 minut. W celu wytrącenia przed filtracją należy przesunąć płytki z mikromiareczkowaniem, a także płytki z mikromiareczkowaniem ze wskaźnikiem pH, z karuzeli na stół roboczy.

Przenieś również płyty filtracyjne, które zapewniają całkowite usunięcie wszystkich komórek bakteryjnych, wraz z płytami kolektora do ich pozycji stołu roboczego. Po odwirowaniu przenieść 180 mikrolitrów głównego supernatantu kulturowego na płytkę filtracyjną. Odessać 150 mikrolitrów z supernatantu z kultury głównej i dozować 50 mikrolitrów do płytki mikromiareczkowej w celu wytrącenia przed filtracją i 100 mikrolitrów do płytki wskaźnika pH.

Wytrącanie supernatantu za pomocą 2-propanolu przeprowadza się w celu oceny produkcji EPS. Użyj 12,5-mililitrowej pipety wieloetapowej, aby ręcznie dodać 150 mikrolitrów 2-propanolu do każdej studzienki. Po potrząśnięciu mikropłytkami miareczkowymi w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 900 obr./min, obserwuj wzrokowo formacje włókien lub płatków, które wskazują na produkcję EPS.

Po tym, jak główne płytki hodowlane zostaną umieszczone z powrotem w karuzeli, zbadaj buliony fermentacyjne, które powinny wykazywać zmniejszoną sedymentację po odwirowaniu. Wzrost lepkości jest kolejnym wskaźnikiem produkcji EPS. Drugim zadaniem jest zapewnienie całkowitego usunięcia komórek z lepkiego bulionu fermentacyjnego poprzez 96-dołkową filtrację.

Odwirować płytki filtracyjne przy 3 000 x g i temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie przywróć płytki do pozycji wyjściowej karuzeli i wykonaj równoważenie filtracji żelowej zgodnie z opisem w tekście protokołu. Następnie odpipetować 35 mikrolitrów filtratu do środka zrównoważonej płytki żelowo-filtracyjnej i 50 mikrolitrów do płytki do mikromiareczkowania, która jest używana do wytrącania.

Przenieś płytki do filtracji żelu do wirówki, a wszystkie inne płytki ze stołu roboczego przesuń z powrotem do pozycji początkowych w karuzeli. Po umieszczeniu wszystkich płytek z powrotem w karuzeli, należy zwrócić uwagę na supernatanty o wysokiej lepkości, na co wskazują pozostałości w płycie filtracyjnej. Brak filtratu może prowadzić do fałszywie ujemnych wyników w następujących modułach analitycznych.

Trzecim zadaniem w zautomatyzowanych badaniach przesiewowych jest usunięcie pozostałych cukrów monomerycznych z pożywki wzrostowej za pomocą 96-dołkowej filtracji żelowej. Odwirować żelowe płytki filtracyjne o sile 1 000 x g i temperaturze 20 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Przygotuj stół roboczy za pomocą manipulatora robota do przetwarzania filtratów żelowych.

Aby wykryć pozostałą glukozę po filtracji żelowej, używamy końcówek o pojemności 50 mikrolitrów, aby przenieść 25 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody na świeżą płytkę z mikromiareczkowaniem. Odessać 20 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody, pięć mikrolitrów powietrza i 5 mikrolitrów filtratu żelowego i dozować do tej samej płytki. Weź końcówki o pojemności 200 mikrolitrów i odessaj 50 mikrolitrów mieszaniny odczynników do oznaczania glukozy z pozycji stołu roboczego 1-2, aby rozpocząć pierwszy test.

Przenieś płytki z mikromiareczkowaniem do inkubatora. Po 30 minutach inkubacji przenieś płytki z inkubatora do czytnika mikromiana i zapisz absorbancję przy 418 i 480 nanometrach. Aby oznaczyć całkowitą zawartość węglowodanów metodą fenolowo-siarkową, należy odpipetować 20 mikrolitrów filtratu żelowego do płytek z mikromiareczkiem.

Ręcznie wyjmij talerze z karuzeli i umieść je w stacji obsługi cieczy. Dołączyć płytkę kalibracyjną z 20 mikrolitrami o różnych stężeniach glukozy w trzech egzemplarzach. Umieść pojemnik na odpady w pozycji 1, pojemnik na końcówki o pojemności 300 mikrolitrów w pozycji 2 i 250-mililitrowe koryto ze 110 mililitrami świeżo przygotowanego kwasu fenolowo-siarkowego w pozycji 3.

Użyj 8-kanałowej pipety z końcówkami o pojemności 300 mikrolitrów, aby przenieść 180 mikrolitrów kwasu fenolowo-siarkowego do każdego rzędu wszystkich płytek. Przykryj wszystkie płytki mikromiareczkowania pokrywkami i mieszaj, potrząsając przez pięć minut z prędkością 900 obr./min w temperaturze pokojowej. Inkubować przez 35 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza w piekarniku w celu uzyskania reakcji barwnej.

Po schłodzeniu płytek pod wyciągiem zmierz wygaszanie na 480 nanometrach. Szczepy z automatycznych badań przesiewowych są oznaczane jako dodatnie pod względem EPS, jeśli spełniają co najmniej dwa z poniższych trzech kryteriów. Kontrola lepkości, wykrywanie polimeru i obliczanie ekwiwalentu glukozy.

Ekwiwalent glukozy oblicza się przy użyciu tego równania. Odcisk palca węglowodanów platformy przesiewowej zawiera trzy ostatnie zadania, które są wykonywane ręcznie. Pozostały filtrat z dodatnich trafień z zadania drugiego stanowi podstawę dla filtratu żelowego w zadaniu piątym.

Zadanie szóste to 96-dołkowa mikrohydoliza filtratu żelowego. Aby to osiągnąć, najpierw użyj 12-kanałowej pipety o pojemności 50 mikrolitrów, aby przenieść 20 mikrolitrów filtratu żelowego na nową płytkę PCR. Następnie użyj 1,25-mililitrowej pipety wieloetapowej, aby dodać 20 mikrolitrów czterech molowych kwasów trifluorooctowych do każdego dołka.

Przykryj płytkę PCR matą z termoplastycznego elastomeru i umieść płytkę PCR w specjalnym urządzeniu zaciskowym. Wymieszaj roztwory, obracając 10-krotnie urządzenie mocujące. Po odwirowaniu płytki PCR i zabezpieczeniu jej w urządzeniu zaciskowym, należy umieścić zabezpieczone urządzenie mocujące w podgrzanej łaźni piaskowej i inkubować w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 90 minut.

Używając 12-kanałowej pipety o pojemności 200 mikrolitrów, dodaj 3,2% roztwór amoniaku, aby dostosować pH do około ośmiu. Przykryj płytkę PCR matą z termoplastycznego elastomeru i potrząśnij nią ręcznie za pomocą urządzenia zaciskowego. Ostatnim zadaniem jest analiza węglowodanowego odcisku palca za pomocą wysokoprzepustowej metody 1-fenylo-3-metylo-5-pirazolonu lub HTPMP.

Aby rozpocząć tę procedurę, użyj 12-kanałowej pipety o pojemności 50 mikrolitrów, aby przenieść 25 mikrolitrów zobojętnionego hydrolizatu na świeżą płytkę PCR. Dodać 75 mikrolitrów mieszaniny odczynników do derywatyzacji i przykryć płytkę matą z termoplastycznego elastomeru. Umieść płytkę PCR w cyklerze PCR w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 100 minut, a następnie schładzaj do 20 stopni Celsjusza.

Przenieś podwielokrotność 20 mikrolitrów do nowej płytki do mikromiareczkowania, a następnie użyj 12-kanałowej pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby dodać 130 mikrolitrów 19,23 milimolowego kwasu octowego do każdej linii. Wymieszać bezpośrednio przez zasysanie i dozowanie co najmniej sześć razy, a następnie przenieść całą ciecz na 0,2-mikrometrową płytkę filtracyjną z płytką kolektora z mikromiareczkiem. Odwirować płytkę o masie 1 000 x g przez pięć minut, wyjąć płytkę filtracyjną i uszczelnić płytkę kolektora mikromiareczkowego silikonową matą z nasadką.

Umieścić mikropłytkę miareczkową w UHPLC-UV-ESI-MS w celu wyznaczenia odcisku palca węglowodanów. Poniższa tabela przedstawia wyniki trzech przykładowych nowych szczepów, które udało się zidentyfikować za pomocą tej platformy przesiewowej. W lewej części tabeli przedstawiono wyniki zautomatyzowanych modułów przesiewowych dotyczących tworzenia lepkości, produkcji polimerów oraz ekwiwalentu glukozy z całkowitej hydrolizy, które wykorzystano jako parametry oceny do szczegółowej analizy węglowodanowych odcisków palców.

Węglowodanowy odcisk palca oparty na skalibrowanych cukrach, a także nieznanych cukrach, dimerach i podstawnikach znajduje się w prawej części tabeli. Korzystając z tych informacji, można obliczyć skład monomeryczny i porównać go ze znanymi już strukturami polimerowymi. Ponadto można przeprowadzić ukierunkowane badania przesiewowe pod kątem interesujących kompozycji monomerycznych i rzadkich węglowodanów.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać dla 386 szczepów w ciągu zaledwie pięciu godzin. Zgodnie z tą procedurą, można dołączyć dodatkowe testy, takie jak już istniejący pirogronian lub dalsze testy na octany lub fosforany, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie dotyczące deklaracji egzopolisacharydów. Po opracowaniu, technika ta, dzięki swojej wysokiej czułości, utorowała drogę naszym badaniom w dziedzinie genetycznie modyfikowanych, mikrobiologicznych producentów egzopolisacharydów w celu zbadania wpływu zmienionych szlaków biosyntezy egzopolisacharydów na znajdującą się w nich strukturę chemiczną.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować nowych producentów egzopolisacharydów w bardzo szybki i niezawodny sposób.