Generowanie agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują łamanie symetrii, polaryzację i emergentne zachowania zbiorowe in vitro
24 listopada 2015
Opracowaliśmy protokół do generowania agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują samoorganizację, łamanie symetrii i wydłużanie równolegle do rozwoju osiowego. Technika ta pozwala na badanie osiowych procesów rozwojowych i generowanie typów komórek, które w innym przypadku są trudne do wykonania w hodowli jednowarstwowej.
Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wytworzenie jednorodnych agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które podlegają samoorganizacji i elongacji osiowej w hodowli zawiesinowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii rozwoju, takie jak rola oddziaływań tkankowych w specyfikacji osi oraz samoorganizacja w procesach takich jak gastrulacja. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie zdarzeń rozwojowych z nowej, dekonstrukcyjnej perspektywy poza embrionem przed etapem agregacji.
Komórki embrionalne myszy lub M MECs hoduj w medium ES.Lift w naczyniach hodowlanych o powierzchni 25 cm², pokrytych żelatyną, w celu generowania agregatów. Rozpocznij od naczynia hodowlanego z komórkami przy konfluencji od 40 do 60%; odessaj medium i dwa razy przepłucz naczynie PBS. Dodaj 1 mL 0,25% trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez około pięć minut, aby odkleić komórki od ścianek naczynia.
Następnie do zawiesiny ododerwanych komórek należy dodać pięć mililitrów medium Es.Lift i dokładnie wymieszać. Komórki należy przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów i pobrać aliquot o objętości jeden mililitr w celu policzenia komórek. Następnie pięć razy 10⁴ komórek należy dodać do pięciu mililitrów ciepłego PBS i wirować z prędkością 170 ×g przez pięć minut.
Odssać roztwór, uważając, aby nie naruszyć osadu. Następnie delikatnie dodać 5 ml PBS i powtórzyć wirowanie. Odssać maksymalną objętość cieczy, nie naruszając osadu komórkowego.
Aby zapobiec przeniesieniu PBS, resuspenduj osad komórkowy w 1 ml ogrzanego medium N2B27. Wymieszaj dokładnie za pomocą pipety P1000, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.
Następnie rozcieńczyć zawiesinę dodatkowymi czterema mililitrami pożywki N2B27. Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnego zbiornika za pomocą pipety wielokanałowej. Dokładnie wymieszać komórki i przenieść 40 µL zawiesiny komórkowej ze zbiornika do każdego dołka w płytce u-bottom nieprzeznaczonej do hodowli tkankowej.
Płytka 96-dołkowa. Specjalnie zastosowano płytkę niezgodną z hodowlą tkanek, aby zminimalizować przyleganie komórek do powierzchni. Inkubuj płytkę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C przy 5% CO2 przez 48 godzin, aby umożliwić agregację komórek po upływie 48 godzin.
Wyjmij płytkę z inkubatora, zaobserwuj komórki pod mikroskopem odwróconym i potwierdź obecność agregatów. Dodaj objętość 10 milimolarnego roztworu zapasu CHI 9 9 0 2 1 do ogrzanego N two B 27, aby uzyskać stężenie końcowe 3 mikromolarne. Jest to wtórne medium do stymulacji komórek.
Używając pipety wielokanałowej, nanieś 150 µL medium wtórnego do każdej studni. Wykonaj to z siłą wystarczającą do usunięcia wszelkich przylegających agregatów. Po inkubacji zwróć płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych na 24 godziny.
Ostrożnie usuń medium, uważając, aby nie odessać agregatu komórkowego. Do każdej studzienki dodaj 150 µL świeżego N two B 27 z siłą wystarczającą do oderwania przylegających agregatów. Powtarzaj tę czynność co 24 godziny przez całkowity czas inkubacji wynoszący około pięć dni.
Aby przygotować agregaty do fiksacji, najpierw delikatnie odessij roztwór inkubacyjny z każdej studzienki, trzymając pipetę pod kątem 30 stopni. Aby zapobiec odessaniu agregatu komórkowego, dodaj do każdej studzienki 150 µL PBS. Odczekaj kilka minut, aż agregat opadnie na dno, a następnie odessij PBS.
Powtórz ten etap płukania jeszcze dwukrotnie, używając sterylnych nożyczek. Odetnij końcówkę pipety P 1000 w odległości około trzech milimetrów nad jej wylotem. Na koniec, używając tej końcówki, aspiruj i wydziel niewielką objętość cieczy do dołka.
Należy wymieszać agregat, aby odczepić go od dna dołka. Następnie należy zaciągnąć agregat do końcówki i przenieść go do szkiełka do sekcji drosofil. Stosując tę samą procedurę, należy zebrać wszystkie agregaty, które zostaną poddane identycznym procedurom immunobarwienia, do jednego szkiełka.
Umieść wgłębnik sekcyjny pod mikroskopem i zakręć nim, aby przesunąć agregaty w stronę środka. Następnie ostrożnie odessaj PPS z krawędzi wgłębni, uważając, aby nie usunąć żadnych agregatów.
Aby utrwalić agregaty, należy dodać 1 mL świeżo przygotowanego 4% roztworu formaldehydu i inkubować naczynia w wytrząsarce orbitalnej przez dwie godziny w temperaturze 4 °C. Ustawić niską prędkość obrotową. Ostrożnie odessać roztwór formaldehydu, aby uniknąć zassania agregatów, a następnie dodać 1 mL PBS do dołka.
Przenieś płytkę z powrotem na wytrząsarkę orbitalną na 10 minut. Usuń PBS z dołka i powtórz ten etap płukania jeszcze dwa razy. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu P-B-S-F-T i umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 10 minut.
Odssać roztwór i powtórzyć przemywanie jeszcze dwa razy. Dodać 1 ml PBS-FT do każdej studzienki, aby zablokować agregaty przed nieswoistą immunoreaktywnością. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C.
Po inkubacji ostrożnie odessać roztwór blokujący z dołków i dodać 500 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w P-B-S-F-T. Uszczelnić płytkę paraformą, aby zapobiec odparowaniu, i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości. Następnie zastąpić roztwór przeciwciała pierwszorzędowego schłodzonym P-B-S-F-T.
Wypłucz agregaty, umieszczając płytkę na wytrząsarce orbitalnej. Ustaw niską prędkość w temperaturze 4 °C na pięć minut. Powtórz płukanie jeszcze raz.
Przeprowadzić dwa dodatkowe cykle płukania w roztworze P-B-S-F-T w temperaturze 4 °C przy niskiej prędkości na wytrząsarce orbitalnej. Zgodnie z protokołem tekstowym, usunąć roztwór płuczący i inkubować z 500 µl przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w P-B-S-F-T. Dodać 1 µg/mL herst w celu wizualizacji jąder komórkowych i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze gyratorowym, chroniąc próbki przed światłem.
Przeprowadź kolejny cykl płukania w PBS FT w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc próbki przed światłem za pomocą pudełka owiniętego folią. Wykonaj dodatkowe płukania w PBS zawierającym 0,2% FBS i 0,2% Triton X 100 lub w buforze PBT w temperaturze pokojowej. Po ostrożnym odessaniu roztworu, inkubuj agregaty w jednym mililitrze mieszaniny glicerolu i PBT w stosunku jeden do jednego przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
Następnie inkubować je w 1 ml roztworu glicerolu i PBT w stosunku 7:3 przez 30 minut. Aby przygotować próbki do obrazowania konfokalnego, należy odessać roztwór glicerolu i PBT i zastąpić go 1 ml medium montażowego. Następnie nanieść agregaty w formie kropli o objętości 17 µl na szkiełko przedmiotowe.
Za pomocą końcówki pipety przygotuj dystans, składając kawałek dwustronnej taśmy czterokrotnie. Następnie umieść po jednym dystansie po obu stronach agregatów na szkiełku, odwróć szkiełko nakrywkowe, nasuń je na dystanse, a następnie obrazuj agregaty przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Po 48 godzinach od wysiania tworzą się agregaty o średnicy około 150 µm, które charakteryzują się gładkimi krawędziami.
Z drugiej strony, niska jakość medium, nieoptymalna liczba wysiewanych komórek lub słaba adhezja komórek mogą prowadzić do nieprawidłowej agregacji. 120 godzin ciągłego traktowania CHI 9 9 0 2 1, inhibitorem kinazy syntazy glikogenu 3, powoduje wydłużenie się sferycznego agregatu. Ponadto, po traktowaniu obserwuje się wyraźną lokalizację komórek pozytywnych pod kątem SOX GFP na jednym z końców agregatu; różne rodzaje traktowania prowadzą do odmiennych zmian morfologicznych w pojedynczym agregacie oraz w rozmieszczeniu markerów fluorescencyjnych.
Lokalizację w obrębie agregatu można śledzić w czasie. Po opanowaniu techniki badacz będzie w stanie wytworzyć agregaty w ciągu około 45 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Po uformowaniu się agregatów, zamiast barwienia immunocytochemicznego, można zastosować inne metody, takie jak Q-R-T-P-C-R, aby zbadać zmiany w ekspresji genów wewnątrz agregatów.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak formować agregaty z MEC, stosować określone bodźce oraz przygotowywać agregaty do barwienia immunocytochemicznego i analizy za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje generowanie agregatów z embrionalnych komórek macierzystych myszy, co umożliwia badanie samoorganizacji i wydłużania osiowego. Metoda ta dostarcza cennych informacji z zakresu biologii rozwoju, ułatwiając analizę oddziaływań tkankowych oraz specyfikacji typów komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Inżynieria tkankowa
Wprowadzenie
- Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą samoorganizować się i wydłużać w hodowli zawiesinowej.
- Technika ta pozwala na badanie złożonych procesów rozwojowych.
- Agregaty zapewniają nową perspektywę na rozwój embrionalny.
- Zrozumienie oddziaływań tkankowych jest kluczowe dla biologii rozwoju.
Cel badania
- W celu wytworzenia jednolitych agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy.
- W celu zbadania procesów rozwoju osiowego.
- W celu zbadania generowania typów komórek, które są trudne do uzyskania w hodowlach monowarstwowych.
Zastosowane metody
- Hodować mysie embrionalne komórki macierzyste w pożywce ES.Lift.
- Użyć trypsyny-EDTA do odrywania i agregowania komórek.
- Inkubować agregaty w płytce nieprzeznaczonej do hodowli tkanek.
- Wykonać immunobarwienie utrwalonych agregatów w celu przeprowadzenia analizy.
Główne wyniki
- Pomyślne utworzenie agregatów wykazujących samoorganizację.
- Obserwacja wydłużenia osiowego w agregatach.
- Potwierdzenie obecności agregatów za pomocą mikroskopii.
- Zastosowanie skutecznych technik immunobarwienia w odniesieniu do agregatów.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia badanie biologii rozwoju w kontrolowanym środowisku.
- Agregaty stanowią cenny model do zrozumienia rozwoju embrionalnego.
- Metoda ta może przyczynić się do postępów w badaniach nad komórkami macierzystymi i inżynierią tkankową.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia powtarzalne tworzenie agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują łamanie symetrii, polaryzację oraz wyłaniające się zachowania zbiorowe in vitro. Zapewnia on kontrolowany system do badania samoorganizacji i elongacji osiowej, oferując wartość prognostyczną dla wczesnych procesów rozwojowych oraz umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w modelach opartych na komórkach macierzystych. Podejście to wspiera walidację celów i screening fenotypowy poprzez generowanie struktur istotnych dla przebiegu chorób, które odtwarzają zdarzenia przypominające gastrulację bez zewnętrznych sygnałów asymetrii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych związanych z rozwojem osiowym i specyfikacją warstw zarodkowych poprzez obserwowalne łamanie symetrii i spolaryzowaną ekspresję genów.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez generowanie agregatów zdolnych do odpowiedzi na sygnały eksperymentalne, takie jak aktywacja Wnt/β-Catenin i inhibicja BMP.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia doprecyzowanie modeli przedklinicznych poprzez tworzenie struktur wykazujących ruchy przypominające gastrulację oraz markery warstw zarodkowych, co zwiększa pewność w zakresie modulacji szlaków rozwojowych.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowy odczyt poprzez mierzalne zmiany w morfologii, ekspresji genów i długości agregatów, co umożliwia analizę zależności dawka-odpowiedź w odniesieniu do sygnałów rozwojowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testu dzięki jednorodnemu tworzeniu agregatów w płytkach 96-dołkowych z dnem w kształcie litery U w określonych warunkach hodowli w zawiesinie.
- Skalowalność: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy i gotowość do przesiewania, umożliwiając agregację niewielkiej liczby mESC w formacie o wysokiej gęstości i niskiej adhezji, odpowiednim dla zautomatyzowanego dozowania cieczy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Oferuje istotny w kontekście chorób system do badania wczesnych zdarzeń rozwojowych, takich jak organizacja osiowa i specyfikacja losów komórek, łącząc wyniki uzyskane in vitro z embriogenezą in vivo.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Zmniejsza niejednoznaczność w procesach decyzyjnych komórek poprzez śledzenie w czasie lokalnego przemieszczania się komórek wykazujących pozytywną ekspresję SOX-GFP oraz elongacji osiowej, co wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka.
- Dostrojenie biomarkerów: Umożliwia analizę immunocytochemiczną specyficznych markerów w utrwalonych agregatach, co ułatwia odkrywanie translacyjnych biomarkerów w zastosowaniach związanych z toksycznością rozwojową lub medycyną regeneracyjną.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu badawczego – od wczesnej hodowli komórek macierzystych po analizę fenotypową – wspierając weryfikację hipotez w biologii rozwoju oraz umożliwiając dalsze zastosowania w identyfikacji związków wiodących i walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych, umożliwiając badaczom stosowanie bodźców oraz obserwację samoorganizacji, łamania symetrii i wydłużania osiowego w kontrolowanym systemie zawiesinowym.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy i wyniki ilościowe poprzez mikroskopię fluorescencyjną w trybie time-lapse lub w pojedynczym punkcie czasowym, co umożliwia porównanie morfologicznych i molekularnych zmian indukowanych sygnałem.
- Analityka: Dostarcza mierzalnych parametrów, w tym długości agregatów, wzorców ekspresji genów i zdarzeń odrywania się komórek, co pomaga zespołom porównywać warunki i oceniać trajektorię rozwojową.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez generowanie struktur wykazujących markery warstw zarodkowych i zorganizowaną morfologię istotną dla wczesnej embriogenezy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego generowania spolaryzowanych agregatów w wielu warunkach eksperymentalnych, co zmniejsza zmienność i wspiera badania podłużne w zakresie różnicowania komórek macierzystych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w modelowaniu wczesnych procesów rozwojowych poprzez uchwycenie wyłaniających się zachowań zbiorczych i polaryzacji bez zewnętrznej asymetrii.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym protokołom agregacji w nieprzylegających płytkach z dnem w kształcie litery U oraz ustandaryzowanym procesom stymulacji i fiksacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w procesach różnicowania komórek macierzystych, dostarczając wczesnych odczytów specyfikacji losu osiowego i zmniejszając zależność od ograniczeń związanych z kulturami adherentnymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację strategii różnicowania z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację warunków, które niezawodnie prowadzą do powstania wydłużonych, zorganizowanych agregatów z przestrzennie ograniczoną ekspresją markerów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Pomyślne generowanie i analiza agregatów wymagają doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, technice sterylnej oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Osiągnięcie optymalnych wyników zależy od dostępu do płytek 96-dołkowych z dnem w kształcie litery U, które nie zostały poddane obróbce do hodowli tkankowych, inkubatorów z wytrząsaniem oraz systemów obrazowania konfokalnego.
- Wymagana jest standaryzacja gęstości wysiewu komórek, jakości pożywki i czasu inkubacji pomiędzy zespołami, aby zapobiec niepowodzeniu agregacji wynikającemu z nieoptymalnego wysiewu lub adhezji.
- Rozszerzenie protokołu na inne systemy modelowe wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji, ponieważ zachowanie agregatów może różnić się w zależności od specyficznych dla gatunku właściwości adhezyjnych i pluripotencji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują m.in. wrażliwość na jakość pożywki i liczbę komórek, które muszą być kontrolowane w celu zapewnienia jednorodnego tworzenia agregatów i powtarzalnej polaryzacji.
