Name: Generowanie agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują łamanie symetrii, polaryzację i emergentne zachowania zbiorowe in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Poznaj metodę generowania agregatów z mysich komórek macierzystych embrionalnych do badania samoorganizacji i wydłużenia osiowego. Technika umożliwia analizę interakcji tkanek i specyfikacji typów komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest finansowana przez ERC Advanced Investigator Award dla AMA (DAT, TB) z wkładem grantu projektowego od Wellcome Trust dla AMA, stypendium EPSRC dla PB-J i Erasmusa, Stichting dr. Hendrik Muller's Vaderlandsch Fonds i Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage dla SCvdB. Pragniemy podziękować J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schröeterowi i T. Rodriguezowi za dyskusje i konstruktywną krytykę, Joaquìnowi de Navascuésowi za protokół pożywki montażowej oraz zarówno A.K. Hadjantonakisowi, jak i C. Budjanowi za podzielenie się protokołami ich laboratorium odnoszącymi się do barwienia zarodków w całości. Wcześniejsza wersja tego artykułu została wcześniej udostępniona na serwerze preprintów bioRxiv29.

1. Warunki hodowli przed agregacją
<ol>
	<li>Utrzymywać mESC w pożywce ESLIF (patrz Tabela Specyficznych Materiałów i Sprzętu w celu opracowania postaci) na pokrytych żelatyną kolbach o średnicy 25cm2 poddanych kulturom tkankowym w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO221-25.</li>
	<li>Hoduj komórki przez co najmniej dwa pasaże po rozmrożeniu przed użyciem w tym protokole; komórki w niższych pasażach są na ogół bardziej skuteczne w generowaniu powtarzalnych cech podczas eksperymentalnych powtórzeń (tj. nie więcej niż 15 pasaży w hodowli), jednak należy spodziewać się niewielkich różnic między różnymi liniami komórkowymi ES (patrz Tabela 2 dla badanych linii komórkowych).</li>
	<li>Hoduj komórki do 40-60% zbieżności. Nie używaj nadmiernie zlewających się komórek do agregacji.</li>
</ol>
2. Generowanie agregatów
<ol>
	<li> Wstępnie podgrzej PBS (+Ca2+, +Mg2+), ESLIF, N2B2726,27 i Trypsynę-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li> Odessać pożywkę hodowlaną z kolby do hodowli tkankowych (etap 1.3). Delikatnie przepłukać kolbę dwukrotnie 5 ml PBS. Odessać PBS i dodać 1 do 2 ml wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA (0,25%) w celu dysocjacji komórek.
	<ol>
		<li> Umieścić kolbę w inkubatorze na < 5 minut lub do momentu, gdy komórki całkowicie oderwą się od powierzchni kolby. Pipetuj w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki w celu dokładnego liczenia i tworzenia jednolitej wielkości agregatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li> Zneutralizuj trypsynę za pomocą 5-10 ml ESLIF; zmyj powierzchnię wzrostu, aby zmaksymalizować regenerację komórek i przenieś do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Wyjąć 1 ml porcji z probówki wirówkowej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li> Określić objętość zawiesiny wymaganą do podania 10 komórek/μl (cała 96-dołkowa płytka wymaga 5x104 komórek w 5 ml zawiesiny). Licz komórki dokładnie, ponieważ duże odchylenia od podanej liczby komórek mogą niekorzystnie wpłynąć na reakcję agregatów na bodźce.</li>
	<li> Dodać 5x104 komórki do 5 ml wstępnie podgrzanego PBS w świeżej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować w temperaturze ~170 x g przez 5 minut.</li>
	<li> Ostrożnie zassać PBS i delikatnie dodać 5 ml wstępnie podgrzanego PBS; nie naruszać osadu na dnie probówki. Wirować przy ~170 x g przez 5 min.</li>
	<li> Ostrożnie zassać PBS po raz drugi. Usuń jak najwięcej PBS bez naruszania osadu, ponieważ przeniesienie PBS może niekorzystnie wpłynąć na agregację. Zawiesić osad najpierw w 1 ml ciepłego N2B27 za pomocą pipety P1000 w celu wytworzenia jednorodnej zawiesiny komórek, a następnie dodać N2B27 do wymaganej objętości (np. dodać 4 ml dla zawiesiny 5x104 komórki/5 ml).</li>
	<li> Przenieść zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i odpipetować kroplę o objętości 40 μl na dno każdej studzienki 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery "U" bez hodowli tkankowej za pomocą pipety wielokanałowej. Przykryj 96-dołkową płytkę odpowiednią pokrywką i potwierdź obecność komórek za pomocą odwróconego mikroskopu laboratoryjnego (Rysunek 1B). 
	Uwaga: Istotne jest, aby te płytki były używane w celu ograniczenia możliwości przywierania komórek. Nie powlekaj dna płytki 96-dołkowej żelatyną, fibronektyną ani żadną inną powłoką, która wspomaga adhezję komórek.</li>
	<li> Inkubować komórki przez 48 godzin w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu agregacji.</li>
</ol>
3. Stosowanie bodźców i zmiana medium
<ol>
	<li> Po 48-godzinnym okresie inkubacji obserwuj pojawienie się mESC w każdym dołku 96-dołkowej płytki, aby potwierdzić pomyślną agregację (Rysunek 1E). Uwaga: Agregaty będą miały charakter kulisty i średnicę około 150-200 μm. W przypadku wystąpienia problemów zapoznaj się z sekcją dotyczącą rozwiązywania problemów (Tabela 1).</li>
	<li> Dodać 150 μl świeżej pożywki wtórnej (3 μM Chi99021 (Chi) w N2B2719; zapas przygotowany w 10 mM w DMSO) do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Odpipetować z wystarczającą siłą, aby usunąć wszelkie kruszywa, które mogły zacząć przylegać do dna studzienek. Inkubować agregaty w pożywce wtórnej przez 24 godziny w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (rysunek 1A). 
	Uwaga: Powtarzalne wydłużone i spolaryzowane agregaty są generowane przy użyciu tego ośrodka wtórnego. W zależności od wymaganych warunków doświadczalnych można również stosować inne składy podłoża wtórnego, czego przykłady przedstawiono na rysunku 3.</li>
	<li> Do kolejnych zmian pożywki należy użyć pipety wielokanałowej ustawionej pod kątem (około 30°), aby delikatnie usunąć 150 μl pożywki wtórnej z boku każdej studzienki. Następnie należy odpipetować 150 μl świeżego N2B27 do każdej studzienki z wystarczającą siłą, aby usunąć wszelkie kruszywa, które mogły zacząć przylegać do dna studzienek.</li>
	<li> Powtarzać punkt 3.3 co 24 godziny, aż do zakończenia cyklu czasowego (typowa długość eksperymentu z kulturą zagregowaną to 120 godzin). 
	Uwaga: Upewnij się, że agregaty poruszają się swobodnie po zmianach podłoża, aby zapewnić odtwarzalność i spójność wewnątrz i między każdą 96-dołkową płytką. Pożywka musi być zmieniana codziennie po okresie agregacji.</li>
</ol>
4. Przygotowanie agregatów do barwienia immunologicznego i analiza za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Utrwalenie i inkubacja przeciwciał pierwotnych 
	Uwaga: Protokół opisany przez A.K. Hadjantonakisa28 został zmodyfikowany tak, aby pasował do barwienia immunologicznego agregatów mESC. Aby zapoznać się z typowymi przeciwciałami stosowanymi w naszych badaniach i ich rozcieńczeniami, zapoznaj się z wcześniej opublikowaną pracą19,21,24,25,29 i Tabelą 3.
	<ol>
		<li>Użyj pipety wielokanałowej trzymanej pod kątem (około 30°), aby delikatnie usunąć 150 μl pożywki z boku każdej studzienki płytki 96-dołkowej. Przemyć dwukrotnie, pipetując 150 μl PBS do każdego dołka. Pozostaw kilka minut między każdym praniem, aby kruszywa mogły się osadzić.</li>
		<li>Ustaw pipetę P1000 na dozowanie 200 μl, załóż odpowiednią końcówkę pipety i odetnij około 3 mm od końca końcówki sterylnymi nożyczkami. Narysuj część PBS w każdym dołku 96-dołkowej płytki na krótką drogę do końcówki i wyrzuć ją, aby wymieszać kruszywo.</li>
		<li>Użyj tej samej końcówki, aby pobrać całą objętość w studzience, w tym kruszywo i pipetę, do małego (30 mm średnicy) szklanego dołka do rozwarstwiania Drosophila. Przenieś wszystkie agregaty z płytki 96-dołkowej, która zostanie poddana identycznym reżimom barwienia immunologicznego, do tej samej studzienki do wycinki szkła. 
		Uwaga: Podczas przenoszenia agregatów z różnych warunków doświadczalnych należy używać nowej końcówki do pipet, aby zapobiec przenoszeniu kruszyw.</li>
		<li>Umieść szklaną studzienkę, która zawiera kruszywa, na mikroskopie preparacyjnym. Zakręć szklaną studzienką, aby wepchnąć agregaty do środka i odessać PBS z jednej strony studzienki za pomocą szklanej pipety Pasteura. Użyj mikroskopu, aby upewnić się, że agregaty nie są zasysane. Pozostaw niewielką objętość PBS w szklanej studzience, aby przykryć kruszywa i zapobiec ich wysychaniu.</li>
		<li>Dodać 1 ml świeżo przygotowanego formaldehydu (4%) rozpuszczonego w PBS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na niską prędkość. Uwaga: Wiadomo, że paraformaldehyd jest alergizujący, rakotwórczy i toksyczny. Nosić odpowiednią ochronę podczas przenoszenia.</li>
		<li>Po utrwaleniu odessać roztwór formaldehydu w taki sam sposób, jak opisano w punkcie 4. 1. 4 i przemyć agregaty 1 ml PBS trzy razy, po 10 minut przy każdym myciu, na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na niską prędkość.</li>
		<li>Odessać PBS zgodnie z opisem w punkcie 4. 1. 4 i wykonaj kolejne trzy, 10-minutowe płukanie PBS zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej i 0,2% Triton X-100 (PBSFT). Wykonaj 10-minutowe mycie na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na niską prędkość. 
		Uwaga: Stosowanie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) powoduje uzyskanie przezroczystego buforu do płukania, zmniejszając liczbę agregatów, które w przeciwnym razie zostałyby utracone podczas protokołu, gdyby użyto mleka. Ważne jest, aby pamiętać, że po utrwaleniu, procedury immunohistochemiczne mogą być wykonywane na różne sposoby, inne niż te opisane poniżej, i powinny być określone i zoptymalizowane przez badacza.</li>
		<li>Zablokuj agregaty na 1 godzinę w temperaturze 4 °C w PBSFT na orbitalnym kołysku ustawionym na niską prędkość. W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a agregaty zablokowane O/N, przy ciągłym mieszaniu na poziomym wahaczu żyratorowym w temperaturze 4°C.</li>
		<li>Odessać PBSFT zgodnie z wcześniejszym opisem (patrz punkt 4. 1.4) i inkubować agregaty z 500 μl wymaganego przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBSFT O/N w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na niską prędkość. Przykryj folią parafinową, aby zapobiec parowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych
	<ol>
		<li>Odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć 1 ml PBSFT (w temperaturze 4 °C) w następujący sposób: dwa razy przez 5 minut, trzy razy przez 15 minut i cztery do siedmiu razy przez 1 godzinę. Wykonać każdy etap płukania w temperaturze 4 °C i na orbitalnym przełączniku kołyskowym ustawionym na niską prędkość. Uwaga: Przed użyciem schłodzić środek myjący. Nie wykonuj mycia na lodzie, ponieważ może to spowodować fragmentację kruszywa.</li>
		<li>Odessać końcową pożywkę płuczącą i inkubować agregaty z wymaganym przeciwciałem drugorzędowym w 500 μl PBSFT O/N w temperaturze 4 °C w ciemności w ciemności na poziomym wahaczu żyratorowym. W razie potrzeby dodaj plamę jądrową, taką jak Hoechst.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż i obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej
	<ol>
		<li>Umyć kruszywa zgodnie z opisem w rozdziale 4. 1. 4 z 4 °C PBSFT. Po ostatnim myciu przepłukać agregaty 1 ml PBS zawierającym 0,2% FBS i Triton X-100 (PBT) w następujący sposób: dwukrotnie przez 5 min; trzykrotnie przez 15 min. Wykonuj pranie w temperaturze pokojowej na orbitalnym wahaczu chronionym przed światłem.</li>
		<li>Odessać pożywkę w sposób opisany wcześniej (punkt 4. 1. 4) i inkubować przez 30 minut w ciemności z roztworem glicerolu:PBT w stosunku 1:1 (1 ml), a następnie drugą 30-minutową inkubację z roztworem glicerolu:PBT w proporcji 7:3 (1 ml). 
		Uwaga: Zmieszać roztwory glicerolu i PBT w temperaturze 4 °C za pomocą rotatora.</li>
		<li>Odessać końcowy roztwór glicerolu:PBT i zastąpić go 1 ml pożywki montażowej24. W tym momencie protokół może zostać wstrzymany przed montażem (w przypadku pauzy należy uszczelnić studzienki folią parafinową i przechowywać studzienki barwiące w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Zamontuj agregaty na szkiełkach mikroskopowych, pipetując je w kropelkach o objętości 17 μl za pomocą naciętej końcówki P20 (rysunek 2). Złóż taśmę dwustronną z powrotem z powrotem na siebie cztery razy, aby wygenerować przekładki i przymocować do każdego końca prowadnicy. Umieść górne szkiełko nakrywkowe (22 mm x 60 mm) na tych podkładkach dystansowych (Rysunek 2). 
		Uwaga: na tym etapie konieczne jest użycie końcówki do cięcia, aby nie uszkodzić próbek. Przekładki zapobiegają zgniataniu kruszywa przez szkiełko nakrywkowe.</li>
		<li>Po zamontowaniu agregatów zobrazuj próbki za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu wcześniej opisanychprotokołów 19,21,24,25. Po umieszczeniu na mikroskopie pozostaw szkiełko w spokoju na stoliku na kilka minut, aby agregaty mogły osiąść w podłożu montażowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+mouse+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).</li>
<li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation%3A+making+and+shaping+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).</li>
<li>Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTam%2C+PPL+%22Gastrulation%3A+From+Cells+to+Embryo%22">Gastrulation: From Cells to Embryo</a>. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 233-262 (2004).</li>
<li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).</li>
<li>ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li>
<li>Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2C+Activin%2C+and+BMP+Signaling+Regulate+Distinct+Stages+in+the+Developmental+Pathway+from+Embryonic+Stem+Cells+to+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).</li>
<li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX17+Is+a+Critical+Specifier+of+Human+Primordial+Germ+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate.</a> Cell. 160, 1-16 (2015).</li>
<li>Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+developmental+marker+genes+to+define+temporal+and+spatial+patterns+of+differentiation+during+embryoid+body+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation.</a> J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).</li>
<li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Koehler, K. R., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mouse+embryonic+stem+cell+culture+for+generating+inner+ear+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids.</a> Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).</li>
<li>Lancaster, M. A., Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregated+P19+mouse+embryonal+carcinoma+cells+as+a+simple+in+vitro+model+to+study+the+molecular+regulations+of+mesoderm+formation+and+axial+elongation+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis.</a> Genesis. 47 (2), New York, N.Y. 93-106 (2000).</li>
<li>Keller, R., Danilchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+expression%2C+pattern+and+timing+of+convergence+and+extension+during+gastrulation+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis.</a> Development. 103 (1), 193-209 (1988).</li>
<li>Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blastocoelic+fluid+of+sea+urchin+embryo+induces+exogastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation.</a> J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).</li>
<li>Horstadius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanisms+of+Sea+Urchin+Development%2C+Studied+by+Operative+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Bio.+Rev%22%5BJournal%5D)">The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods.</a> Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).</li>
<li>Holtfreter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+totale+Exogastrulation%2C+eine+Selbstabl%C3%B6sung+des+Ektoderms+vom+Entomesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27Archiv+f%C3%BCr+Entwicklungsmechanik+der+Organismen%22%5BJournal%5D)">Die totale Exogastrulation, eine Selbstablösung des Ektoderms vom Entomesoderm.</a> Wilhelm Roux'Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).</li>
<li>van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+breaking%2C+germ+layer+specification+and+axial+organization+in+aggregates+of+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li>
<li>Eiraku, M., Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li>
<li>Turner, D. A., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+and+FGF+signaling+direct+the+specification+and+elongation+of+a+neural+axial+progenitor+in+ensembles+of+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li>
<li>Faunes, F., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+membrane-associated+%CE%B2-catenin%2FOct4+complex+correlates+with+ground-state+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A membrane-associated β-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).</li>
<li>Kalmar, T., Lim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+Fluctuations+in+Nanog+Expression+Mediate+Cell+Fate+Decisions+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells.</a> PLoS Biol. 7 (7), e1000149(2009).</li>
<li>Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Rué, P., Martinez Arias,, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interplay+between+extracellular+signalling+and+the+dynamics+of+the+exit+from+pluripotency+drives+cell+fate+decisions+in+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells.</a> Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).</li>
<li>Turner, D. A., Rué, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias,, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brachyury+cooperates+with+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+signalling+to+elicit+Primitive+Streak+like+behaviour+in+differentiating+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Brachyury cooperates with Wnt/β-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells.</a> BMC Biol. 12 (1), 63(2014).</li>
<li>Ying, Q. -L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Ying, Q. -L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).</li>
<li>Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRivera-Perez%2C+JA+%22Molecular+Embryology+of+the+Mouse%22">Molecular Embryology of the Mouse</a>. , CSHL. 1-90 (2011).</li>
<li>Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias,, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Aggregates+of+Mouse+ES+Cells+that+Show+Symmetry+Breaking%2C+Polarisation+and+Emergent+Collective+Behaviour+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro.</a> bioRxiv. , (2014).</li>
<li>Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mesoderm+induction+and+its+specification+to+the+hemangioblast+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).</li>
<li>Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Glycogen+Synthase+Kinase+3+Inhibitors+Potentiate+Insulin+Activation+of+Glucose+Transport+and+Utilization+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).</li>
<li>Inman, G. J., Nicolás, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-beta+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+%28ALK%29+receptors+ALK4%2C+ALK5%2C+and+ALK7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 3 (8), e2904(2008).</li>
<li>Neely, M. D., Litt, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMH1%2C+a+highly+selective+small+molecule+BMP+inhibitor+promotes+neurogenesis+of+hiPSCs%3A+comparison+of+PAX6+and+SOX1+expression+during+neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction.</a> ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12+Sox17+promotes+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+by+directly+regulating+extraembryonic+gene+expression+and+indirectly+antagonizing+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal.</a> Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).</li>
<li>Chambers, I., Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li>
<li>Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+imaging+and+differential+localization+of+lipid-modified+GFP-variant+fusions+in+embryonic+stem+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice.</a> Genesis. 44 (4), New York, N.Y. 202-218 (2006).</li>
<li>Serup, P., Gustavsen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+promoter+substitutions+generating+transcriptional+sentinels+of+diverse+signaling+pathways+in+embryonic+stem+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Models+Mech%22%5BJournal%5D)">Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice.</a> Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).</li>
<li>Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPRT-deficient+%28Lesch-Nyhan%29+mouse+embryos+derived+from+germline+colonization+by+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells.</a> Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).</li>
<li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Human+Fertilisation+and+Embryology+ACT+2008+-+Elizabeth+II%22">Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II</a>. , The Stationery Office. (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Technika opisana w tym manuskrypcie wydajnie i powtarzalnie generuje agregaty embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC), które wykazują zorganizowane łamanie symetrii i wydłużenie19, łącząc zarówno hodowlę wiszącej kropli opisaną przez Marikawę i wsp.14 i formacja EB. Agregaty te rozwijają wydłużenia osiowe, uzupełniając istniejące metody generowania narządów przednich z komórek ES, takich jak miseczki wzrokowe11 i kora mózgowa13, i zawierają komórki o tożsamości trzech listków zarodkowych, które wykazują procesy podobne do tych podczas gastrulacji, takie jak szybki ruch komórek19,21.
Interesujące jest spekulowanie na temat natury zdarzenia łamiącego symetrię, ponieważ występuje ono przy braku zewnętrznych tkanek wzorcowych i wskazówek asymetrii jarzmowej19. Spontaniczne tworzenie się szczątkowej osi może wynikać z istniejących wcześniej heterogeniczności w początkowej hodowli komórek, które stanowią podstawę rozwoju asymetrii. Rzeczywiście, populacje komórek hodowanych w warunkach ESLIF wykazują mieszaninę komórek samoodnawiających się i różnicujących, których względne proporcje mogą się różnić w zależności od agregatu. Co więcej, wstępne prace w naszym laboratorium sugerują, że agregaty z całkowicie pluripotencjalnej populacji komórek wykazują opóźniony rozwój i defekty w wzorcowaniu, co sugeruje rolę heterogeniczności w zorganizowanym tworzeniu wzorca (D.A. Turner i A. Martinez Arias, w przygotowaniu). Warto również wziąć pod uwagę, że mechanizm reakcji-dyfuzji może generować wzór, z dyfuzją inhibitora z dala od powierzchni agregatu. Warmflash i wsp.41 sugerują, że taki mechanizm może być odpowiedzialny za rozwój asymetrii radialnej w kulturze przylegającej, co czyni go możliwym kandydatem do wzorcowania w trzech wymiarach.
Podczas początkowego 48-godzinnego okresu agregacji komórki osiągają stan podobny do tego w epiblastach po implantacji, w którym są zdolne do reagowania na sygnały z pożywki wtórnej19,21,24. Zazwyczaj opisany tutaj protokół zapewnia komórkom impuls pożywki wtórnej, która zawiera czynniki (takie jak agoniści Wnt / β-kateniny), które dostarczają sygnały wystarczające do wydłużenia. Poprzednie metody hodowli opisane przez Lancastera i wsp. (przy użyciu ludzkich EKM13) oraz Eiraku i wsp. (z mESC11) wykorzystali krótki okres agregacji w 96-dołkowych płytkach o niskiej adhezji, zanim zagregowane komórki przeniesiono do kropelek Matrigel w celu kontynuowania hodowli. Chociaż czas między agregacją a insercją Matrigelu był różny w poszczególnych badaniach, w obu przypadkach do tworzenia agregatów wykorzystano dużą liczbę komórek (około 3000-4500 komórek). W przeciwieństwie do tego, opisany tutaj protokół19 wykorzystuje znacznie mniej komórek (około 400 komórek na agregat), co zostało określone jako absolutnie niezbędne w procesie wydłużania, łamania symetrii i polaryzacji, która jest obserwowana19. Ponadto, te wydłużone struktury są w stanie zostać wygenerowane w znacznie krótszym czasie bez osadzania w sztucznych matrycach: porównaj generowanie zdefiniowanych regionów mózgu przez Lancastera i wsp. (>20-30 dni)13 oraz miseczki wzrokowe przez Eiraku i wsp. (~11 dni)11 z 5 dniami wymaganymi do wytworzenia spolaryzowanych wydłużonych struktur.
Jednym z ograniczeń opisanej tutaj metody hodowli jest jednak to, że można je hodować tylko przez około 5-6 dni po posiewaniu, aż ich rozmiar sprawi, że pod wpływem grawitacji będą w stanie opaść na dno studzienek i wymusić przyczepność nawet na niepowlekanych wyrobach z tworzyw sztucznych. Dalsze eksperymenty z wykorzystaniem sztucznych matryc, takich jak te wspomniane wcześniej, mogą pozwolić na wydłużenie okresu obserwacji i eksperymentów, a obecnie trwają prace nad określeniem skutków takiego ograniczania agregatów. Kolejnym ograniczeniem tej techniki jest to, że aby zmienić podłoże bez usuwania kruszyw, na dnie studni należy pozostawić niewielką objętość podłoża. Konsekwencjami dla podejść genetyki chemicznej jest konieczność uwzględnienia tego rozcieńczenia i wszelkich skutków resztkowych poprzednich pożywek: w dniu impulsu Chi 3 μM faktycznie dostarczany jest roztwór 2,37 μM, a kolejne zmiany pożywki skutkują przeniesieniem 0,499 μM (72-96 godzin) i 0,105 μM (96-120 godzin) między punktami czasowymi. Obecne prace nie zostały skorygowane o rozcieńczenie i zakłada się, że dzienne zmiany pożywki zminimalizują efekty resztkowe.
W protokole znajduje się szereg krytycznych etapów mających na celu zapewnienie odtwarzalności zarówno wewnątrz-, jak i międzyeksperymentalnej. Po pierwsze, początkowa hodowla mESC musi być dobrze utrzymana i nie może nadmiernie zlewać się, a pożywka powinna być zawsze dobrej jakości, tj. świeża i dobrze wymieszana (ryc. 5A,B). Złe warunki hodowli niekorzystnie wpływają na agregację (ryc. 5Bi). Dokładne zliczanie komórek w celu uzyskania zawiesiny komórek ~400 komórek/40 μl komórek jest niezbędne, ponieważ większe agregaty nie organizują się samoorganizując i są bardziej skłonne do tworzenia podwójnych agregatów w każdym dołku (Rysunek 5Bii), podczas gdy mniejsze agregaty nie są w stanie osiągnąć prawidłowej gęstości, w której są w stanie zareagować na bodziec (Rysunek 5Biii). Kluczowym etapem optymalizacji było włączenie drugiego płukania PBS, które usuwa surowicę zanieczyszczeń z zawiesiny komórkowej (krok 2.6); Poprawiło to częstotliwość agregacji i przyspieszyło rozwój agregatów o około 24 godziny. Następnie, upewniając się, że zmiany podłoża są stosowane z wystarczającą siłą, aby usunąć wszelkie kruszywa, które mogą przylegać do powierzchni studni; niezastosowanie się do tego powoduje "awarię" agregatów (rysunek 5Biv). Ponadto, jak wspomniano wcześniej (i poniżej), konieczne jest zapewnienie, że kruszywa są utrzymywane w kulturze zawiesinowej i nie mogą przylegać do żadnej powierzchni. Gdy agregaty przylegają, wzorzec ekspresji genów i ich potencjał wydłużania zostają zakłócone.
Ponieważ technika ta jest stosunkowo prosta i leży w kompetencjach osób z dobrymi technikami hodowli tkankowej, większość problemów związanych z agregacją można rozwiązać stosunkowo szybko, jeśli zostaną wykonane te krytyczne kroki; dostępna jest pełna tabela rozwiązywania problemów (Tabela 1). Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do badania rozwoju osiowego, łamania symetrii i zdarzeń związanych z decyzją komórkową. Mówiąc dokładniej, agregaty te mają potencjał do generowania pul komórek, które do tej pory były niedostępne w hodowli, takich jak rdzeń kręgowy i neurony ruchowe.
Uwaga etyczna: Należy zauważyć z należytą ostrożnością, że przełożenie tego protokołu na ludzką hodowlę komórek ES lub iPS może zbliżyć eksperymentatora do podstawy prawnej czternastodniowego limitu badań na ludzkich embrionach, a mianowicie do wytworzenia prymitywnej smugi, jak wyszczególniono w Ustawie o zapłodnieniu i embriologii człowieka z 2008 r. (Wielka Brytania)42. Ponieważ ustawa obejmuje wszystkie żywe embriony ludzkie, niezależnie od sposobu ich powstania, hodowla gastruloidów ludzkich poza stadium prymitywnej smugi byłaby poza zakresem badań podlegających licencjonowaniu.

Badanie i zrozumienie decyzji dotyczących losu komórek we wczesnym rozwoju ssaków może korzystać z kultur embrionalnych komórek macierzystych (ESC), populacji klonalnych pochodzących z blastocyst, które mają zdolność do samoodnawiania się i różnicowania we wszystkie typy komórek organizmu, tj. są pluripotencjalne1,2. Chociaż kultury te były i nadal są przydatne do zrozumienia molekularnych podstaw decyzji dotyczących losu komórek, nie są one w stanie odtworzyć niektórych układów przestrzennych i globalnych zachowań, które są generowane w zarodkach podczas gastrulacji. W zarodku proces gastrulacji przekształca pojedynczą warstwę nabłonka w trzy odrębne listki zarodkowe i nadaje zarodkowi jawną organizację przednio-tylną3-5. Próby podsumowania tych zdarzeń ex vivo opierały się na generowaniu trójwymiarowych agregatów ESC, określanych jako ciała embrionoidalne (EBs) i poddawaniu ich warunkom różnicowania6,7. Agregaty te można nakłonić do różnicowania się w wiele różnych typów komórek, z których niektóre są albo niemożliwe do uzyskania, albo indukowane z niską wydajnością w przylegającej hodowli, albo w ogóle nie mogą być wyprodukowane; np. krew8 i pierwotne komórki rozrodcze9. Ograniczeniem w stosowaniu EB jest jednak to, że nie są one w stanie wykazać zachowania morfogenetycznego, rozmieszczenia listków rozrodczych lub organizacji osiowej, które są głównymi cechami rozwijającego się zarodka, co skutkuje dezorganizacją przestrzenną6,10. W jednym z doniesień leczenie EB za pomocą Wnt prowadzi do słabej polaryzacji ekspresji genów w niektórych agregatach, ale nie obserwuje się wyraźnej morfogenezy7. W nowszych doniesieniach EB, które były hodowane przez dłuższy czas, rozwijają przednie struktury, takie jak siatkówka, kora i komórki czuciowe ucha wewnętrznego, które naśladują swoje embrionalne odpowiedniki, ale rozwijają się bez kontekstu organizacji osiowej11-13.
Raport Marikawy i wsp.14, podczas pracy z agregatami mysich komórek raka zarodka P19 (EC) utworzonych metodą wiszącej kropli, zgłosiło pojawienie się wydłużonych struktur pochodzenia mezodermalnego, przypominających wydłużenia, które obserwuje się u egzogastrulae w zarodkach i jeżowców oraz eksplantatów Kellera15-18. Ponieważ nie zaobserwowano tego w przypadku mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC), podjęliśmy próbę odtworzenia zachowania zaobserwowanego w komórkach EC P19 przy użyciu agregatów mESC19 i opisujemy warunki hodowli, które prowadzą do łamania ich symetrii i wydłużenia osiowego. Istotną różnicą w stosunku do pracy z komórkami P19 jest to, że opisany tutaj protokół agregacji jest wykonywany na 96-dołkowej płytce, podobnie jak ten opisany przez Eiraku i wsp. 20, zamiast wiszących kropli. Zmiana ta doprowadziła do zwiększenia wydajności pod względem odzysku agregatów oraz odtwarzalności zarówno wewnątrz-, jak i międzydoświadczalnej. Co ważne, utrzymywanie kruszyw w poszczególnych odwiertach zapewnia, że nie dochodzi do fuzji między kruszywami (powszechnej w przypadku gromadzenia kruszyw z wiszących kropli). Ponadto kluczową cechą protokołu jest 24-godzinna ekspozycja na inhibitor GSK3 CHI99021 (Chi), silny aktywator sygnalizacji Wnt/β-kateniny, po agregacji.
Opisana tutaj metoda stanowi podstawę do zrozumienia procesów samoorganizacji, organizacji osiowej i specyfikacji listka zarodkowego w hodowli, pozwalając na wnioskowanie o rozwoju osiowym in vivo19,21. Z tych powodów metoda ta może potencjalnie umożliwić szczegółową analizę mechanistyczną procesów, które mogą być trudne do zbadania w zarodku. Ponadto potencjalne zastosowanie polega na wytwarzaniu tkanek i narządów, które nie są łatwo dostępne w hodowli adherentnej ze względu na brak ustrukturyzowanej niszy komórkowej, takiej jak prekursory rdzenia kręgowego21 i neurony ruchowe. Trójwymiarowa hodowla zagregowana oferuje fizyczną strukturę i środowisko sygnalizacyjne, które mogą być nieosiągalne konwencjonalnymi środkami, co prowadzi do nowego podejścia do wyprowadzania linii embrionalnych w sposób zorganizowany przestrzennie.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Kolba do hodowli komórkowych</td><td>Grenier Bio-one</td><td>690 175</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td></td><td>MSE MSB020. CX1.5</td><td></td></tr><tr><td>BES Buforowana sól fizjologiczna (BBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2891</td><td>BBS+CaCl2 wytwarzany przez rozpuszczenie 50 mM soli sodowej BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4 w wodzie destylowanej z 1 mM CaCl2 dostosowany do pH 6,96 za pomocą 1 M HCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (15 lub 50 ml)</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td>118271 lub 227261</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021 (Chi)</td><td>CSCR</td><td></td><td>Zakupiony za pośrednictwem Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stężenie zapasów: 10 mM w</td></tr><tr><td>studzience rozwarstwiającej DMSO (średnica wewnętrzna 30 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12678586</td><td></td></tr><tr><td>ESLIF</td><td></td><td></td><td>500 ml GMEM, 5 ml pirogronianu sodu, 5 ml aminokwasów endogennych, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-merkaptoetanolu, 50 ml FBS i 550 &mikro; l LIF (1 000 jednostek).</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Biosurowica</td><td>FB-1090/500</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Rozpuszczona w wodzie destylowanej do 1% (w/v) roztworu, autoklawizowana i rozcieńczana do 0,1% w PBS (patrz poniżej) do indywidualnego użytku.</td></tr><tr><td>Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM)</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Ulepszony hemocytometr Neubauera</td><td>Hawksley</td><td>AS1000</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę (LIF), rekombinowany</td><td>CSCR</td><td></td><td>Wyprodukowano we własnym zakresie przez Wellcome Trust-Medical Research Council, Cambridge Stem Cell Institute.</td></tr><tr><td>n-galusan propylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02370</td><td></td></tr><tr><td>N2B27/NDiff 227</td><td>Stemcells, Inc.</td><td>SCS-SF-NB-02</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff">http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff</a></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Proszek paraformaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Rozpuszczony w wodzie w celu utworzenia 8% roztworu podstawowego formaldehydu. Rozcieńczony BBS+CaCl2 w celu uzyskania 4% roztworu roboczego</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td> z pirogronianem <td>sodu wapnia i magnezu</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny zbiornik</td><td>STARLAB</td><td>E2310-1010</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny, nietkankowy, 96-dołkowy Grenier z dnem w kształcie litery U</td><td> Bio-one</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują łamanie symetrii, polaryzację i emergentne zachowania zbiorowe in vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Opracowaliśmy protokół ulepszający obecną hodowlę ciała embrionalnego (EB), który umożliwia badanie samoorganizacji, łamania symetrii, wydłużenia osiowego i specyfikacji losu komórki przy użyciu agregatów mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) w hodowli zawiesinowej. Niewielka liczba mESC jest agregowana w pożywce podstawowej przez 48 godzin na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U, które nie są poddawane hodowli tkankowej, po czym są one zdolne do reagowania na sygnały eksperymentalne. Po leczeniu agregaty te zaczynają wykazywać oznaki spolaryzowanej ekspresji genów i stopniowo zmieniają swoją morfologię z kulistej masy komórek na wydłużoną, dobrze zorganizowaną strukturę przy braku zewnętrznych wskazówek asymetrii. Struktury te są nie tylko w stanie wyświetlać markery trzech listków zarodkowych, ale także aktywnie wykazywać ruchy przypominające gastrulację, o czym świadczy kierunkowe przemieszczanie się poszczególnych komórek od agregatu, co ma kluczowe znaczenie w jednym obszarze wydłużonej struktury. Protokół ten zapewnia szczegółową metodę odtwarzalnego tworzenia tych agregatów, ich stymulacji sygnałami, takimi jak aktywacja Wnt/β-kateniny i hamowanie BMP, oraz ich analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pojedynczym punktem czasowym lub poklatkowym. Ponadto opisujemy modyfikacje obecnych procedur barwienia zarodków myszy w całości do analizy immunocytochemicznej specyficznych markerów w stałych agregatach. Zmiany w morfologii, ekspresji genów i długości agregatów można mierzyć ilościowo, dostarczając informacji o tym, w jaki sposób sygnały mogą zmieniać losy osiowe. Przewiduje się, że system ten może być stosowany zarówno do badania wczesnych zdarzeń rozwojowych, takich jak rozwój osiowy i organizacja, jak i szerzej, procesów samoorganizacji i komórkowego podejmowania decyzji. Może również stanowić odpowiednią niszę do generowania typów komórek obecnych w zarodku, które są nieosiągalne z konwencjonalnej hodowli adherentnej, takiej jak rdzeń kręgowy i neurony ruchowe.

Wygląd komórek bezpośrednio po wysianiu oraz po agregacji
Bezpośrednio po wysianiu w każdym dołku płytki 96-dołkowej można zaobserwować obecność pojedynczych komórek przy użyciu standardowego odwróconego mikroskopu do hodowli tkankowych (Rycina 1B). W ciągu 8 h od wysiania komórki te zaczną opadać na dno dołka pod wpływem grawitacji i zaczną łączyć się w oddzielne skupiska (Rycina 1C). Po 24 h łączące się komórki zakończą pierwotną agregację i zagęszczą się w dobrze zdefiniowane, choć nieregularne agregaty, w których poszczególne komórki są od siebie nieodróżnialne (Rycina 1D). Pod koniec drugiego dnia (48 h) agregaty powinny wyglądać „czysto”, wchłaniając wszystkie komórki znajdujące się w dołku (Rycina 1E); na dnie dołka mogą znajdować się niektóre komórki, które oddzieliły się od agregatu na tym etapie. Jeśli agregacja odbywała się w medium N2B27, w tym punkcie czasowym agregaty powinny być sferyczne, mieć średnicę około 150-200 µm i swobodnie poruszać się w obrębie dołka (t.j. nie przylegać do dna dołków). Agregacja w innych mediach (t.j. ESLIF lub N2B27 z konkretnymi czynnikami) może zmienić zarówno początkową morfologię agregatu, jak i odpowiedź na późniejsze bodźce (Turner et al., w przygotowaniu).
Reprezentatywne zmiany morfologiczne
Dodanie 24-godzinnego impulsu pożywki wtórnej zawierającej Chi pomiędzy 48. a 72. godziną (Rysunek 1A, 5A) generuje dobrze zdefiniowane, wydłużone agregaty, które wykazują polaryzację ekspresji specyficznych markerów warstw zarodkowych19,21. Bezpośrednio po impulsie Chi (72 h), agregaty zaczną odrzucać komórki i zaczną wykazywać odpowiedź na te sygnały pod koniec tego dnia (Rysunek 3A). Odpowiedzi te objawiają się zmianami w ekspresji genów i morfologii, z których obie zależą od obróbki, jaką poddano agregaty po początkowym 48-godzinnym okresie agregacji w N2B27 (Rysunek 3B). Jeśli wymagana jest jedynie analiza końcowa, optymalnym czasem obrazowania agregatów jest około 96-120 h. W tym punkcie agregaty wykształcą wyraźną morfologię i wzorce ekspresji genów (Rysunek 3A), a ich rozmiar i masa będą wciąż na tyle niskie, że wypchnięcie pożywki pipetą P200 będzie wystarczające do odłączenia wszelkich agregatów, które mogły przywrzeć. Brak zapobiegania przywieraniu agregatu do studzienki negatywnie wpłynie na proces formowania agregatów (Rysunek 5Biv). Morfologia i wzorzec ekspresji genów w agregatach mogą ulec zmianie w zależności od zastosowanej obróbki. Reprezentatywne wyniki dla reżimów ciągłych lub impulsowych, z pojedynczą obróbką lub kombinacją czynników, przedstawiono dla BMP4, Dorsomorphin H1 (inhibitor receptora BMP), ActivinA, SB43 (inhibitor Activin/Nodal), bFGF lub PD03 (inhibitor MEK) (Rysunek 3B).
Obrazowanie agregatów i ilościowa analiza obrazu
Agregaty nadają się do obrazowania za pomocą mikroskopii szerokopolowej (przede wszystkim w celu obrazowania time-lapse19) lub po utrwaleniu i immunostynowaniu do obrazowania konfokalnego19,21 (Rysunek 2). Przedstawiony powyżej protokół oraz opis obrazowania pozwalają na uzyskanie informacji ilościowych dotyczących tych agregatów. Po zarejestrowaniu obrazów konfokalnych lub szerokopolowych można zmierzyć długość oraz odpowiadającą jej ekspresję genów wzdłuż średnicy lub osi agregatu (odpowiednio dla kształtu sferycznego lub wydłużonego; Rysunek 4A, B). Analizy te można bezpośrednio zastosować również do obrazów time-lapse, co pozwala uzyskać informacje o szybkości wzrostu, wielkości i wydłużaniu się agregatów w różnych warunkach (Rysunek 4).
<img alt="Fazy proliferacji komórek; mikroskopia time-lapse; porównanie pożywek N2B27; wzrost od 5 min do 48 h." src="/files/ftp_upload/53252/53252fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1. Typowy przebieg czasowy i wczesna morfologia. (A) Typowy przebieg czasowy dla eksperymentów agregacji. Komórki są agregowane przez 48 hr w pożywce N2B27 zawierającej zawiesinę komórek ES myszy (10 cells/µl) w płytce 96-dołkowej (p1, p2). (B) Bezpośrednio po wysiewaniu (t = ~5min) w zawiesinie widoczne są pojedyncze komórki, które do 8 h (C) zaczynają tworzyć skupiska. (D) Po 24 hr komórki utworzyły w każdym dołku pojedynczy agregat o średnicy około 100 µm. (E) Po 48 hr agregacji średnica agregatu wynosi od 150-200 µm. W tym momencie pożywka do agregacji (N2B27) zostaje usunięta i dodawana jest pożywka wtórna, która pozostaje przez resztę eksperymentu (p1 w części A) lub przez 24 hr, po czym zostaje ponownie zmieniona na N2B27 (p2 w części A). Pasek skali oznacza 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mocowania agregatów komórkowych na szkiełkach, przedstawiający dystanse i szkiełko nakrywkę w konfiguracji mikroskopowej." src="/files/ftp_upload/53252/53252fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Mocowanie agregatów na szkiełkach przedmiotowych. Po utrwaleniu, immunobarwieniu i umieszczeniu agregatów w medium montażowym, każdy agregat jest przenoszony pipetą na szkiełko przedmiotowe w formie kropli o objętości 17 µl (A, B, B’). Między kroplami z agregatami pozostawia się wystarczającą przestrzeń, aby zapobiec ich łączeniu. Dystanse wykonuje się z taśmy dwustronnej i umieszcza w każdym rogu szkiełka przedmiotowego (A, A’, B). Na nich następnie kładzie się szklaną nakrywkę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozwój komórek przy ekspozycji pulsacyjnej w porównaniu do ciągłej; obrazy mikroskopowe; analiza różnicowania." src="/files/ftp_upload/53252/53252fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wpływ różnych metod traktowania na morfologię agregatów komórek ES. Po 2 dniach w pożywce N2B27 komórki ES utworzyły agregaty. Dodanie specyficznych czynników w formie jednodniowego impulsu (A) lub w sposób ciągły (B) może zmienić fenotyp agregatów pod względem polarności ekspresji genów, potencjału do elongacji lub ich ogólnego kształtu. Przykłady na tej rycinie to agregaty utworzone z mysich komórek ES Bra::GFP30 (A) lub Sox1::GFP27 (B), obrazowane po 120 hr i traktowane zgodnie z oznaczeniem. Chi: CHIR 9902131; SB43: SB 43154232; DM: DorsomorphinH133,34; PD03: PD0325901. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza fluorescencyjna wzrostu drobnoustrojów; wykresy fluorescencji, długości i okrągłości w funkcji czasu." src="/files/ftp_upload/53252/53252fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Analiza ilościowa agregatów. Typowy agregat utworzony z mESC Bra::GFP25,30 po 24-godzinnym impulsie Chi i obrazowany w 120. godzinie. Przedstawiono nałożony obraz z kanału światła przechodzącego i GFP z zaznaczoną przerywaną linią wskazującą „kręgosłup” agregatu od punktu A do B (A), wzdłuż którego można zmierzyć fluorescencję i długość agregatu (B). Przedstawiono długość (C) oraz „okrągłość” (D) 24 agregatów z tego samego eksperymentu. Deskryptory kształtu, takie jak okrągłość (D), kolistość, obwód i powierzchnia, mogą być mierzone przy użyciu wtyczki Image Analysis Cookbook w oprogramowaniu do analizy obrazów FIJI35. Średnią zaznaczono poziomą linią w każdym punkcie czasowym; słupki błędów wskazują odchylenie standardowe; pasek skali w (A) wskazuje 200 µm. Ze względu na subtelne różnice między liniami komórkowymi reporterowymi oczekuje się, że po impulsie Chi średnia maksymalna długość i średnia minimalna okrągłość agregatów będą się różnić. W różnych liniach komórkowych stwierdzono, że średnia maksymalna długość może mieścić się w zakresie ~400-800 µm, a średnia minimalna okrągłość między 0,4 a 0,6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Cell aggregate formation diagram; typical vs. variations in quality, cell count; microscopy images." src="/files/ftp_upload/53252/53252fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Rycina 5. Przykłady niepowodzeń w tworzeniu agregatów. Zdolność do generowania powtarzalnych agregatów (A) zależy od czynników krytycznych, takich jak (Bi) świeże i dobrze wymieszane medium wtórne, (Bii, Biii) dokładność w odliczaniu początkowej liczby komórek oraz (Biv) zapewnienie, aby agregaty nie tworzyły kolonii adherentnych tj.., „uderzają” o dno dołka. Przedstawiono typowe przykłady błędów w formowaniu agregatów dla każdego z wymienionych warunków (B). Skala zaznaczona na zdjęciu; szczegóły znajdują się w tabeli rozwiązywania problemów (Tabela 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela rozwiązywania problemów w hodowli komórkowej; problemy, przyczyny, rozwiązania; analiza tworzenia agregatów." src="/files/ftp_upload/53252/53252table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Przewodnik rozwiązywania problemów. Przedstawiono typowe błędy związane z protokołem agregacji wraz z sugestiami dotyczącymi ich rozwiązania.
<img alt="Tabela materiałów z tagami GFP, mCherry, Cerulean, cytowanymi badaniami, bez numerów katalogowych, wpisy n/a." src="/files/ftp_upload/53252/53252table2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2. Tabela linii komórkowych testowanych pod kątem tworzenia agregatów. Liczne linie komórkowe19,22,27,30,36-40 zostały scharakteryzowane pod kątem tworzenia agregatów i, choć spodziewano się i zaobserwowano subtelne różnice między liniami, wszystkie powyższe linie wykazują podobną dynamikę w zakresie elongacji i morfologii. Jeśli chodzi o ekspresję genów, wzorzec ekspresji jest specyficzny dla ekspresowanego genu, ale w obrębie każdej linii komórkowej wzorzec ten pozostaje zazwyczaj spójny przez określoną liczbę pasażowań. Dla zapewnienia powtarzalności generujemy agregaty z komórek, które nie przekroczyły 15 pasażowań w kulturze.
<img alt="Tabela z odczynnikami przeciwciałami, zawierająca firmy, numery katalogowe i stopnie rozcieńczenia dla eksperymentów laboratoryjnych." src="/files/ftp_upload/53252/53252table3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 3"> 
Tabela 3. Lista reprezentatywnych przeciwciał użytych w tych badaniach. Wybrane przeciwciała oraz zastosowane stopnie rozcieńczenia dla immunobarwienia agregatów.

Opracowaliśmy protokół do generowania agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują samoorganizację, łamanie symetrii i wydłużanie równolegle do rozwoju osiowego. Technika ta pozwala na badanie osiowych procesów rozwojowych i generowanie typów komórek, które w innym przypadku są trudne do wykonania w hodowli jednowarstwowej.

Generowanie agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują łamanie symetrii, polaryzację i emergentne zachowania zbiorowe in vitro

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wytworzenie jednorodnych agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które podlegają samoorganizacji i elongacji osiowej w hodowli zawiesinowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii rozwoju, takie jak rola oddziaływań tkankowych w specyfikacji osi oraz samoorganizacja w procesach takich jak gastrulacja. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie zdarzeń rozwojowych z nowej, dekonstrukcyjnej perspektywy poza embrionem przed etapem agregacji.Komórki embrionalne myszy lub M MECs hoduj w medium ES.Lift w naczyniach hodowlanych o powierzchni 25 cm², pokrytych żelatyną, w celu generowania agregatów. Rozpocznij od naczynia hodowlanego z komórkami przy konfluencji od 40 do 60%; odessaj medium i dwa razy przepłucz naczynie PBS. Dodaj 1 mL 0,25% trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez około pięć minut, aby odkleić komórki od ścianek naczynia.Następnie do zawiesiny ododerwanych komórek należy dodać pięć mililitrów medium Es.Lift i dokładnie wymieszać. Komórki należy przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów i pobrać aliquot o objętości jeden mililitr w celu policzenia komórek. Następnie pięć razy 10⁴ komórek należy dodać do pięciu mililitrów ciepłego PBS i wirować z prędkością 170 ×g przez pięć minut.Odssać roztwór, uważając, aby nie naruszyć osadu. Następnie delikatnie dodać 5 ml PBS i powtórzyć wirowanie. Odssać maksymalną objętość cieczy, nie naruszając osadu komórkowego.Aby zapobiec przeniesieniu PBS, resuspenduj osad komórkowy w 1 ml ogrzanego medium N2B27. Wymieszaj dokładnie za pomocą pipety P1000, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.Następnie rozcieńczyć zawiesinę dodatkowymi czterema mililitrami pożywki N2B27. Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnego zbiornika za pomocą pipety wielokanałowej. Dokładnie wymieszać komórki i przenieść 40 µL zawiesiny komórkowej ze zbiornika do każdego dołka w płytce u-bottom nieprzeznaczonej do hodowli tkankowej.Płytka 96-dołkowa. Specjalnie zastosowano płytkę niezgodną z hodowlą tkanek, aby zminimalizować przyleganie komórek do powierzchni. Inkubuj płytkę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C przy 5% CO2 przez 48 godzin, aby umożliwić agregację komórek po upływie 48 godzin.Wyjmij płytkę z inkubatora, zaobserwuj komórki pod mikroskopem odwróconym i potwierdź obecność agregatów. Dodaj objętość 10 milimolarnego roztworu zapasu CHI 9 9 0 2 1 do ogrzanego N two B 27, aby uzyskać stężenie końcowe 3 mikromolarne. Jest to wtórne medium do stymulacji komórek.Używając pipety wielokanałowej, nanieś 150 µL medium wtórnego do każdej studni. Wykonaj to z siłą wystarczającą do usunięcia wszelkich przylegających agregatów. Po inkubacji zwróć płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych na 24 godziny.Ostrożnie usuń medium, uważając, aby nie odessać agregatu komórkowego. Do każdej studzienki dodaj 150 µL świeżego N two B 27 z siłą wystarczającą do oderwania przylegających agregatów. Powtarzaj tę czynność co 24 godziny przez całkowity czas inkubacji wynoszący około pięć dni.Aby przygotować agregaty do fiksacji, najpierw delikatnie odessij roztwór inkubacyjny z każdej studzienki, trzymając pipetę pod kątem 30 stopni. Aby zapobiec odessaniu agregatu komórkowego, dodaj do każdej studzienki 150 µL PBS. Odczekaj kilka minut, aż agregat opadnie na dno, a następnie odessij PBS.Powtórz ten etap płukania jeszcze dwukrotnie, używając sterylnych nożyczek. Odetnij końcówkę pipety P 1000 w odległości około trzech milimetrów nad jej wylotem. Na koniec, używając tej końcówki, aspiruj i wydziel niewielką objętość cieczy do dołka.Należy wymieszać agregat, aby odczepić go od dna dołka. Następnie należy zaciągnąć agregat do końcówki i przenieść go do szkiełka do sekcji drosofil. Stosując tę samą procedurę, należy zebrać wszystkie agregaty, które zostaną poddane identycznym procedurom immunobarwienia, do jednego szkiełka.Umieść wgłębnik sekcyjny pod mikroskopem i zakręć nim, aby przesunąć agregaty w stronę środka. Następnie ostrożnie odessaj PPS z krawędzi wgłębni, uważając, aby nie usunąć żadnych agregatów.Aby utrwalić agregaty, należy dodać 1 mL świeżo przygotowanego 4% roztworu formaldehydu i inkubować naczynia w wytrząsarce orbitalnej przez dwie godziny w temperaturze 4 °C. Ustawić niską prędkość obrotową. Ostrożnie odessać roztwór formaldehydu, aby uniknąć zassania agregatów, a następnie dodać 1 mL PBS do dołka.Przenieś płytkę z powrotem na wytrząsarkę orbitalną na 10 minut. Usuń PBS z dołka i powtórz ten etap płukania jeszcze dwa razy. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu P-B-S-F-T i umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 10 minut.Odssać roztwór i powtórzyć przemywanie jeszcze dwa razy. Dodać 1 ml PBS-FT do każdej studzienki, aby zablokować agregaty przed nieswoistą immunoreaktywnością. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C.Po inkubacji ostrożnie odessać roztwór blokujący z dołków i dodać 500 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w P-B-S-F-T. Uszczelnić płytkę paraformą, aby zapobiec odparowaniu, i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości. Następnie zastąpić roztwór przeciwciała pierwszorzędowego schłodzonym P-B-S-F-T.Wypłucz agregaty, umieszczając płytkę na wytrząsarce orbitalnej. Ustaw niską prędkość w temperaturze 4 °C na pięć minut. Powtórz płukanie jeszcze raz.Przeprowadzić dwa dodatkowe cykle płukania w roztworze P-B-S-F-T w temperaturze 4 °C przy niskiej prędkości na wytrząsarce orbitalnej. Zgodnie z protokołem tekstowym, usunąć roztwór płuczący i inkubować z 500 µl przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w P-B-S-F-T. Dodać 1 µg/mL herst w celu wizualizacji jąder komórkowych i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze gyratorowym, chroniąc próbki przed światłem.Przeprowadź kolejny cykl płukania w PBS FT w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc próbki przed światłem za pomocą pudełka owiniętego folią. Wykonaj dodatkowe płukania w PBS zawierającym 0,2% FBS i 0,2% Triton X 100 lub w buforze PBT w temperaturze pokojowej. Po ostrożnym odessaniu roztworu, inkubuj agregaty w jednym mililitrze mieszaniny glicerolu i PBT w stosunku jeden do jednego przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.Następnie inkubować je w 1 ml roztworu glicerolu i PBT w stosunku 7:3 przez 30 minut. Aby przygotować próbki do obrazowania konfokalnego, należy odessać roztwór glicerolu i PBT i zastąpić go 1 ml medium montażowego. Następnie nanieść agregaty w formie kropli o objętości 17 µl na szkiełko przedmiotowe.Za pomocą końcówki pipety przygotuj dystans, składając kawałek dwustronnej taśmy czterokrotnie. Następnie umieść po jednym dystansie po obu stronach agregatów na szkiełku, odwróć szkiełko nakrywkowe, nasuń je na dystanse, a następnie obrazuj agregaty przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Po 48 godzinach od wysiania tworzą się agregaty o średnicy około 150 µm, które charakteryzują się gładkimi krawędziami.Z drugiej strony, niska jakość medium, nieoptymalna liczba wysiewanych komórek lub słaba adhezja komórek mogą prowadzić do nieprawidłowej agregacji. 120 godzin ciągłego traktowania CHI 9 9 0 2 1, inhibitorem kinazy syntazy glikogenu 3, powoduje wydłużenie się sferycznego agregatu. Ponadto, po traktowaniu obserwuje się wyraźną lokalizację komórek pozytywnych pod kątem SOX GFP na jednym z końców agregatu; różne rodzaje traktowania prowadzą do odmiennych zmian morfologicznych w pojedynczym agregacie oraz w rozmieszczeniu markerów fluorescencyjnych.Lokalizację w obrębie agregatu można śledzić w czasie. Po opanowaniu techniki badacz będzie w stanie wytworzyć agregaty w ciągu około 45 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Po uformowaniu się agregatów, zamiast barwienia immunocytochemicznego, można zastosować inne metody, takie jak Q-R-T-P-C-R, aby zbadać zmiany w ekspresji genów wewnątrz agregatów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak formować agregaty z MEC, stosować określone bodźce oraz przygotowywać agregaty do barwienia immunocytochemicznego i analizy za pomocą mikroskopii konfokalnej.

generation-aggregates-mouse-embryonic-stem-cells-that-show-symmetry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób przeprowadzania różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w ciała zarodkowe z wykorzystaniem metody wiszących kropli.

Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) z wykorzystaniem metody wiszącej kropli

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Tutaj opisujemy protokół oparty na epigenetycznym przeprogramowaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w kierunku generowania jednorodnej populacji komórek progenitorowych mięśni szkieletowych, które w dopuszczalnych warunkach hodowli tworzą trójwymiarowe skupiska kurczliwych włókien mięśniowych (miosfer), które podsumowują biologiczne cechy ludzkich mięśni szkieletowych.

Generowanie miosfer z hESC poprzez przeprogramowanie epigenetyczne

Konwencjonalne metody inicjowania różnicowania sercowego ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) na podstawie agregatu zawiesinowego są nękane niejednorodnością hodowli pod względem wielkości i kształtu agregatu. W tym miejscu opisujemy solidną metodę różnicowania serca wykorzystującą mikrostudzienki do generowania agregatów hPSC o kontrolowanej wielkości, hodowanych w warunkach sprzyjających pracy serca.

Optymalizacja wielkości agregatu w mikrostudzienkach do różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na podstawie zawiesiny

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy do obrazowania poklatkowego dwuwymiarowego (2D) wzrostu i gojenia ran. Udostępniamy również metodologię analizy danych z obrazowania poklatkowego w celu określenia powstawania strumienia komórkowego i ruchliwości kierunkowej.

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Ten protokół opisuje, jak wytworzyć funkcjonalną tkankę węzłową zatok z mysich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Nadekspresja T-Box3 (TBX3) oraz dobór antybiotyków promotora miozyny o ciężkim łańcuchu (Myh6) prowadzi do wysoce czystych agregatów komórek rozrusznika serca. Te "indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe" ("iSAB") zawierają ponad 80% komórek rozrusznika serca, wykazują znacznie zwiększoną szybkość bicia i są w stanie nadawać tempo mięśnia sercowego ex vivo.

Generowanie agregatów komórek mysiego rozrusznika serca w oparciu o programowanie komórek ES w połączeniu z selekcją promotora Myh6

Poznaj metodę generowania agregatów z mysich komórek macierzystych embrionalnych do badania samoorganizacji i wydłużenia osiowego. Technika umożliwia analizę interakcji tkanek i specyfikacji typów komórkowych.

Generowanie agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują łamanie symetrii, polaryzację i emergentne zachowania zbiorowe in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują łamanie symetrii, polaryzację i emergentne zachowania zbiorowe in vitro

Przeglądaj więcej filmów