Name: Mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu za pośrednictwem Sporosarcina pasteurii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę wytrącania kalcytu indukowanego mikrobiologicznie z użyciem bakterii Sporosarcina pasteurii. Technika ta standaryzuje kroki kulturowe i wzbogacania, zapewniając niezawodne rezultaty w badaniach biomineralizacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować partnerom z Inicjatywy Helmholtz-Alberta, Stowarzyszeniu Helmholtza i Uniwersytetowi Alberty za wsparcie wynikające z udziału w tej współpracy. Finansowanie badań jest zapewniane przez Fundusz Inicjatyw i Sieci Kontaktów Stowarzyszenia Helmholtza, uczestniczące Centra Helmholtza oraz przez rząd Alberty w ramach programu ecoTrust Alberta Environment.
Dr. Tanushree Ghosh jest wdzięczna za jej krytyczny wkład na wielu kluczowych etapach.

UWAGA: Wykonaj eksperymentalne protokoły w kolejności opisanej poniżej. Protokół hodowli bakteryjnej omówiono w sekcji 1 (patrz również rysunek 1). W sekcji 2 opisano protokół wzbogacania pożywki przy użyciu dodatków zewnętrznych. W rozdziale 3 opisano protokoły mikroskopii wielomodowej. Masa wszystkich poszczególnych części składowych może być mierzona za pomocą wagi analitycznej. Objętość każdego roztworu może być mierzona za pomocą cylindra objętościowego.
UWAGA: Odpowiednie protokoły bezpieczeństwa biologicznego muszą być przestrzegane dla sekcji 1 - 2. Aby uzyskać szczegółowe informacje, skonsultuj się z instytucjonalnym biurem ds. bezpieczeństwa.
1. Kultura bakteryjna
<ol>
	<li>Kultura bakterii - Przygotowanie podłoża na płytce agarowej
	<ol>
		<li>Zmontuj sprzęt i składniki, takie jak szalki Petriego, kolba, baza Tris, HCl, agar, woda miliporowa, pH-metr itp. Przed użyciem wysterylizować wszystkie pojemniki w autoklawie w temperaturze 121 °C.</li>
		<li>Przygotować 1 l 0,13 M wodnego roztworu buforu Tris, mieszając 15,75 g roztworu Tris z 1 litrem wody Millipore. Aby obniżyć poziom pH pierwotnego roztworu (pH 10,4), dodaj 2 800 μl HCl (stężenie 50%). Sprawdzaj w sposób ciągły za pomocą pH-metru, aby ustawić pH = 9.</li>
		<li>Podzielić 1 l roztworu buforowego na dwie części w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Weź 800 ml tego roztworu. Podziel go równo na dwie części po 400 ml każda. Rozpuścić 8 g (NH4)2SO4 w jednym roztworze i 16 g ekstraktu drożdżowego w drugim roztworze.</li>
			<li>Pobrać pozostały (200 ml) roztwór i ponownie podzielić go na dwie części po 100 ml każda. Wymieszaj 2 g (NH4)2SO4 do jednego. Do drugiego dodać 4 g ekstraktu drożdżowego i 4 g agaru.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Autoklaw oddzielnie 4 roztwory po owinięciu odpowiednich kolb folią aluminiową i przyklejeniu taśm autoklawowych. 
		UWAGA: Jeśli używany jest autoklaw stołowy, objętość należy ustawić na 500 ml (temperatura i ciśnienie są automatycznie określane w funkcji objętości).</li>
		<li>Po wyjęciu ich z autoklawu odłóż na bok dwa roztwory o objętości 400 ml do wykonania kroku 1.3.1 (poniżej). Wymieszać dwa roztwory o objętości 100 ml, aby uzyskać roztwór o objętości 200 ml. Wlej mieszaninę do 10-12 szalek Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla bakterii — przygotowanie próbki na płytce agarowej
	<ol>
		<li>Wyjmij bulion bakteryjny z zamrażarki (-80 °C) i pozostaw do rozmrożenia. Po prawidłowym rozmrożeniu umieść wywar bakteryjny i płytkę agarową w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Wybierz mikropipetę o najmniejszym dostępnym wymiarze (0,5 - 10 μl to dobry wybór), aby narazić końcówkę wywarem Sporosarcina pasteurii. Pokryj płytkę agarową końcówką do mikropipety. Umieścić płytkę agarową z prążkami w niewstrząsającym inkubatorze w temperaturze 31 °C na 48 godzin.</li>
		<li>Po 48 godzinach wyjąć płytkę z inkubatora i sprawdzić wzrokowo, czy nie ma w niej pojedynczych kolonii. Jeśli nie ma pojedynczych kolonii, umieść je w inkubatorze na kolejne 24 godziny.</li>
		<li>Powtarzaj proces, aż zostaną wykryte pojedyncze kolonie. Nie należy przekraczać 7 dni okresu próbnego. 
		UWAGA: Jeśli pojedyncze kolonie nie pojawią się nawet po tygodniu, stwierdza się, że kroki nie zostały prawidłowo wykonane i cały proces należy powtórzyć od kroku 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla bakterii - przygotowanie próbki końcowej
	<ol>
		<li>Zmieszać ze sobą dwa 400 ml roztworów (Tris buffer + (NH4)2SO4 i Tris buffer + ekstrakt drożdżowy (1.5.1) w celu uzyskania 800 ml roztworu. Przenieść 125 ml tego roztworu do kolby.</li>
		<li>Przeprowadzić oględziny powierzchni płytki agarowej, aby zidentyfikować obszary o wysokim stężeniu pojedynczych kolonii. Delikatnie szturchnij i rozbij jedną z kolonii za pomocą końcówki mikropipety.</li>
		<li>Zanurzyć tę samą końcówkę mikropipety w kolbie o pojemności 125 ml i dokładnie wymieszać, aby upewnić się, że liczba komórek jest wystarczająca do solidnego namnażania. Umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsaniem przy 150 obr./min, 30 °C na 2-3 dni. Po 2 - 3 dniach wyjąć kolbę z inkubatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla bakterii - końcowa liczba komórek
	<ol>
		<li>Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie nierozcieńczonego roztworu hodowlanego za pomocą PBS, aby osiągnąć rozcieńczenie co najmniej dziesięciu milionów (10-7), aby zapewnić pojawienie się policzalnych pojedynczych kolonii. Narysuj siedem równoległych linii w równej odległości na jednej z płytek agarowych.
		<ol>
			<li>Zrób to, rysując pogrubione linie na dolnej powierzchni szalki Petriego, wystarczająco wyraźne, aby były widoczne z góry. Wrzuć 3 małe krople nierozcieńczonego roztworu do jednego segmentu. Dodać 1 ml nierozcieńczonego roztworu do 9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu uzyskania rozcieńczenia w stosunku 1:10.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Weź małą porcję (~ 0,1 ml) tego nowo rozcieńczonego roztworu za pomocą pipety i upuść 3 kolejne małe krople na następny segment. Przenieść nowo rozcieńczony roztwór do nowej kolby i dalej rozcieńczać dziesięć razy (10x) przez dodanie PBS. Powoduje to zmniejszenie rozcieńczenia do 10-2 lub 1:100.
		<ol>
			<li>Użyj tego rozwiązania 1:100 w następnym segmencie. Powtórzyć ten proces z małymi objętościami świeżo rozcieńczonych roztworów, kolejno przenosząc je do nowych kolb i stale rozcieńczając dziesięciokrotnie (10x) w połączeniu z PBS, aby uzyskać coraz więcej rozcieńczonych próbek od 10-3 lub 1:1000 aż do 10-7 lub 1:10 miliona do ostatniego segmentu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonać liczenie na płytce Colony-Forming Unit (CFU), aby policzyć liczbę komórek obecnych na płytce agarowej po inkubacji płytki przez 1-2 dni w temperaturze 31 °C. Daje to ilościową miarę liczby bakterii w nierozcieńczonej próbce. 
		UWAGA: Wartość CFU jest mierzona w oparciu o zdolność systemu do tworzenia kolonii w określonych warunkach pożywki, temperatury i czasu, przy założeniu, że każda kolonia jest oddzielona i założona przez pojedynczą żywotną komórkę drobnoustrojów.</li>
		<li>Uszczelnij szalki Petriego folią samouszczelniającą i przechowuj pozostałe przedmioty w lodówce do wykorzystania w przyszłości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół wzbogacania składników odżywczych w celu przyspieszenia opadów
<ol>
	<li>Przenieść 9 ml przygotowanego płynu hodowlanego (komórki + pożywka) do kilku wysterylizowanych probówek wirówkowych, każda o objętości 10 ml każda.</li>
	<li>Przygotować 100 ml roztworu podstawowego do zewnętrznego wzbogacania, składającego się z czterech składników w następujących stężeniach w pożywce świeżej: mocznik: 2 g/l, chlorek amonu: 1 g/l, wodorowęglan sodu: 212 mg/l, chlorek wapnia: 280 mg/l. Dokładnie odmierzyć wszystkie składniki za pomocą wagi analitycznej i wymieszać wszystko oprócz mocznika ze świeżą pożywką w zlewce i umieścić w autoklawie (121 °C, 15 psi, 15 min).
	<ol>
		<li>Po autoklawie zmieszać wymaganą ilość mocznika (2 mg) z 1 ml świeżej pożywki i przepuścić przez strzykawkę wyposażoną w filtr strzykawkowy 0,22 μm, aby zakończyć proces wzbogacania.</li>
		<li>Dodać 1 ml pożywki wzbogacającej z dodatkami do wysterylizowanych probówek wirówkowych zawierających 9 ml przygotowanej cieczy hodowlanej (komórki + pożywka) (patrz krok 2.1). 
		UWAGA: Spośród wszystkich tych składników, mocznik ulega degradacji w podwyższonych temperaturach i nie może być sterylizowany w autoklawie. W związku z tym, po autoklawowaniu pozostałych składników (121 °C, 15 psi, 15 min), mocznik dodaje się jako ostatni przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj każdą rurkę za pomocą mechanicznego wirownika. Umieścić wzbogacone ciecze (komórki + pożywka + dodatki) w inkubatorze bez wstrząsania w temperaturze 30 °C. Regularnie monitorować wszystkie jednostki pod kątem inicjacji wytrącania. Za pomocą mikroskopu świetlnego rozpocznij obserwacje mikroskopowe po wykryciu gołym okiem wystąpienia opadów. Zwykle jest to od 30 do 36 godzin po rozpoczęciu eksperymentów.</li>
</ol>
3. Protokół dla mikroskopii wielomodowej
<ol>
	<li>Przenieś niewielką objętość (~ 1 ml) płynu do mikroskopowego systemu szkła nakrywkowego z komorą mikroskopową o dużym powiększeniu, aby przeprowadzić wstępne obserwacje w trybie jasnego pola. Na początek wszystkie obserwacje należy rozpocząć od najmniejszego powiększenia (4X). co zapewnia szeroki obszar zasięgu, a co za tym idzie globalną informację o rozmieszczeniu osadów.</li>
	<li>Zaznacz określone obszary ze znacznymi natężeniami opadów i powiększ (20x, 40x, 60x), stopniowo zwiększając powiększenie. 
	UWAGA: Ponieważ niemożliwe jest prawidłowe rozdzielenie komórek z zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS) w jasnym polu (ze względu na bardzo bliskie współczynniki załamania światła), w razie potrzeby włącz tryb kontrastu fazowego. W tym trybie widoczne są tylko kontury błon komórkowych (będące inną fazą niż komórka masowa), co umożliwia wizualne różnicowanie.</li>
	<li>Na koniec zabarwić niektóre komory bejcą Live/Dead, która selektywnie barwi żywe komponenty na zielono, jednocześnie barwiąc martwe elementy na czerwono. Patrz standardowe protokoły28.</li>
	<li>Włącz tryb fluorescencyjny, aby prawidłowo odróżnić obszary czerwone i zielone. Czerwone (czerwona kostka filtracyjna o długości fali wzbudzenia 540 - 580 nm, zwierciadło dichroiczne o długości fali 595 nm i filtr barierowy o długości 600 - 660 nm) i zielone (GFP długoprzepustowa zielona kostka filtracyjna o długości fali wzbudzenia 440 - 480 nm, zwierciadło dichroiczne o długości 505 nm i filtr barierowy 510 nm) kostki filtracyjne są używane do ułatwienia wykonywania mikrofotografii fluorescencyjnych.</li>
	<li>Po zebraniu wszystkich danych w wielu trybach wybierz najlepsze obrazy i ręcznie nakładaj (pojedyncze obrazy w jasnym polu, kontrast fazowy i obrazy fluorescencyjne), aby uzyskać najlepszy możliwy kontrast i klarowność.</li>
	<li>Wykonaj SEM na wysuszonych próbkach stałych, aby zrozumieć struktury krystaliczne. Jest to dobrze ugruntowana i standardowa procedura. 22 Wykonaj XPS w celu identyfikacji sygnatur chemicznych grup funkcyjnych (węglanów). Jest to również dobrze ugruntowana i standardowa procedura. 23</li>
</ol>

<ol><li>Gibson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+Bacillus+pasteurii+group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">An investigation of the Bacillus pasteurii group.</a> Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).</li>
<li>Greenfield, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+concentration+of+calcium+and+magnesium+and+precipitation+of+calcium+carbonate+by+a+marine+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).</li>
<li>Phillips, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+applications+of+ureolytic+biomineralization%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review.</a> Biofouling. 29, 715-733 (2013).</li>
<li>Dhami, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+of+calcium+carbonates+and+their+engineered+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review.</a> Frontiers in microbiology. 4, 314(2013).</li>
<li>Cuthbert, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+on+the+rate+of+ureolysis+and+the+morphology+of+carbonate+precipitated+by+S.+Pasteurii+biofilms+and+limits+due+to+bacterial+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation.</a> Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).</li>
<li>Okwadha, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimum+conditions+for+microbial+carbonate+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Optimum conditions for microbial carbonate precipitation.</a> Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).</li>
<li>Stocks-Fischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiological+precipitation+of+CaCO3%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Microbiological precipitation of CaCO3.</a> Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).</li>
<li>Lauchnor, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterially+induced+calcium+carbonate+precipitation+and+strontium+coprecipitation+in+a+porous+media+flow+system%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+science+%26+technology%22%5BJournal%5D)">Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system.</a> Environmental science & technology. 47, 1557-1564 (2013).</li>
<li>Al Qabany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+Affecting+Efficiency+of+Microbially+Induced+Calcite+Precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Geotechnical+and+Geoenvironmental+Engineering%22%5BJournal%5D)">Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation.</a> Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).</li>
<li>Morita, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcite+precipitation+by+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Geomicrobiology+Journal%22%5BJournal%5D)">Calcite precipitation by marine bacteria.</a> Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).</li>
<li>Chafetz, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+peloids%3A+A+product+of+bacterially+induced+carbonate+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sedimentary+Petrology%22%5BJournal%5D)">Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation.</a> Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).</li>
<li>Biomason.com. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.biomason.com">http://www.biomason.com</a> (2015).</li>
<li>Whiffin, V. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microbial+CaCO3+precipitation+for+the+production+of+biocement%22">Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement</a>. , Murdoch University. PhD thesis (2004).</li>
<li>Paassen, L. A., et al. Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method. Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).</li>
<li>Cunningham, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbially+enhanced+geologic+containment+of+sequestered+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Procedia%22%5BJournal%5D)">Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2.</a> Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).</li>
<li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Greenhouse+Gas+Control%22%5BJournal%5D)">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li>
<li>Cunningham, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+risk+of+well+bore+leakage+of+CO2+using+engineered+biomineralization+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Procedia%22%5BJournal%5D)">Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers.</a> Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).</li>
<li>Jonkers, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bacteria+as+self-healing+agent+for+the+development+of+sustainable+concrete%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete.</a> Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).</li>
<li>Tobler, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+Sporosarcina+pasteurii+in+sandstone+and+its+significance+for+subsurface+engineering+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Geochemistry%22%5BJournal%5D)">Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies.</a> Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).</li>
<li>Mortensen, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+factors+on+microbial+induced+calcium+carbonate+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation.</a> Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).</li>
<li>Phillips, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+CO2+leakage+reduction+through+biofilm-induced+calcium+carbonate+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+science+%26+technology%22%5BJournal%5D)">Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation.</a> Environmental science & technology. 47, 142-149 (2013).</li>
<li>Robbins, R. Scanning Electron Microscope Operation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf">http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf</a> (2010).</li>
<li>vander Heide, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avander+Heide%2C+P+%22X-ray+Photoelectron+Spectroscopy%3A+An+introduction+to+Principles+and+Practices%22">X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices</a>. , John Wiley & Sons. (2011).</li>
<li>Wiley, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+an+alkaline+pH+and+ammonia+for+substrate+oxidation+by+Bacillus+pasteurii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii.</a> Journal of Bacteriology. 84, (1962).</li>
<li>Tagliaferri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+strain+localisation+processes+in+bio-cemented+sand+using+x-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Granular+Matter%22%5BJournal%5D)">Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging.</a> Granular Matter. 13, 247-250 (2011).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).</li>
<li>Valiei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+web+of+streamers%3A+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).</li>
<li>LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf, https://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/live-dead-baclight-bacterial-viability-protocol.html (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kroki krytyczne: Rękopis ten szczegółowo opisuje protokoły hodowli żywej próbki S. pasteurii. Gdy kultura jest już gotowa, należy ją odpowiednio wzbogacić. Jest to kluczowy krok kluczowy dla powodzenia eksperymentu, ponieważ brak zapewnienia odpowiedniego środowiska chemicznego prowadzi albo do bardzo długich skal czasowych opadów, albo do ich całkowitego braku. S. pasteurii jest dość wrażliwy na kilka czynników zewnętrznych i musi być hodowany z dużą starannością i precyzją, aby zapewn...

Sporosarcina pasteurii to bakteria Gram-dodatnia zdolna do przetrwania w wysoce zasadowym środowisku (pH~10)1 i jest jednym z gatunków bakterii, które mogą stać się czynnikiem sprawczym zjawiska zwanego mikrobiologicznie indukowanym wytrącaniem kalcytu (MICP)2-4. MICP to proces, w którym wytrącanie węglanu wapnia jest indukowane przez niektóre drobnoustroje w odpowiednich warunkach środowiskowych. S. pasteurii zyskał na znaczeniu w ostatnich latach ze względu na jego identyfikację jako możliwego czynnika wywołującego znaczne ilości MICP w pewnych warunkach. Możliwość ta wynika z faktu, że S. pasteurii ma wyjątkową zdolność do wydzielania dużych ilości enzymu ureazy. Enzym ten działa jak katalizator, sprzyjając przyspieszonej lizie mocznika (naturalnie występującego związku biochemicznego o powszechnej i obfitej podaży) w obecności cząsteczek wody. Poprzez kaskadę reakcji proces ten ostatecznie prowadzi do wytworzenia ujemnie naładowanych jonów węglanowych. Jony te z kolei reagują z dodatnimi jonami metali, takimi jak wapń, aby ostatecznie utworzyć osady węglanu wapnia (kalcytu); stąd oznaczenie MICP5-9.
Proces MICP jest znany i badany od kilkudziesięciu lat10,11. W ciągu ostatnich kilku lat MICP był badany pod kątem szerokiego zakresu zastosowań inżynieryjnych i środowiskowych, w tym oddolnego budownictwa ekologicznego12, ulepszania konstrukcji wielkoskalowych13,14 oraz sekwestracji i składowania dwutlenku węgla15,16.
Na przykład, Cunnigham17 et al zaprojektował wysokociśnieniowy reaktor o umiarkowanym przepływie, zawierający rdzeń z piaskowca Berea. Reaktor został zaszczepiony bakterią S. fridgidimarina i w warunkach wtryskiwania nadkrytycznego dwutlenku węgla pod wysokim ciśnieniem zaobserwowano masowe nagromadzenie biomasy wewnątrz objętości porów, co doprowadziło do zmniejszenia przepuszczalności o ponad 95%. Jonkers i Schlangen18 badali wpływ pewnych specjalnych szczepów bakterii na proces samoleczenia w. Oczekuje się, że zewnętrzna woda transportowana do sieci porów, wchodząca przez pory powierzchniowe, aktywuje uśpione bakterie, które z kolei zwiększają wytrzymałość strukturalną poprzez MICP. Tobler19 i in. porównali aktywność ureolityczną S. pasteurii z rodzimym mikrokosmosem ureolitycznym wód gruntowych w warunkach sprzyjających MCIP na dużą skalę i stwierdzili, że S. pasteurii ma stałą zdolność do poprawy wytrącania kalcytu, nawet gdy rdzenne społeczności nie miały wcześniejszej aktywności ureazy. Mortensen20 et.al badali wpływ czynników zewnętrznych, takich jak rodzaj gleby, stężenie chlorku amonu, zasolenie, stężenie tlenu i liza komórek na MICP. Wykazanie, że proces oczyszczania biologicznego jest bardzo solidny w odniesieniu do dużej zmienności przestrzeni parametrów, potwierdza przydatność tego procesu do różnych zastosowań remediacji na dużą skalę, pod warunkiem, że zostanie przeprowadzony odpowiedni proces wzbogacania w celu wzmocnienia bakterii. Phillips21 i nast. Wszyscy zaprojektowali eksperymenty mające na celu zbadanie zmian przepuszczalności i wytrzymałości kolumny piaskowej i rdzenia z piaskowca po wstrzyknięciu kultur S. pasteurii. Okazało się, że podczas gdy przepuszczalność zmniejszyła się 2-4 razy, podczas gdy wytrzymałość na pękanie wzrosła trzykrotnie.
S. pasteurii i jego rola w MICP są tematami aktywnych badań, a kilka kwestii związanych z mechanizmem chemicznego wytrącania się nie jest jeszcze w pełni zrozumiałych. W związku z tym bardzo ważne jest posiadanie zestawu spójnych, znormalizowanych protokołów w celu dokładnej hodowli odpowiednio wzbogaconego stada S. pasteurii w celu osiągnięcia MICP. W tym miejscu przedstawiamy rygorystyczny protokół, który zapewni powtarzalność i odtwarzalność. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły hodowli S. pasteurii i odpowiedniego wzbogacania pożywki hodowlanej w celu wywołania wytrącenia. Proces ten jest badany za pomocą różnych technik mikroskopowych, takich jak optyczna i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) oraz rentgenowska spektroskopia fotoelektronowa (XPS). Manuskrypt koncentruje się na procesie MICP. Procedury takie jak SEM i SIMS, będące dobrze ugruntowanymi standardowymi protokołami, nie są opisane oddzielnie.

<table><tbody><tr><td>Petridish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Petridish jest używany jako kolby pyrexowe na płytce agarowej</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S63268</td><td>Corning Erlenmeyer</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Promega</td><td>H5133</td><td>używany do wytwarzania kwasu solnego Tris-Buffer</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td>1,0 N, bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Agar w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>testowany mikrobiologicznie, testowany na kulturach komórkowych roślinnych, testowany na kulturach komórkowych, proszek</td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td>do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder miarowy</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP08559GC</td><td>Cylinder z podziałką klasy A z Cal Cert, TC; 1,000 ml,1/opk</td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>OHAUS</td><td>AX124E</td><td>służy do pomiaru masy odczynników</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Brinkmann</td><td>58619000</td><td></td></tr><tr><td>Taśma autoklawowa</td><td>VWR</td><td>52428864</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z185140</td><td>używana do uszczelniania kolby przed umieszczeniem jej w autoklawie</td></tr><tr><td>Kolba bakteryjna</td><td>Cedarlane</td><td>11859</td><td>-80 stopni Celsjusza; C zapas S. pasteurii, nr ATCC jest wymieniony przeciwko Cat. Nie.</td></tr><tr><td>Jednokanałowe pipety mechaniczne Mline, o zmiennej objętości</td><td>Biohit</td><td>725010</td><td>Sprzedawane przez firmę VWR pod numerem katalogowym 14005976</td></tr><tr><td>Końcówka do mikropipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>212772B</td><td>Służy do drapania płytek agarowych</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Spoiwo</td><td>80079098</td><td>Inkubator mikrobiologiczny,</td></tr><tr><td>inkubator wytrząsający</td> serii BF <td>VWR</td><td>14004300</td><td>Wytrząsanie stołowe VWR Signature Inkubatory</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Solanka (PBS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do pipetowania BD Falcon Express Pipet-Aid</td><td>BD Biosciences</td><td>357590</td><td>Sprzedawane przez VWR pod numerem katalogowym 53106220</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>Używany do uszczelniania płytek agarowych</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td>Wzbogacenie o pożywkę</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td>Wzbogacenie na pożywkę</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Wzbogacenie na pożywkę</td></tr></tbody></table>

mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu za pośrednictwem sporosarcina pasteurii

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Badana tutaj bakteria (S. pasteurii) jest wyjątkowa w swojej zdolności, w odpowiednich warunkach, do wywoływania hydrolizy mocznika (ureolizy) w naturalnie występujących środowiskach poprzez wydzielanie enzymu ureazy. Ten proces ureolizy, poprzez łańcuch reakcji chemicznych, prowadzi do powstania osadów węglanu wapnia. Jest to znane jako mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu (MICP). Właściwe protokoły hodowli dla MICP są szczegółowo opisane tutaj. Na koniec przeprowadzono eksperymenty wizualizacyjne w różnych trybach mikroskopii, aby zrozumieć różne aspekty procesu wytrącania. Techniki takie jak mikroskopia optyczna, skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i rentgenowska spektroskopia fotoelektronowa (XPS) zostały wykorzystane do chemicznej charakterystyki produktu końcowego. Co więcej, zdolność tych osadów do zatykania porów wewnątrz naturalnego porowatego ośrodka została zademonstrowana w eksperymencie jakościowym, w którym użyto prętów gąbczastych do naśladowania sieci porów o różnych skalach długości. Gąbka zanurzona w pożywce hodowlanej zawierającej komórki bakteryjne twardnieje z powodu zatkania jej porów w wyniku ciągłego procesu wytrącania chemicznego. Ten hartowany pręt gąbczasty wykazuje lepszą wytrzymałość w porównaniu z prętem gąbczastym kontrolnym, który ulega ściśnięciu i ściśnięciu pod wpływem przyłożonego obciążenia zewnętrznego, podczas gdy utwardzony pręt jest w stanie utrzymać ten sam ciężar przy niewielkim odkształceniu.

S. pasteurii, będąc organizmem alkalifilnym24, może przetrwać w stosunkowo trudnych warunkach. Przy zastosowaniu wspomnianego protokołu hodowli i uprawie S. pasteurii w komorze, bakterie prowadzą z czasem do wytrącenia węglanu wapnia (Rysunek 2A). Rysunek 2 (b) przedstawia obraz z mikroskopu optycznego w kontraście fazowym, ukazujący populację komórek bakteryjnych w pożywce hodowlanej. Można wyraźnie rozpoznać pojedyncze komór...

Protokoły dla mikrobiologicznie indukowanego wytrącania kalcytu (MICP) przy użyciu bakterii Sporosarcina pasteurii są przedstawione tutaj. Wytrącony węglan wapnia scharakteryzowano za pomocą mikroskopii optycznej i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Wykazano również, że ekspozycja na MICP zwiększa wytrzymałość gąbki na ściskanie.

Mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu za pośrednictwem Sporosarcina pasteurii

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest indukcja wytrącania kalcytu w stagnującej kulturze Sporosarcina pasteurii. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania biofizyczne dotyczące wytrącania kalcytu pośredniczonego przez Sporosarcina pasteurii, takie jak odpowiednie skale długości i czasu. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że standaryzuje ona złożone etapy związane z odpowiednim hodowaniem i wzbogacaniem Sporosarcina pasteurii, co zapewnia niezawodne wytrącanie kalcytu.W pierwszej kolejności należy przygotować szalki Petriego, kolby, Tris w formie zasady, HCl, agar, wodę Millipore oraz pH-metr. Przed użyciem wszystkie pojemniki należy wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C. Przygotować jeden litr 0,13 M wodnego roztworu buforu Tris, mieszając 15,75 g Tris w formie zasady z jednym litrem wody Millipore.Dodaj około 2,8 milliliters 50%HCl, aby dostosować pH buforu do wartości dziewięć. Po przygotowaniu hodowli należy ją odpowiednio wzbogacić właściwym buforem. Krok ten jest krytyczny dla powodzenia eksperymentu, ponieważ brak zapewnienia odpowiedniego środowiska chemicznego może doprowadzić do bardzo długiego czasu wytrącania lub nawet do jego całk

microbiologically-induced-calcite-precipitation-mediated-sporosarcina

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Bhaduri, S., et al., Mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu za pośrednictwem Sporosarcina pasteurii. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia metodę wzbogacania Sporosarcina pasteurii w mocznik i chlorek wapnia w celu wywołania aktywności ureazy, co prowadzi do powstania widocznych kryształów kalcytu poprzez mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu lub MICP.

Mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu przez Sporosarcina pasteurii

Metoda wyodrębniania endospor bakteryjnych ze złożonych społeczności mikrobiologicznych została opracowana w celu przeprowadzenia dostosowanych kultur lub badań molekularnych tej grupy bakterii.

Fizyczna izolacja przetrwalników z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych

Przedstawiono protokół równoległej produkcji wytrąconego węglanu wapnia i materiału zeolitowego z żużla wielkopiecowego poprzez karbonatyzację minerałów i alkaliczną konwersję hydrotermalną. Badana jest wydajność materiału zeolitowego w kierunku adsorpcji niklu.

Dwukierunkowa waloryzacja żużla wielkopiecowego: synteza wytrąconego węglanu wapnia i zeolitowego adsorbentu metali ciężkich

Pokazujemy użycie różnych metod mikroskopowych, które są przydatne do obserwacji zwapnienia tubeworma, Hydroides elegans, a także do lokalizowania i charakteryzowania pierwszego zwapniałego materiału. Mikroskopia na żywo i mikroskopia elektronowa są używane razem w celu dostarczenia informacji funkcjonalnych i materiałowych, które są ważne w badaniu biomineralizacji.

Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

Opisujemy protokół wytrącania i charakterystyki kryształów węglanu wapnia, które powstają w obecności biopolimerów.

Tworzenie węglanu wapnia w obecności dodatków biopolimerowych

Tutaj prezentowana jest technologia mikrobiologicznie indukowanego wytrącania kalcytu (MICP) w celu poprawy właściwości gleby przez zanurzenie.

Poprawa jakości gleby piaszczystej poprzez indukowane mikrobiologicznie wytrącanie kalcytu (MICP) przez zanurzenie

Izolacja odpornych na metale ciężkie mikroorganizmów ze źródeł geotermalnych jest gorącym tematem dla rozwoju biosystemów bioremediacji i monitorowania środowiska. Badanie to zapewnia metodologiczne podejście do izolowania i identyfikacji bakterii tolerujących metale ciężkie z gorących źródeł.

Bioprospekcja mikroorganizmów ekstremofilnych w celu rozwiązania problemu zanieczyszczenia środowiska

Sporosarcina pasteurii to bakteria ureolityczna, która rozkłada mocznik na węglan i amon. Węglan łączy się z wapniem, tworząc węglan wapnia, tworząc sieć krystaliczną, która zakotwicza otaczające cząstki w celu wytworzenia biocementu. Jest to wygodny protokół do używania form drukowanych w 3D do tworzenia cegieł biocementowych nadających się do testów ściskania.

Produkcja i analiza cegieł biocementowych Sporosarcina pasteurii przy użyciu niestandardowych form drukowanych w 3D do nieograniczonych testów ściskania

Zsyntetyzowaliśmy złote nanogwiazdy o kształcie gwiazdy, wykorzystując metodę wzrostu wspomaganego srebrnymi zarodkami. Średnica nanogwiazd wynosi od 200 do 300 nm, a liczba ramion waha się od 7 do 10. Nanocząstki wykazują szeroki mod powierzchniowego rezonansu plazmonowego z maksimum w bliskiej podczerwieni.

Synteza nanogwiazd złota metodą wzrostu sterowanego srebrnymi nasionami

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Poznaj metodę wytrącania kalcytu indukowanego mikrobiologicznie z użyciem bakterii Sporosarcina pasteurii. Technika ta standaryzuje kroki kulturowe i wzbogacania, zapewniając niezawodne rezultaty w badaniach biomineralizacji.

Mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu za pośrednictwem Sporosarcina pasteurii

Przeglądaj więcej filmów