Name: Szybki fenotypowy system punktacji neurologicznej do oceny postępu choroby w mysim modelu SOD1-G93A ALS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj szybką metodę oceny funkcji neuromuskularnej w mysim modelu ALS SOD1-G93A. System punktacji neurologicznej umożliwia niezawodną ocenę postępu choroby i skuteczności terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Beth Levine za krytyczną recenzję rękopisu, Valerie Tassinari za opracowanie protokołu genotypowania, oraz Mattowi Feroli i Carlosowi Mayi za wyjątkową opiekę nad zwierzętami.

Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z protokołami opisanymi przez National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Animals i zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt ALS TDI (IACUC).
1. Zwierzęta, budynki mieszkalne i projektowanie badań
Uwaga: Kolonia myszy SOD1-G93A została wyprowadzona ze szczepu B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur o wysokiej kopii, pierwotnie wyprodukowanego przez Gurney et al. 7. Kolonia jest obecnie utrzymywana poprzez krzyżowanie transgenicznych samców C57BL/6-SJL z samicami C57BL/6-SJL F1 typu dzikiego. Zwierzęta F1 są generowane przez krzyżowanie samców SJL z samicami B6. Myszy są wysyłane do ALS TDI co tydzień w wieku 35–45 dni.
<ol>
	<li>Pozwól myszom na co najmniej tydzień na aklimatyzację w obiekcie dla zwierząt (12-godzinny cykl światła/ciemności w temperaturze 18-23 °C i wilgotności 40-60%) przed przypisaniem do badania.</li>
	<li>Samce myszy domowych SOD1-G93A po jednej myszy na klatkę, ponieważ samce trzymane w grupie mają tendencję do walki. Trzymaj samice myszy SOD1-G93A do dwóch na klatkę. Zapewnij wzbogacenie środowiska w postaci plastikowych chat. Dostarczaj jedzenie i wodę ad libitum, chyba że myszy biorą udział w badaniu wymagającym podawania leku w wodzie pitnej/pożywieniu. W takich przypadkach racjonuj i rejestruj jedzenie i wodę.</li>
	<li>Rozpocznij badanie skuteczności leku około 50 dnia życia i włącz 64 myszy dopasowane do miotu o zrównoważonej płci (32 na kohortę). Na koniec upewnij się, że badacze prowadzący badania są ślepi na warunki eksperymentalne. 
	Uwaga: Zaleca się, aby typowe badanie skuteczności leku rozpoczęło się w wieku 50 lat, jednak w zależności od rodzaju interwencji terapeutycznej preferowane może być rozpoczęcie badania wcześniej lub później. 
	Uwaga: Badanie z udziałem 32 myszy na kohortę ma na celu wykrycie efektów leków specyficznych dla płci. Jeśli nie są wymagane porównania specyficzne dla płci, 24 myszy na kohortę powinny wystarczyć do wykrycia ogólnego działania leku.</li>
</ol>
2. Masa ciała
<ol>
	<li>Rejestruj masę ciała wszystkich myszy w badaniach codziennie z dokładnością do jednej dziesiątej grama. Uwaga: Masa ciała jest czułym wskaźnikiem postępu choroby i wszelkich złych spraw, które mogą wynikać z przewlekłego leczenia farmakologicznego.</li>
	<li>Waga ciała myszy zmienia się znacznie w ciągu dnia, jest wyższa rano, dlatego rejestruj je mniej więcej o tej samej porze każdego dnia.</li>
</ol>
3. System punktacji neurologicznej (NeuroScore)
<ol>
	<li>Oceń wyniki neurologiczne (NS) dla każdej myszy dziennie, obserwując mysz w następujących trzech warunkach wykonywanych sekwencyjnie: a) mysz jest zawieszona za ogon, b) mysz może chodzić, a po wystąpieniu niedowładu c) mysz kładzie się na boku.
	<ol>
		<li>W teście zawieszenia ogona trzymaj mysz około 1.5 cala od podstawy ogona nad drucianą górną częścią klatki domowej przez 1-2 sekundy, z dala od miski z jedzeniem, obserwując tylne kończyny. Powtórz test zawieszenia 3 razy i zapisz najbardziej spójny wynik.</li>
		<li>W teście chodzenia umieść mysz na czystej powierzchni, która zapewnia przyczepność i odległość spaceru 25 cm (np. ręcznik papierowy przyklejony taśmą, aby zapobiec poślizgnięciu się). Pozwól myszy przejść łącznie 75 cm (3 razy więcej niż długość ręcznika papierowego), obserwując jej chód.</li>
		<li>W teście "odruchu prostego" umieść mysz po jej lewej lub prawej stronie i za pomocą stopera zmierz czas potrzebny na samodzielne wyprostowanie się z obu stron. Uwaga: Wymagana jest tylko jedna próba tego testu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ NS każdej kończyny tylnej (lewej lub prawej) niezależnie w skali od 0 do 4. Uwaga: Na przykład wynik 0, 1 wskazuje, że lewa tylna kończyna NS wynosi 0, podczas gdy prawa tylna kończyna NS wynosi 1.</li>
	<li>Przypisz wyniki neurologiczne (0-4) odpowiadające następującemu zestawowi obserwacji (podsumowanie zamieszczone w Tabeli 1):
	<ol>
		<li>Przypisz NS 0 (przedobjawowy), jeśli zaobserwowane są następujące objawy: Gdy mysz jest zawieszona za ogon, tylna kończyna wykazuje normalne rozchylenie, tj. jest całkowicie wysunięta od bocznej linii środkowej i pozostaje w tej pozycji przez 2 sekundy lub dłużej. Kiedy mysz może chodzić, obserwuje się normalny chód.</li>
		<li>Przypisz NS 1 (pierwsze objawy), jeśli zaobserwowane są następujące objawy: Gdy mysz jest zawieszona za ogon, tylna kończyna wykazuje nieprawidłowe rozchylenie, tj. jest zapadnięta lub częściowo zapadnięta w kierunku bocznej linii środkowej LUB drży podczas zawieszenia ogona LUB jest schowana/zaciśnięta. Kiedy mysz może chodzić, obserwuje się normalny LUB nieco powolny chód.</li>
		<li>Przypisz NS 2 (Początek niedowładu), jeśli zaobserwowane są następujące objawy: Gdy mysz jest zawieszona za ogon, tylna kończyna jest częściowo LUB całkowicie zapadnięta, nie rozciągając się zbytnio. (Nadal może występować ruch stawów). Kiedy mysz może chodzić, tylna kończyna jest używana do ruchu do przodu, jednak palce u nóg zwijają się w dół co najmniej dwa razy podczas marszu 90 cm LUB dowolna część stopy ciągnie się po dnie klatki/stole. Gdy mysz zostanie umieszczona po lewej i prawej stronie, jest w stanie wyprostować się w ciągu 10 sekund z OBU stron.</li>
		<li>Przypisz NS 3 (paraliż), jeśli zaobserwowane są następujące warunki: Gdy mysz jest zawieszona za ogon, występuje sztywny paraliż kończyny tylnej LUB minimalny ruch stawu. Kiedy mysz może chodzić, następuje ruch do przodu, jednak tylna kończyna NIE jest używana do ruchu do przodu. Gdy mysz zostanie umieszczona po lewej i prawej stronie, jest w stanie wyprostować się w ciągu 10 sekund z OBU stron. Uwaga: Rzadko, po wystąpieniu paraliżu, wilgoć z moczu może pojawić się na kończynach tylnych. Nieleczona wilgoć z moczu może spowodować "oparzenia" moczu i zmiany skórne. Usuń wilgoć z moczu, przycinając włosy, Nałóż ciepłą wodę, aby usunąć mocz i delikatnie osusz. W przypadku wystąpienia zmian skórnych należy zastosować maść z antybiotykiem.</li>
		<li>Przypisz NS 4 (Humanitarny punkt końcowy), jeśli zaobserwowane są następujące warunki: Kiedy mysz jest zawieszona za ogon, dochodzi do sztywnego paraliżu kończyn tylnych. Kiedy mysz może chodzić, nie ma ruchu do przodu. Gdy mysz jest umieszczona po lewej i prawej stronie, NIE jest w stanie wyprostować się w ciągu 10 sekund z ŻADNEJ strony. tj. brak odruchu prostowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wprowadzanie i analiza danych
<ol>
	<li>W trakcie badania skuteczności leku należy wprowadzić dane zebrane dla każdej myszy do systemu zarządzania informacjami laboratoryjnymi (LIMS) lub do dostępnego na rynku arkusza kalkulacyjnego. 
	Uwaga: Opracowane przez ALS TDI oprogramowanie LIMS jest centralnym repozytorium wszystkich danych zebranych z badań wewnętrznych, dzięki czemu dane te są wygodnie dostępne w czasie dla badaczy ALS TDI. LIMS śledzi każdą pojedynczą mysz, z jej unikalnym identyfikatorem, z powrotem do jej rodowodu, masy ciała lub wyniku neurologicznego we wszystkich dniach badania i uwzględnia wszelkie inne obserwacje odnotowane podczas jej życia. LIMS finalnie generuje arkusz kalkulacyjny, który jest wykorzystywany do kolejnych analiz.</li>
	<li>Po zakończeniu badania skuteczności leku, tj. gdy wszystkie myszy osiągną humanitarny punkt końcowy, użyj oprogramowania arkusza kalkulacyjnego (patrz tabela materiałów), aby obliczyć łączną wartość NS dla każdej myszy, dla każdego dnia, uśredniając NS lewej i prawej kończyny tylnej. Następnie oblicz medianę wieku dla każdej myszy NS dla każdej myszy i liczbę dni, które każda mysz spędza w określonej NS.</li>
	<li>Analizuj ogólne zmiany w NS w czasie, importując dane z arkusza kalkulacyjnego do oprogramowania statystycznego (patrz Tabela materiałów). Dopasuj te dane za pomocą modelu porządkowej regresji logistycznej, który szacuje oczekiwany NS, z medianą wieku w NS i leczeniem farmakologicznym jako efektami regresji. Korzystając z testu logarytmicznego chi kwadrat, oszacuj prawdopodobieństwo wystąpienia efektu i określ, czy wpływ leczenia lekiem na progresję NS jest statystycznie istotny (patrz Plik kodu uzupełniającego, aby uzyskać instrukcje krok po kroku). 
	Uwaga: Wartość p <0,05 jest uważana za statystycznie istotną. 
	Uwaga: Ta metoda analizy statystycznej uwzględnia porządkowy charakter danych NS i zmienny charakter trajektorii NS dla poszczególnych myszy. Jest to preferowane, ponieważ indywidualne trajektorie NS mogą się znacznie różnić, co skutkuje średnimi grupowymi związanymi z czasem NS, które nie odzwierciedlają wystarczająco odpowiedzi NS. Ponadto w niektórych przypadkach NS może ulegać wahaniom, szczególnie w zakresie od zera do jednego.</li>
	<li>Na koniec użyj oprogramowania do tworzenia wykresów (patrz Spis materiałów), aby wygenerować wykresy "Ordinal Expected NS vs Mediana Age at NS" dla zwierząt leczonych narkotykami i kontrolnych (Rysunek 2; patrz Plik kodu uzupełniającego, aby uzyskać instrukcje krok po kroku). Użyj tych wykresów, aby wygodnie oszacować przesunięcia między grupami leczonymi farmakologicznie a grupą kontrolną poprzez interpolację z osi y mediany wieku wystąpienia choroby (tj. NS 2) na osi x. 
	Uwaga: Różnica w medianie wieku między obiema grupami reprezentuje zmianę wywołaną przez lek i jest traktowana jako praktyczna miara wielkości efektu. 
	Uwaga: Przesunięcia w prawo w oczekiwanej krzywej NS w stosunku do mediany wieku wskazują na spowolniony objawowy postęp choroby. I odwrotnie, przesunięcia w lewo w oczekiwanej krzywej NS w stosunku do mediany wieku wskazują na przyspieszoną objawową progresję choroby.</li>
</ol>

<ol><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).</li>
<li>Rosen, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cu%2FZn+superoxide+dismutase+gene+are+associated+with+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).</li>
<li>Gurney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+transgenic+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+in+preclinical+drug+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci.+152%2C+Suppl%22%5BJournal%5D)">The use of transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis in preclinical drug studies.</a> J Neurol Sci. 152, Suppl. 1 (6415), (1997).</li>
<li>Scott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+power%2C+and+interpretation+of+studies+in+the+standard+murine+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">Design, power, and interpretation of studies in the standard murine model of ALS.</a> Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).</li>
<li>Hegedus, J., Putman, C. T., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+preferential+motor+unit+loss+in+the+SOD1+G93A+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Time course of preferential motor unit loss in the SOD1 G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol. Dis. 28 (2), 154-164 (2007).</li>
<li>Gordon, T., Ly, V., Hegedus, J., Tyreman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+of+denervated+muscle+fibers+in+hindlimb+muscles+after+sciatic+nerve+transection+in+wild+type+mice+and+in+the+G93A+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Res%22%5BJournal%5D)">Early detection of denervated muscle fibers in hindlimb muscles after sciatic nerve transection in wild type mice and in the G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurol. Res. 31 (1), 28-42 (2009).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).</li>
<li>Kim, K., Moore, D. H., Makriyannis, A., Abood, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AM1241%2C+a+cannabinoid+CB2+receptor+selective+compound%2C+delays+disease+progression+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">AM1241, a cannabinoid CB2 receptor selective compound, delays disease progression in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur. J. Pharmacol. 542 (1-3), 1-3 (2006).</li>
<li>Weydt, P., Hong, S. Y., Kliot, M., Moller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+disease+onset+and+progression+in+the+SOD1+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS.</a> Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).</li>
<li>Azari, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+and+anatomical+effects+of+systemically+administered+leukemia+inhibitory+factor+in+the+SOD1%28G93A+G1H%29+mouse+model+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioural and anatomical effects of systemically administered leukemia inhibitory factor in the SOD1(G93A G1H) mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Brain Res. 982 (1), 92-97 (2003).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinediones+expand+body+fluid+volume+through+PPARgamma+stimulation+of+ENaC-mediated+renal+salt+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinediones expand body fluid volume through PPARgamma stimulation of ENaC-mediated renal salt absorption.</a> Nat. Med. 11 (8), 861-866 (2005).</li>
<li>Savcheniuk, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+probiotic+therapy+on+development+of+experimental+obesity+in+rats+caused+by+monosodium+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22Fiziol.+Zh%22%5BJournal%5D)">The effect of probiotic therapy on development of experimental obesity in rats caused by monosodium glutamate.</a> Fiziol. Zh. 60 (2), 63-69 (2014).</li>
<li>Smittkamp, S. E., Brown, J. W., Stanford, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+and+characterization+of+orolingual+motor+deficits+in+B6SJL-Tg%28SOD1-G93A%291Gur%2FJ+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Time-course and characterization of orolingual motor deficits in B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J mice.</a> Neuroscience. 151 (2), 613-621 (2008).</li>
<li>C, M., Gurney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+expressor+line+of+transgenic+mice+carrying+a+mutant+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+%28SOD1%29+gene+develops+pathological+changes+that+most+closely+resemble+those+in+human+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">A low expressor line of transgenic mice carrying a mutant human Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1) gene develops pathological changes that most closely resemble those in human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Acta Neuropathol. 93 (6), 537-550 (1997).</li>
<li>Wegorzewska, I., Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43-based+animal+models+of+neurodegeneration%3A+new+insights+into+ALS+pathology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurodegener.+Dis%22%5BJournal%5D)">TDP-43-based animal models of neurodegeneration: new insights into ALS pathology and pathophysiology.</a> Neurodegener. Dis. 8 (4), 262-274 (2011).</li>
<li>Hatzipetros, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C57BL%2F6J+congenic+Prp-TDP43A315T+mice+develop+progressive+neurodegeneration+in+the+myenteric+plexus+of+the+colon+without+exhibiting+key+features+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">C57BL/6J congenic Prp-TDP43A315T mice develop progressive neurodegeneration in the myenteric plexus of the colon without exhibiting key features of ALS.</a> Brain Res. 1584, 59-72 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym raporcie opisujemy szybki i prosty protokół wideo, który, jeśli jest odpowiednio zastosowany, jest w stanie wiarygodnie ocenić postęp choroby u myszy SOD1-G93A i zidentyfikować zmiany wywołane lekiem. Chociaż różne grupy opracowały fenotypowe systemy punktacji dla myszy SOD1-G93A 8-10, często nie dostarczają one wystarczających szczegółów na temat procedury i są nieodpowiednie do replikacji. W związku z tym systemy scoringowe są rzadko stosowane poza konkretną grupą, która je rozwija. W tym raporcie połą...

Od czasu swojego rozwoju w połowie lat 90-tych, transgeniczny model myszy SOD1-G93A jest najczęściej używanym zwierzęcym modelem stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) 1. Ten transgeniczny model myszy został genetycznie zmodyfikowany w celu nadekspresji zmutowanej formy ludzkiego genu dysmutazy ponadtlenkowej Cu / Zn 1 (SOD1), który zawiera mutację glicyny do alaniny związaną z ALS w aminokwasie 93 (G93A). Mutacja G93A jest jedną z wielu mutacji w genie SOD1, które łącznie stanowią około jednej piątej rodzinnych przypadków ALS 2.
Model SOD1-G93A stał się koniem pociągowym w badaniach nad rozwojem leków na ALS, ponieważ oprócz oczywistego genetycznego powiązania z ALS, podsumowuje wiele patologicznych cech ALS u ludzi, takich jak utrata neuronów ruchowych, postępujące osłabienie i atrofia mięśni, z ostatecznym paraliżem i śmiercią 3. Chociaż, jak to często bywa w przypadku transgenicznych modeli zwierzęcych, istnieje nieodłączna zmienność biologiczna związana z myszami SOD1-G93A. Scott i wsp. ustalili, że kohorty co najmniej 24 myszy dopasowanych do miotu, zrównoważonych płciowo są potrzebne w projektach badań skuteczności leków w celu przezwyciężenia szumu wytwarzanego przez zmienność biologiczną 4. Duża liczba zwierząt wymagana w tych badaniach w połączeniu z agresywnym postępem choroby i potrzebą codziennego monitorowania uniemożliwia stosowanie skomplikowanych, czasochłonnych i potencjalnie stresujących technik pomiaru siły i funkcji nerwowo-mięśniowych (np. elektromiografia, siła chwytu, wirnik itp.). Zamiast tego podkreśla potrzebę narzędzia do badań przesiewowych in vivo, które w wiarygodny sposób ocenia funkcję nerwowo-mięśniową myszy SOD1-G93A w szybki sposób.
W ALS TDI opracowano protokół, który pozwala na wiarygodną ocenę funkcji nerwowo-mięśniowej myszy SOD1-G93A średnio w czasie krótszym niż 30 sekund na mysz. Protokół ten obejmuje codzienną ocenę funkcji kończyn tylnych przy użyciu prostego systemu punktacji neurologicznej (NeuroScore), który został opisany w niniejszym raporcie w prasie i na wideo. NeuroScore koncentruje się na funkcji kończyn tylnych, ponieważ deficyty kończyn tylnych są najwcześniejszym zgłaszanym neurologicznym objawem choroby u myszy SOD1-G93A 5,6. Co więcej, protokół opracowany przez ALS TDI zapewnia bezstronną ocenę wystąpienia niedowładu (lekkiego lub częściowego paraliżu), progresji i ciężkości paraliżu i jest wystarczająco czuły, aby zidentyfikować zmiany w progresji choroby wywołane przez leki.

<table><tbody><tr><td>Szczep B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur</td><td>Laboratorium Jacksona, Bar Harbor, ME</td><td>002726</td><td>Szczep myszy wykorzystany w tym badaniu</td></tr><tr><td>Breeders</td><td>Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA</td><td></td><td>Utrzymanie kolonii</td></tr><tr><td></td><td>Scale Navigator OHAUS, Parsippany, NJ</td><td>Model N14120</td><td>Służy do ważenia myszy</td></tr><tr><td>Nutra-GelH</td><td>Bio-Serv, Flemington, NJ</td><td></td>#S4798 <td>Karma mokra dostarczane chorym myszom</td></tr><tr><td>Napromieniowana dieta dla zwierząt laboratoryjnych</td><td>Harlan, Indianapolis, IN</td><td>2918-111914M</td><td>Dieta Chow</td></tr><tr><td>Lab-grade Sani-chips</td><td>Harlan Teklad, Indianapolis, IN</td><td>7090</td><td>Pościel</td></tr><tr><td>JMPH&nbsp;</td><td>SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, Karolina Północna</td><td>&nbsp; v10.0.2</td><td>Oprogramowanie statystyczne</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA</td><td>Excel 2013 (v 15.0)</td><td>Oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad software Inc., La Jolla, CA</td><td>v5.4</td><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów</td></tr><tr><td>Mouse Huts</td><td>Bio-Serv, Flemington, NJ</td><td>K3272</td><td>Do wzbogacania środowiska</td></tr></tbody></table>

szybki fenotypowy system punktacji neurologicznej do oceny postępu choroby w mysim modelu sod1-g93a als

A Quick Phenotypic Neurological Scoring System for Evaluating Disease Progression in the SOD1-G93A Mouse Model of ALS

Transgeniczna mysz SOD1-G93A jest najczęściej używanym zwierzęcym modelem stwardnienia zanikowego bocznego (ALS). W ALS TDI opracowaliśmy fenotypowy protokół przesiewowy, zademonstrowany na filmie wideo, który wiarygodnie ocenia funkcję nerwowo-mięśniową myszy SOD1-G93A w szybki sposób. Protokół ten obejmuje prosty neurologiczny system punktacji (NeuroScore) przeznaczony do oceny funkcji kończyn tylnych. NeuroScore koncentruje się na funkcji kończyn tylnych, ponieważ deficyty kończyn tylnych są najwcześniejszym zgłaszanym neurologicznym objawem choroby u myszy SOD1-G93A. Protokół opracowany przez ALS TDI zapewnia bezstronną ocenę wystąpienia niedowładu (lekkiego lub częściowego paraliżu), progresji i ciężkości paraliżu i jest wystarczająco czuły, aby zidentyfikować zmiany w progresji choroby wywołane przez leki. W tym raporcie połączenie szczegółowego manuskryptu z filmem minimalizuje niejasności punktacji i zmienność między eksperymentatorami, umożliwiając w ten sposób przyjęcie protokołu przez inne laboratoria i umożliwiając porównania między badaniami odbywającymi się w różnych warunkach. Wierzymy, że ten protokół wideo może służyć jako doskonałe narzędzie szkoleniowe dla obecnych i przyszłych badaczy ALS.

Oceniono dane dotyczące wyników neurologicznych (NS) dla 90 samców i 94 samic nieleczonych myszy SOD1-G93A badanych w ALS TDI w 2014 roku. Wyniki wskazują, że u samców zazwyczaj przebieg choroby jest bardziej agresywny niż u samic, co potwierdza większy udział czasu spędzonego w stadium NS 1 w całkowitym czasie życia w porównaniu do samic. Stadia NS 2 i NS 3 występują z niemal taką samą częstotliwością u obu płci. NS 0 został wykluczony z analizy, ponieważ jest uznawany za fenotyp „normalny”. Wykluczono również NS 4, pon...

Ten protokół wideo opisuje czułą, niezawodną i szybką metodę oceny deficytów nerwowo-mięśniowych w transgenicznym mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego.

Szybki fenotypowy system punktacji neurologicznej do oceny postępu choroby w mysim modelu SOD1-G93A ALS

The SOD1-G93A transgenic mouse is the most widely used animal model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). At ALS TDI we developed a phenotypic screening ...

Ogólnym celem tej procedury jest szybka i wiarygodna ocena funkcji nerwowo-mięśniowych myszy SOD1-G93A poprzez codzienną ocenę funkcji kończyn tylnych z wykorzystaniem prostego fenotypowego systemu oceny neurologicznej. Jest to realizowane najpierw poprzez obserwację kończyn tylnych myszy podczas ich zawieszenia za ogon. Drugim krokiem jest umożliwienie myszom chodzenia przy jednoczesnej obserwacji ich chodu.Następnie myszy kładzie się na boku, aby sprawdzić obecność lub brak odruchu pisania. Ostatnim krokiem jest analiza danych poprzez dopasowanie wyników oceny neurologicznej kohort myszy do modelu porządkowanej regresji logistycznej. Ostatecznie nasz system fenotypowej oceny neurologicznej jest wykorzystywany do oceny progresji choroby w modelu mysim ALS, SOD1-G93A, w celu określenia skuteczności interwencji terapeutycznych.Główną zaletą tej metody w porównaniu do wszystkich innych istniejących technik jest to, że jest ona szybka, prosta, niezawodna i minimalizuje stres u myszy. Zastosowanie tej metody rozciąga się na terapię stwardnienia bocznego zanikowego (ALS), ponieważ pozwala ona na szybką ocenę interwencji terapeutycznych w najczęściej stosowanym modelu mysim tej choroby. Demonstracja wizualna jest kluczowa, ponieważ metoda oceny neurologicznej jest trudna do opanowania ze względu na subtelność różnic neurologicznych.Zacznij od zakwaterowania samców myszy SOD1 G93A w taki sposób, aby w jednej klatce znajdowała się jedna mysz; samice myszy SOD1 G93A można kwaterować do dwóch osobników na klatkę. Zapewnij myszom wzbogacenie środowiskowe w postaci plastikowych domków. Dostarczaj myszom pokarm i wodę ad libitum.Mierz masę ciała wszystkich myszy i prowadź badania w tym samym czasie. Codzienna masa ciała jest czułym wskaźnikiem progresji choroby oraz wszelkich dolegliwości, które mogą wynikać z przewlekłego leczenia farmakologicznego. W trakcie badania codziennie oceniaj wynik neurologiczny każdej myszy za pomocą zestawu trzech testów wykonywanych sekwencyjnie.Należy uważnie obserwować, ponieważ określanie wyników w punktach przejścia fenotypowego jest bardzo trudne w pierwszym teście. W teście zawieszenia ogona należy trzymać mysz w odległości około 1,5 cala od nasady ogona nad drucianym wierzchem klatki domowej. Obserwuj funkcję kończyn tylnych przez okres od jednej do dwóch sekund i powtórz test trzy razy.W celu przeprowadzenia testu chodu należy umieścić mysz na czystej powierzchni zapewniającej odpowiednią przyczepność, z dystansem do przejścia wynoszącym co najmniej 25 centymetrów. Pozostawić mysz, aby przeszła dystans do 75 centymetrów, obserwując jej chód.W celu wykonania testu odruchu prostowania, ułóż mysz na boku i za pomocą stopera zmierz czas potrzebny na samodzielne wyprostowanie się zwierzęcia z obu stron. Wymagana jest tylko jedna próba tego testu. Oceń każdą kończynę tylną, lewą lub prawą, niezależnie w skali od zera do czterech, na podstawie zbiorczego wyniku trzech testów obserwacji fenotypowej.Wynik dla zatok równy zero oznacza, że mysz jest w fazie przedsymptomatycznej. W teście zawieszenia kończyny tylne są w pełni wyciągnięte od strony bocznej linii środkowej i pozostają w tej pozycji przez dwie sekundy lub dłużej. Ponadto, podczas testu chodu obserwuje się prawidłowy sposób poruszania się.Przypisz wynik jeden, wskazujący na pojawienie się pierwszych objawów. Ma to miejsce, gdy podczas testu zawieszenia kończyna tylna opada w stronę linii bocznej, opada częściowo w stronę linii bocznej, drży lub jest w inny sposób nienaturalnie rozstawiona. Poza wspomnianymi objawami testu zawieszenia, chód myszy, która powinna otrzymać wynik jeden, nadal powinien wydawać się normalny lub być nieco obniżony.Przypisz wynik dwa, wskazujący na początek objawów Parsis, jeśli podczas testu zawieszenia kończyna tylna opada częściowo lub całkowicie, a dodatkowo podczas testu chodzenia kończyny tylne są wykorzystywane do ruchu do przodu. Wynik dwa przyznaje się jednak wtedy, gdy palce u nóg zwijają się w dół co najmniej dwukrotnie podczas przejścia dystansu 75 centymetrów lub gdy jakakolwiek część stopy szura po podłożu.Mysz musi być również w stanie samodzielnie wyprostować się po ułożeniu na obu bokach w ciągu 10 sekund. Wynik trzech w skali sinus oznacza paraliż. Jeśli podczas testu zawieszenia mysz wykazuje sztywny paraliż kończyn tylnych lub minimalny zakres ruchu w stawach, może ona nadal poruszać się do przodu podczas testu chodzenia, jednak nie przy użyciu kończyn tylnych.Oprócz wyniku trzech punktów w skali zatokowej, mysz musi być w stanie samodzielnie obrócić się po położeniu na obu bokach w ciągu 10 sekund. Ostatecznie, wynik czterech punktów definiuje humanitarny punkt końcowy w przypadku, gdy mysz wykazuje sztywny paraliż podczas zawieszenia. Test wykazuje brak ruchu do przodu podczas próby chodzenia kończynami tylnymi, a zwierzę nie jest również w stanie obrócić się w ciągu 10 sekund po położeniu na którymkolwiek z boków.Samce myszy zazwyczaj wykazują bardziej agresywny przebieg choroby niż samice, co potwierdza większy odsetek czasu trwania ich życia z objawami klasyfikowanymi jako ocena neurologiczna jeden w porównaniu z samicami. W miarę nasilenia się objawów do zakresu oceny neurologicznej dwa lub trzy, liczba dni spędzonych przy każdym z tych wyników jest taka sama dla obu płci. Przedstawiono tutaj analizę logistyczną porządkową, czyli wykresy analizy statystycznej wygenerowane przy użyciu opisanego przed chwilą protokołu neuroco.Dane te pochodzą z badania farmakologicznego nad skutecznością leku, w którym grupa myszy SOD1-G93A otrzymujących badany związek TDI-173 została porównana z grupą myszy otrzymujących nośnik. Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic przy oddzielnej analizie płci, jednak istotność statystyczną osiągnięto po połączeniu obu płci. Mimo wykazania podobnych tendencji, analiza przeżywalności metodą Kaplana-Meiera nie była wystarczająco czuła, aby ujawnić istotne różnice, nawet po połączeniu płci.Po opanowaniu techniki, system oceny można zastosować w czasie krótszym niż minuta na jedną mysz, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak oceniać postęp choroby w modelu mysim ALS SOD1-G93 przy użyciu systemu Neuroco.

a-quick-phenotypic-neurological-scoring-system-for-evaluating-disease

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy protokół szybkiej i czułej kwantyfikacji stopnia nasilenia choroby w mysich modelach ataksji móżdżkowej. Pomiary obejmują kleszczenie kończyn tylnych, test krawędzi, chód oraz kifozę. Protokół ten skutecznie rozróżnia osobniki dotknięte chorobą od osobników zdrowych i pozwala wykryć postęp choroby u osobników dotkniętych w czasie.

Prosty system punktacji złożonego fenotypu do oceny modeli mysich ataksji móżdżkowej

Model mysi stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) poddano badaniu klinicznemu i behawioralnemu. Jako warunek wstępny dla towarzyszącej analizy immunohistologicznej szczegółowo przedstawiono przygotowanie rdzenia kręgowego.

Badania kliniczne i usuwanie rdzenia kręgowego w modelu mysim stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)

Zoptymalizowany protokół testowy jest przedstawiony w tym artykule dla testu wydajności Rotarod, używanego do pomiaru postępującej niepełnosprawności neurologicznej u myszy zakażonych TMEV.

Pomiar postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu stwardnienia rozsianego

Opisane tutaj jest etapowe, behawioralne podejście przesiewowe, które może być użyte do badania przesiewowego pod kątem związków wykazujących skuteczność in vivo na poznawcze i funkcjonalne zachowania motoryczne w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii. Metody te są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych związków pod kątem aktywności w zadaniach pamięci krótkotrwałej i roboczej.

Ocena spontanicznej przemiany, rozpoznawania nowych obiektów i zaciskania kończyn w transgenicznych mysich modelach β amyloidu i neuropatologii tau

Ten artykuł przedstawia metodę wielokrotnych pomiarów wentylacji i aktywności mięśni oddechowych w swobodnie zachowującym się modelu myszy ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) podczas postępu choroby za pomocą pletyzmografii całego ciała i elektromiografii za pomocą wszczepionego urządzenia telemetrycznego.

Wielokrotne pomiary aktywności mięśni oddechowych i wentylacji w mysich modelach choroby nerwowo-mięśniowej

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

Ten artykuł przedstawia protokół realizacji wysoce translacyjnej i niezależnie sprawdzonej koncepcji mysiej jednostki uderzenia (mSU) u myszy o dużym skoku. Zapewnia również ustandaryzowany protokół wykonywania ogniskowej eksperymentalnej skali udaru u myszy, która ocenia deficyty ogniskowe udaru wykryte nawet długotrwale.

Protokół jednostki udaru myszy ze standaryzowaną punktacją neurologiczną do translacyjnych badań udarów myszy

Niniejszy artykuł opisuje metody podawania wewnątrz OUN dla terapii ukierunkowanych na OUN u dorosłych myszy, ze szczególnym uwzględnieniem precyzji protokołu i umożliwienia powtarzanych wstrzykiwań. Zawiera wyniki badania walidacyjnego, w którym oligonukleotydy antysensowne zmniejszały ekspresję mutantnego SOD1 u modelowych myszy SOD1-ALS, co potwierdza przydatność tego podejścia w przedklinicznych badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

Intrathekalne wstrzykiwanie SOD1-ASO do lędźwia w celu precyzyjnego celowania i predykcyjnej skuteczności ośrodkowej układu nerwowego (CNS) u ludzkich myszy SOD1-G93A ALS

Poznaj szybką metodę oceny funkcji neuromuskularnej w mysim modelu ALS SOD1-G93A. System punktacji neurologicznej umożliwia niezawodną ocenę postępu choroby i skuteczności terapii.

Szybki fenotypowy system punktacji neurologicznej do oceny postępu choroby w mysim modelu SOD1-G93A ALS

Przeglądaj więcej filmów