Wyciszanie genów za pomocą Morpholinos
Wyciszanie genów za pośrednictwem morfoliny jest powszechną techniką stosowaną do badania ról określonych genów podczas rozwoju. Morfolinos hamują eks…
Techniki wyciszania genów są powszechnie stosowane w dziedzinie biologii rozwoju. Metody knockdown oparte na morfolinie rutynowo pozwalają naukowcom zarówno zidentyfikować, jak i scharakteryzować geny zaangażowane w ważne procesy komórkowe. Morfoliny antysensowne są obecnie bardzo popularne w wielu systemach modelowych, w tym u myszy, piskląt i danio pręgowanego, ze względu na ich wysoką skuteczność, wysoką specyficzność i niski koszt.
Ten film zawiera przegląd mechanizmów morfolino i strategii mikroiniekcji, kluczowych kontroli eksperymentalnych oraz tego, jak morfoliny są obecnie wykorzystywane w laboratoriach do badania rozwoju kręgowców.
Morfolinosy zostały po raz pierwszy opracowane jako sposób na hamowanie translacji transkryptów RNA w żywych komórkach i organizmach. Ogólnie rzecz biorąc, morfoliny to syntetyczne cząsteczki składające się z 25 oligonukleotydów połączonych neutralnie naładowanym szkieletem.
Ale chociaż morfoliny mogą wyglądać bardzo podobnie do DNA, zawierają pierścienie morfoliny w miejsce grup cukrowych znajdujących się w szkielecie cukru fosforanowego. Ta prosta konwersja zwiększa stabilność morfoliny w komórkach i obniża koszty ich produkcji.
Wewnątrz komórek morfoliny są ukierunkowane na interesujący RNA poprzez komplementarne parowanie zasad. Lokalizacja na RNA, w której morfolino hybrydyzuje się, określa jego specyficzny mechanizm działania.
Morfolinos blokujące splicing wiążą się ze specyficznymi połączeniami i hamują prawidłowe przetwarzanie transkryptu, podczas gdy morfoliny blokujące translację wiążą się w nieulegającym translacji regionie genu 5' w pobliżu miejsca rozpoczęcia translacji i zapobiegają składaniu rybosomów. Oba typy morfolinos zmniejszają ekspresję funkcjonalnych białek docelowych.
Planując eksperyment z użyciem morfolinosów, należy pamiętać o kilku ważnych kwestiach. Morfolinosy mogą być stosowane w kilku systemach modelowych, dlatego ważne jest, aby wybrać model, który jest w stanie odpowiedzieć na dane pytanie biologiczne.
Morfoliny są syntetyzowane komercyjnie, a profesjonalna pomoc projektowa jest dostępna bezpłatnie dla badaczy, ale ponieważ są one specyficzne dla sekwencji, informacje o genach dla wszystkich określonych celów morfolina powinny być pozyskiwane przed projektem.
W systemie modelowym danio pręgowanego często występują dwie kopie pojedynczych genów u innych kręgowców, ze względu na zdarzenie duplikacji całego genomu, które miało miejsce u ewolucyjnego przodka danio pręgowanego. W związku z tym knockdown obu genów danio pręgowanego może być konieczny do skutecznego modelowania niedoborów białka w rozwoju człowieka.
Projektowanie dobrych kontroli eksperymentalnych jest tak samo ważne, jak projektowanie docelowych morfolinów. Każdy morfolino może wiązać się z określonymi sekwencjami na różnych genach. Zaleca się stosowanie niezależnych, nienakładających się morfolinos komplementarnych do tego samego genu, aby upewnić się, że obserwowana zmiana fenotypowa jest spowodowana knockdownem genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Teraz, gdy zajęliśmy się eksperymentalnym projektem morfolina, przyjrzyjmy się, w jaki sposób morpholino są wprowadzane do danio pręgowanego.
Tutaj opiszemy mikroiniekcję morfoliny do danio pręgowanego. Aby uzyskać więcej informacji i instrukcji na temat szczegółów mikroiniekcji, zapoznaj się z filmem JoVE Science Education zatytułowanym "Techniki mikroiniekcji danio pręgowanego".
Morfoliny są zwykle wstrzykiwane do zarodków danio pręgowanego między stadium jedno- i czterokomórkowym, do żółtka lub cytoplazmy komórki. Połączenia cytoplazmatyczne między komórkami embrionalnymi pozwalają na szybką dyfuzję i wszechobecne dostarczanie rozpuszczalnych w wodzie morfolinosów w całym organizmie. Morfoliny są stabilne w komórkach, ponieważ zarodek danio pręgowanego jest hodowany w temperaturze 28,5°C.
Optymalne stężenia i objętości iniekcji muszą być empirycznie przetestowane dla każdego morfolino. Zazwyczaj najniższą dawkę, przy której istnieje określony wiarygodny fenotyp u co najmniej 50-75% wstrzykniętych zarodków, stosuje się w celu uniknięcia śmiertelności zarodków lub niepożądanych skutków ubocznych.
Większość fenotypów danio pręgowanego morpholino jest identyfikowana w ciągu pierwszych trzech dni po zapłodnieniu, a wyciszanie genów jest na ogół skuteczne do piątego dnia. W przypadku morfinów blokujących splicing, RT-PCR może być stosowany do identyfikacji względnych ilości natywnych i zmienionych transkryptów. W przypadku morfinów blokujących translację poziomy knockdownu genu można ocenić za pomocą Western blot.
Szybki rozwój zewnętrzny i przezroczystość zarodków danio pręgowanego pozwala na łatwą obserwację wielu wczesnych procesów biologicznych. Fenotypy morfolino można zwykle oceniać, analizując morfologię za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii fluorescencyjnej, a także oceniając zachowanie.
Po zdefiniowaniu fenotypu morfoliny można przeprowadzić ratowanie RNA w celu wykazania swoistości docelowej. Po knockuście endogennego mRNA morfolino wstrzykuje się syntetyczne mRNA, które koduje to samo białko, ale nie zawiera docelowej sekwencji morfolino. Jeśli to wstrzyknięte RNA jest w stanie przywrócić fenotyp dzikiego organizmu, możemy wywnioskować, że obserwowany fenotyp morfoliny jest spowodowany powaleniem docelowego genu.
Teraz, gdy już wiesz, czym są morfoliny i jak można przeprowadzać kontrolowane eksperymenty z morfolinem, przyjrzyjmy się, jak morfoliny są obecnie stosowane w laboratoriach biologicznych.
W biologii komórki morfoliny są wykorzystywane do zrozumienia wczesnych procesów rozwojowych. Przepływ płynu generowany przez rzęski w pęcherzyku Kupffera jest jednym z przykładów, który kontroluje wzorzec lewo-prawo u danio pręgowanego. Przepływ płynu przebiega w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara w zarodkach, którym wstrzyknięto kontrolnie, podczas gdy wyciszenie genu regulującego organizację komórek rzęskowych zakłóca prędkość i kierunek płynu.
Morfolinosy doskonale nadają się również do szybkiego i niezawodnego modelowania chorób genetycznych człowieka. Fenotypy utraty funkcji można łatwo odtworzyć, manipulując ekspresją białek, jak widać w modelu ludzkiej dysplazji danio pręgowanego, wykazującym torbiele nerek, obrzęk osierdzia i zwinięty ogon. Ponadto mutacje chorobotwórcze można szybko oznaczyć in vivo, wykorzystując mRNA typu dzikiego lub zmutowanego do ratowania fenotypów choroby morfolino.
Ponieważ morfoliny mogą być wprowadzane do żywych komórek na różne sposoby, są wysoko cenione w badaniach nad regeneracją i rozwojem narządów. Mikroiniekcja, a następnie elektryczna stymulacja morfolinosów do określonych tkanek pozwoliła naukowcom zbadać wzrost płetw i tworzenie siatkówki u dorosłych danio pręgowanych.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do wyciszania genów za pomocą morfolinosów. W tym filmie omówiliśmy strukturę i mechanizm działania morfolinosów, typowe zastosowania oraz ważne sposoby oceny skuteczności i efektów celowanego wyciszania genów. Ponieważ są łatwe do zaprojektowania, wysoce specyficzne i opłacalne, morfoliny pozostaną znaczącym graczem w dziedzinie genetyki odwrotnej, pomagając w funkcjonalnej analizie genów zaangażowanych w chorobę i rozwój. Dzięki za oglądanie!
Techniki wyciszania genów są powszechnie stosowane w dziedzinie biologii rozwoju. Metody knockdown oparte na morfolinie rutynowo pozwalają naukowcom zarówno zidentyfikować, jak i scharakteryzować geny zaangażowane w ważne procesy komórkowe. Morfoliny antysensowne są obecnie bardzo popularne w wielu systemach modelowych, w tym u myszy, piskląt i danio pręgowanego, ze względu na ich wysoką skuteczność, wysoką specyficzność i niski koszt.
Ten film zawiera przegląd mechanizmów morfolino i strategii mikroiniekcji, kluczowych kontroli eksperymentalnych oraz tego, jak morfoliny są obecnie wykorzystywane w laboratoriach do badania rozwoju kręgowców.
Morfolinosy zostały po raz pierwszy opracowane jako sposób na hamowanie translacji transkryptów RNA w żywych komórkach i organizmach. Ogólnie rzecz biorąc, morfoliny to syntetyczne cząsteczki składające się z 25 oligonukleotydów połączonych neutralnie naładowanym szkieletem.
Ale chociaż morfoliny mogą wyglądać bardzo podobnie do DNA, zawierają pierścienie morfoliny w miejsce grup cukrowych znajdujących się w szkielecie cukru fosforanowego. Ta prosta konwersja zwiększa stabilność morfoliny w komórkach i obniża koszty ich produkcji.
Wewnątrz komórek morfoliny są ukierunkowane na interesujący RNA poprzez komplementarne parowanie zasad. Lokalizacja na RNA, w której morfolino hybrydyzuje się, określa jego specyficzny mechanizm działania.
Morfolinos blokujące splicing wiążą się ze specyficznymi połączeniami i hamują prawidłowe przetwarzanie transkryptu, podczas gdy morfoliny blokujące translację wiążą się w nieulegającym translacji regionie genu 5' w pobliżu miejsca rozpoczęcia translacji i zapobiegają składaniu rybosomów. Oba typy morfolinos zmniejszają ekspresję funkcjonalnych białek docelowych.
Planując eksperyment z użyciem morfolinosów, należy pamiętać o kilku ważnych kwestiach. Morfolinosy mogą być stosowane w kilku systemach modelowych, dlatego ważne jest, aby wybrać model, który jest w stanie odpowiedzieć na dane pytanie biologiczne.
Morfoliny są syntetyzowane komercyjnie, a profesjonalna pomoc projektowa jest dostępna bezpłatnie dla badaczy, ale ponieważ są one specyficzne dla sekwencji, informacje o genach dla wszystkich określonych celów morfolina powinny być pozyskiwane przed projektem.
W systemie modelowym danio pręgowanego często występują dwie kopie pojedynczych genów u innych kręgowców, ze względu na zdarzenie duplikacji całego genomu, które miało miejsce u ewolucyjnego przodka danio pręgowanego. W związku z tym knockdown obu genów danio pręgowanego może być konieczny do skutecznego modelowania niedoborów białka w rozwoju człowieka.
Projektowanie dobrych kontroli eksperymentalnych jest tak samo ważne, jak projektowanie docelowych morfolinów. Każdy morfolino może wiązać się z określonymi sekwencjami na różnych genach. Zaleca się stosowanie niezależnych, nienakładających się morfolinos komplementarnych do tego samego genu, aby upewnić się, że obserwowana zmiana fenotypowa jest spowodowana knockdownem genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Teraz, gdy zajęliśmy się eksperymentalnym projektem morfolina, przyjrzyjmy się, w jaki sposób morpholino są wprowadzane do danio pręgowanego.
Tutaj opiszemy mikroiniekcję morfoliny do danio pręgowanego. Aby uzyskać więcej informacji i instrukcji na temat szczegółów mikroiniekcji, zapoznaj się z filmem JoVE Science Education zatytułowanym "Techniki mikroiniekcji danio pręgowanego".
Morfoliny są zwykle wstrzykiwane do zarodków danio pręgowanego między stadium jedno- i czterokomórkowym, do żółtka lub cytoplazmy komórki. Połączenia cytoplazmatyczne między komórkami embrionalnymi pozwalają na szybką dyfuzję i wszechobecne dostarczanie rozpuszczalnych w wodzie morfolinosów w całym organizmie. Morfoliny są stabilne w komórkach, ponieważ zarodek danio pręgowanego jest hodowany w temperaturze 28,5°C.
Optymalne stężenia i objętości iniekcji muszą być empirycznie przetestowane dla każdego morfolino. Zazwyczaj najniższą dawkę, przy której istnieje określony wiarygodny fenotyp u co najmniej 50-75% wstrzykniętych zarodków, stosuje się w celu uniknięcia śmiertelności zarodków lub niepożądanych skutków ubocznych.
Większość fenotypów danio pręgowanego morpholino jest identyfikowana w ciągu pierwszych trzech dni po zapłodnieniu, a wyciszanie genów jest na ogół skuteczne do piątego dnia. W przypadku morfinów blokujących splicing, RT-PCR może być stosowany do identyfikacji względnych ilości natywnych i zmienionych transkryptów. W przypadku morfinów blokujących translację poziomy knockdownu genu można ocenić za pomocą Western blot.
Szybki rozwój zewnętrzny i przezroczystość zarodków danio pręgowanego pozwala na łatwą obserwację wielu wczesnych procesów biologicznych. Fenotypy morfolino można zwykle oceniać, analizując morfologię za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii fluorescencyjnej, a także oceniając zachowanie.
Po zdefiniowaniu fenotypu morfoliny można przeprowadzić ratowanie RNA w celu wykazania swoistości docelowej. Po knockuście endogennego mRNA morfolino wstrzykuje się syntetyczne mRNA, które koduje to samo białko, ale nie zawiera docelowej sekwencji morfolino. Jeśli to wstrzyknięte RNA jest w stanie przywrócić fenotyp dzikiego organizmu, możemy wywnioskować, że obserwowany fenotyp morfoliny jest spowodowany powaleniem docelowego genu.
Teraz, gdy już wiesz, czym są morfoliny i jak można przeprowadzać kontrolowane eksperymenty z morfolinem, przyjrzyjmy się, jak morfoliny są obecnie stosowane w laboratoriach biologicznych.
W biologii komórki morfoliny są wykorzystywane do zrozumienia wczesnych procesów rozwojowych. Przepływ płynu generowany przez rzęski w pęcherzyku Kupffera jest jednym z przykładów, który kontroluje wzorzec lewo-prawo u danio pręgowanego. Przepływ płynu przebiega w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara w zarodkach, którym wstrzyknięto kontrolnie, podczas gdy wyciszenie genu regulującego organizację komórek rzęskowych zakłóca prędkość i kierunek płynu.
Morfolinosy doskonale nadają się również do szybkiego i niezawodnego modelowania chorób genetycznych człowieka. Fenotypy utraty funkcji można łatwo odtworzyć, manipulując ekspresją białek, jak widać w modelu ludzkiej dysplazji danio pręgowanego, wykazującym torbiele nerek, obrzęk osierdzia i zwinięty ogon. Ponadto mutacje chorobotwórcze można szybko oznaczyć in vivo, wykorzystując mRNA typu dzikiego lub zmutowanego do ratowania fenotypów choroby morfolino.
Ponieważ morfoliny mogą być wprowadzane do żywych komórek na różne sposoby, są wysoko cenione w badaniach nad regeneracją i rozwojem narządów. Mikroiniekcja, a następnie elektryczna stymulacja morfolinosów do określonych tkanek pozwoliła naukowcom zbadać wzrost płetw i tworzenie siatkówki u dorosłych danio pręgowanych.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do wyciszania genów za pomocą morfolinosów. W tym filmie omówiliśmy strukturę i mechanizm działania morfolinosów, typowe zastosowania oraz ważne sposoby oceny skuteczności i efektów celowanego wyciszania genów. Ponieważ są łatwe do zaprojektowania, wysoce specyficzne i opłacalne, morfoliny pozostaną znaczącym graczem w dziedzinie genetyki odwrotnej, pomagając w funkcjonalnej analizie genów zaangażowanych w chorobę i rozwój. Dzięki za oglądanie!
Q1: What are morpholinos and how do they differ from DNA?
Morpholinos are synthetic molecules made up of 25 oligonucleotides connected by a neutrally charged backbone. Unlike DNA, morpholinos contain morpholine rings in place of sugar groups found in the phosphate sugar backbone. This structural difference increases morpholino stability in cells and lowers their production cost, making them cost-effective tools for gene silencing in developmental research.
Q2: How do splice-blocking and translation-blocking morpholinos work differently?
Splice-blocking morpholinos bind to specific junctions and inhibit proper transcript processing, while translation-blocking morpholinos bind within the 5' untranslated region near the translational start site and prevent ribosome assembly. Both types reduce expression of functional target proteins, but they achieve gene silencing through distinct molecular mechanisms targeting different stages of gene expression.
Q3: Why is using independent morpholinos important for experimental design?
Independent, non-overlapping morpholinos complementary to the same gene ensure that observed phenotypic changes are due to knockdown of your target gene, not off-target effects. Since any given morpholino can bind to specific sequences on different genes, using multiple morpholinos confirms specificity and strengthens the validity of your developmental genetics techniques and applications.
Q4: When and where are morpholinos typically injected into zebrafish embryos?
Morpholinos are typically injected into zebrafish embryos between the one- and four-cell stage, into the yolk or cell cytoplasm. Cytoplasmic connections between embryonic cells allow for rapid diffusion and ubiquitous delivery of water-soluble morpholinos throughout the organism. The lowest dose producing a defined reliable phenotype in 50-75% of injected embryos is used to avoid lethality or unwanted off-target effects.
Q5: How is RNA rescue used to confirm morpholino target specificity?
Following morpholino knockdown of endogenous mRNA, synthetic mRNA encoding the same protein but lacking the morpholino target sequence is injected. If this injected RNA restores the wild-type phenotype, the observed morpholino phenotype is specifically due to target gene knockdown. This validation step confirms that the gene silencing effect is genuine and not caused by off-target interactions.
Q6: What are practical applications of morpholinos in studying vertebrate development?
Morpholinos are used to study early developmental processes like cilia-generated fluid flow in Kupffer's vesicle, which controls left-right patterning in zebrafish. They also model human genetic diseases by reproducing loss-of-function phenotypes and rapidly assaying pathogenic mutations. Additionally, microinjection of morpholinos into specific tissues enables researchers to study tissue regeneration with somatic stem cells and organ formation in adult zebrafish.
Q7: Why are zebrafish particularly suitable for morpholino-based gene silencing studies?
Zebrafish are ideal for morpholino research due to their rapid external development, transparency, and ease of observation using brightfield or fluorescence microscopy. Morpholino phenotypes are typically identified within the first three days post-fertilization and remain effective through day five. Additionally, zebrafish often have two gene copies from a whole-genome duplication event, requiring knockdown of both genes to model human protein deficiencies.