Wyciszanie genów za pomocą Morpholinos

Techniki wyciszania genów są powszechnie stosowane w dziedzinie biologii rozwoju. Metody knockdown oparte na morfolinie rutynowo pozwalają naukowcom zarówno zidentyfikować, jak i scharakteryzować geny zaangażowane w ważne procesy komórkowe. Morfoliny antysensowne są obecnie bardzo popularne w wielu systemach modelowych, w tym u myszy, piskląt i danio pręgowanego, ze względu na ich wysoką skuteczność, wysoką specyficzność i niski koszt.

Ten film zawiera przegląd mechanizmów morfolino i strategii mikroiniekcji, kluczowych kontroli eksperymentalnych oraz tego, jak morfoliny są obecnie wykorzystywane w laboratoriach do badania rozwoju kręgowców.

Morfolinosy zostały po raz pierwszy opracowane jako sposób na hamowanie translacji transkryptów RNA w żywych komórkach i organizmach. Ogólnie rzecz biorąc, morfoliny to syntetyczne cząsteczki składające się z 25 oligonukleotydów połączonych neutralnie naładowanym szkieletem.

Ale chociaż morfoliny mogą wyglądać bardzo podobnie do DNA, zawierają pierścienie morfoliny w miejsce grup cukrowych znajdujących się w szkielecie cukru fosforanowego. Ta prosta konwersja zwiększa stabilność morfoliny w komórkach i obniża koszty ich produkcji.

Wewnątrz komórek morfoliny są ukierunkowane na interesujący RNA poprzez komplementarne parowanie zasad. Lokalizacja na RNA, w której morfolino hybrydyzuje się, określa jego specyficzny mechanizm działania.

Morfolinos blokujące splicing wiążą się ze specyficznymi połączeniami i hamują prawidłowe przetwarzanie transkryptu, podczas gdy morfoliny blokujące translację wiążą się w nieulegającym translacji regionie genu 5' w pobliżu miejsca rozpoczęcia translacji i zapobiegają składaniu rybosomów. Oba typy morfolinos zmniejszają ekspresję funkcjonalnych białek docelowych.

Planując eksperyment z użyciem morfolinosów, należy pamiętać o kilku ważnych kwestiach. Morfolinosy mogą być stosowane w kilku systemach modelowych, dlatego ważne jest, aby wybrać model, który jest w stanie odpowiedzieć na dane pytanie biologiczne.

Morfoliny są syntetyzowane komercyjnie, a profesjonalna pomoc projektowa jest dostępna bezpłatnie dla badaczy, ale ponieważ są one specyficzne dla sekwencji, informacje o genach dla wszystkich określonych celów morfolina powinny być pozyskiwane przed projektem.

W systemie modelowym danio pręgowanego często występują dwie kopie pojedynczych genów u innych kręgowców, ze względu na zdarzenie duplikacji całego genomu, które miało miejsce u ewolucyjnego przodka danio pręgowanego. W związku z tym knockdown obu genów danio pręgowanego może być konieczny do skutecznego modelowania niedoborów białka w rozwoju człowieka.

Projektowanie dobrych kontroli eksperymentalnych jest tak samo ważne, jak projektowanie docelowych morfolinów. Każdy morfolino może wiązać się z określonymi sekwencjami na różnych genach. Zaleca się stosowanie niezależnych, nienakładających się morfolinos komplementarnych do tego samego genu, aby upewnić się, że obserwowana zmiana fenotypowa jest spowodowana knockdownem genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Teraz, gdy zajęliśmy się eksperymentalnym projektem morfolina, przyjrzyjmy się, w jaki sposób morpholino są wprowadzane do danio pręgowanego.

Tutaj opiszemy mikroiniekcję morfoliny do danio pręgowanego. Aby uzyskać więcej informacji i instrukcji na temat szczegółów mikroiniekcji, zapoznaj się z filmem JoVE Science Education zatytułowanym "Techniki mikroiniekcji danio pręgowanego".

Morfoliny są zwykle wstrzykiwane do zarodków danio pręgowanego między stadium jedno- i czterokomórkowym, do żółtka lub cytoplazmy komórki. Połączenia cytoplazmatyczne między komórkami embrionalnymi pozwalają na szybką dyfuzję i wszechobecne dostarczanie rozpuszczalnych w wodzie morfolinosów w całym organizmie. Morfoliny są stabilne w komórkach, ponieważ zarodek danio pręgowanego jest hodowany w temperaturze 28,5°C.

Optymalne stężenia i objętości iniekcji muszą być empirycznie przetestowane dla każdego morfolino. Zazwyczaj najniższą dawkę, przy której istnieje określony wiarygodny fenotyp u co najmniej 50-75% wstrzykniętych zarodków, stosuje się w celu uniknięcia śmiertelności zarodków lub niepożądanych skutków ubocznych.

Większość fenotypów danio pręgowanego morpholino jest identyfikowana w ciągu pierwszych trzech dni po zapłodnieniu, a wyciszanie genów jest na ogół skuteczne do piątego dnia. W przypadku morfinów blokujących splicing, RT-PCR może być stosowany do identyfikacji względnych ilości natywnych i zmienionych transkryptów. W przypadku morfinów blokujących translację poziomy knockdownu genu można ocenić za pomocą Western blot.

Szybki rozwój zewnętrzny i przezroczystość zarodków danio pręgowanego pozwala na łatwą obserwację wielu wczesnych procesów biologicznych. Fenotypy morfolino można zwykle oceniać, analizując morfologię za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii fluorescencyjnej, a także oceniając zachowanie.

Po zdefiniowaniu fenotypu morfoliny można przeprowadzić ratowanie RNA w celu wykazania swoistości docelowej. Po knockuście endogennego mRNA morfolino wstrzykuje się syntetyczne mRNA, które koduje to samo białko, ale nie zawiera docelowej sekwencji morfolino. Jeśli to wstrzyknięte RNA jest w stanie przywrócić fenotyp dzikiego organizmu, możemy wywnioskować, że obserwowany fenotyp morfoliny jest spowodowany powaleniem docelowego genu.

Teraz, gdy już wiesz, czym są morfoliny i jak można przeprowadzać kontrolowane eksperymenty z morfolinem, przyjrzyjmy się, jak morfoliny są obecnie stosowane w laboratoriach biologicznych.

W biologii komórki morfoliny są wykorzystywane do zrozumienia wczesnych procesów rozwojowych. Przepływ płynu generowany przez rzęski w pęcherzyku Kupffera jest jednym z przykładów, który kontroluje wzorzec lewo-prawo u danio pręgowanego. Przepływ płynu przebiega w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara w zarodkach, którym wstrzyknięto kontrolnie, podczas gdy wyciszenie genu regulującego organizację komórek rzęskowych zakłóca prędkość i kierunek płynu.

Morfolinosy doskonale nadają się również do szybkiego i niezawodnego modelowania chorób genetycznych człowieka. Fenotypy utraty funkcji można łatwo odtworzyć, manipulując ekspresją białek, jak widać w modelu ludzkiej dysplazji danio pręgowanego, wykazującym torbiele nerek, obrzęk osierdzia i zwinięty ogon. Ponadto mutacje chorobotwórcze można szybko oznaczyć in vivo, wykorzystując mRNA typu dzikiego lub zmutowanego do ratowania fenotypów choroby morfolino.

Ponieważ morfoliny mogą być wprowadzane do żywych komórek na różne sposoby, są wysoko cenione w badaniach nad regeneracją i rozwojem narządów. Mikroiniekcja, a następnie elektryczna stymulacja morfolinosów do określonych tkanek pozwoliła naukowcom zbadać wzrost płetw i tworzenie siatkówki u dorosłych danio pręgowanych.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do wyciszania genów za pomocą morfolinosów. W tym filmie omówiliśmy strukturę i mechanizm działania morfolinosów, typowe zastosowania oraz ważne sposoby oceny skuteczności i efektów celowanego wyciszania genów. Ponieważ są łatwe do zaprojektowania, wysoce specyficzne i opłacalne, morfoliny pozostaną znaczącym graczem w dziedzinie genetyki odwrotnej, pomagając w funkcjonalnej analizie genów zaangażowanych w chorobę i rozwój. Dzięki za oglądanie!