Szybka i ilościowa metoda fluorymetryczna do badań przesiewowych leków małocząsteczkowych ukierunkowanych na białka

Ogólnym celem tej nowej fluorometrycznej metody przesiewowej leków jest określenie powinowactwa wiązania małych cząsteczek leków do białka docelowego poprzez tworzenie fluorescencyjnych nanogrup złota wewnątrz obciążonego lekiem szablonu białkowego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania leków ukierunkowanych na białka, takie jak wpływ siły wiązania cząsteczek leku na stabilność białek przed rozfałdowaniem, co prowadzi do powstania fluorescencyjnych nanogrup złota o różnych intensywnościach. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przekształcenia białka docelowego w fluorescencyjny biosensor, co umożliwia szybki przesiew małych cząsteczek leków bez konieczności stosowania zaawansowanych instrumentów i żmudnych etapów znakowania.

Połączenie mojej własnej wiedzy oraz odkryć współautorki wykazało, że załadowane białko wywiera wyraźny efekt stabilizujący na nanocząstki plazmoniczne, co zainspirowało pomysł zastosowania tej metody. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania odczynników chemicznych do przesiewu leków, zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować złote nanoklastry szablonowane albuminą ludzką (HSA), umieść dwie szklane fiolki, z których każda zawiera mikroimpregnowany magnetyczny mieszadło, na dwóch oddzielnych magnetycznych mieszadłach z regulacją temperatury.

Ustaw temperaturę jednego mieszadła magnetycznego na 60 °C. Następnie do każdej fiolki, przy stałym mieszaniu, dodaj 200 µL roztworu albuminy surowicy ludzkiej, 200 µL wody ultrapure oraz 200 µL roztworu chlorku złota, aby umożliwić enkapsulację jonów złota wewnątrz matrycy białkowej; po dwóch minutach dodaj do każdej fiolki 20 µL roztworu wodorotlenku sodu w celu aktywacji zdolności redukcyjnej albuminy surowicy ludzkiej, co doprowadzi do powstania nanoklastrów złota. Rozpocznij pomiar czasu reakcji od zera minut, dokonując odczytów co 20 minut.

Pobrać 50 µL każdej próbki i przenieść do czarnej płytki 384-dołkowej. Zmierzyć widmo emisji za pomocą czytnika płytek mikrotitracyjnych. Zatrzymać mieszanie magnetyczne po 100 minutach.

Schłodzić szklane fiolki pod bieżącą wodą w zlewie. Przez cały czas rejestrować widma emisji fotonów dla każdej próbki, aby uzyskać kinetykę tworzenia nanoklastrów złota w różnych warunkach temperaturowych. Aby przygotować nanoklastry złota z matrycą z albuminy surowicy bydlęcej lub BSA, umieścić szklaną fiolkę z mikro magnetycznym mieszadłem na mieszadle magnetycznym.

Utrzymaj temperaturę pokojową. W szklanej fiolce, przy ciągłym mieszaniu, połącz 200 µL roztworu BSA, 200 µL mocznika oraz 200 µL roztworu chlorku złota. Po dwóch minutach dodaj 20 µL roztworu wodorotlenku sodu.

Aby aktywować zdolność redukcyjną BSA w celu utworzenia złotych nanoklastrów, należy rozpocząć pomiar czasu reakcji od zera minut. Co godzinę należy mierzyć widmo fotoemisji mieszaniny reakcyjnej. Pięć szklanych fiolek, z których każda zawiera mieszadło magnetyczne i jest wcześniej oznakowana nazwą leku lub czystym HSA, należy umieścić na wielopunktowym mieszadle magnetycznym z kontrolą temperatury.

Dodaj 200 µL HSA do każdej fiolki. Następnie dodaj 1 µL każdego z wcześniej przygotowanych roztworów leków do czterech odpowiednich fiolek. Dodaj również 1 µL DMSO do próbki kontrolnej w mieszalniku.

Ustaw prędkość wirowania na 360 RPM i inkubuj przez jedną godzinę, aby umożliwić związanie leku z HSA. Godzinę później, przy ciągłym mieszaniu, dodaj do każdej probówki 200 µL wody Milli-Q oraz 200 µL roztworu chlorku złota. Ustaw temperaturę na 60 °C i mieszaj nieprzerwanie przez 10 minut. Po 10 minutach dodaj do każdej probówki 20 µL 1,5 M wodorotlenku sodu i rozpocznij pomiar czasu reakcji od stanu zero minut.

Roztwory reakcyjne do pomiarów powinny być przygotowywane zgodnie z tą samą kolejnością dodawania leków i w jak najkrótszym czasie, aby zminimalizować efekt opóźnienia czasowego. Należy szybko pobrać 50 µL roztworu z każdej fiolki. Przenieść je do czarnej płytki 384-dołkowej i zmierzyć widmo emisji. Rejestrować widma emisji każdej próbki co 10 minut, zbierając co najmniej cztery widma w czterech różnych odstępach czasu.

Powtórz te kroki kilkanaście razy, aby uzyskać wyniki o spójnym trendzie. Wykreśl widma fotoemisji rozdzielone w czasie dla każdej próbki. Wyznacz intensywność szczytową dla wszystkich próbek i przedstaw ją w funkcji czasu, aby porównać kinetykę tworzenia się nanoklastrów złota w różnych matrycach białkowych obciążonych lekami w celu zmierzenia stałej wiązania między każdym lekiem a HSA.

Zastąp roztwory leków roztworami ibuprofenu o czterech różnych stężeniach. Po 10 minutach schłodź szklane fiolki pod bieżącą wodą w zlewie. Pobierz 50 µL powyższych roztworów z każdej fiolki do czarnej płytki 384-dołkowej i zmierz widmo emisji.

Powtórz te kroki jeszcze dwukrotnie, aby uzyskać kolejne dwa zestawy wyników dla różnych stężeń leku, a następnie zatrzymaj mieszadło magnetyczne. Następnie wykreśl widma emisji fotonowej i przeanalizuj wyniki dla próbek surowych uzyskanych w każdej z poszczególnych partii. Wykreśl widma emisji fotonowej dla każdej próbki w oprogramowaniu takim jak Origin Pro i wyznacz intensywność piku.

Oblicz i nanieś na wykres względną intensywność fluorescencji w funkcji stężenia leku. Następnie oblicz stałą wiązania, dopasowując dane do modelu wiązania w jednym miejscu. W tym celu wykorzystaj równanie Micsa-Cementina w programie takim jak Origin Pro.

Wybierz z menu analizy dopasowanie krzywej nieliniowej (non-linear curve fit), a następnie na stronie wyboru funkcji ustawień wybierz funkcję Hill z kategorii wzrostu sygmoidalnego (growth sigmoidal). Kliknij dopasuj (fit), aby wyświetlić wyniki. Przedstawione tutaj wyniki dopasowania są reprezentatywnymi wynikami czasowo rozdzielonych widm fotoemisji nanoklastrów złota wytworzonych w różnych warunkach denaturacji białek.

Można zaobserwować, że nanoklastry złota tworzą się szybciej w wyższej temperaturze. Warunki denaturacji mocznikiem mogą również ułatwiać bezpośrednią syntezę nanoklastrów złota z wykorzystaniem białka BSA jako matrycy. Tutaj przedstawiono typowe wyniki szybkiego fluorometrycznego przesiewania leków, opartego na intensywności fluorescencji nanoklastrów złota z wykorzystaniem HSA obciążonego lekiem jako matrycy.

Im wyższa intensywność fluorescencji, tym słabsza siła wiązania cząsteczki leku z HSA. Widma te pokazują wpływ stężenia wprowadzonego leku na szybkość tworzenia fluorescencyjnych nanoklastrów złota w HSA obciążonej ibuprofenem. Im wyższe stężenie leku, tym niższy sygnał fluorescencyjny otrzymanych nanoklastrów złota; przedstawiony tutaj wynik jest reprezentatywny dla procesu wyznaczania stałej wiązania leku z białkiem.

Oblicza się ją poprzez dopasowanie względnej intensywności fluorescencji nanoklastrów złota zsyntetyzowanych w matrycy HSA uprzednio obciążonej ibuprofenem w różnych stężeniach, z wykorzystaniem równania cementyn MICUs. Po opanowaniu technika ta może zostać przeprowadzona w 30 minut w celu równoległego przesiewania wielu leków, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat syntezy nanoklastrów złota w białku obciążonym lekiem oraz sposobu określania powinowactwa wiązania leków do białka docelowego na podstawie sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez otrzymane nanoklastry złota.