Szybka i ilościowa metoda fluorymetryczna do badań przesiewowych leków małocząsteczkowych ukierunkowanych na białka
16 października 2015
Przedstawiono protokół badań przesiewowych leków małocząsteczkowych oparty na syntezie in-situ ultramałych fluorescencyjnych nanoklastrów złota (Au NCs) przy użyciu białka obciążonego lekiem jako matrycy. Metoda ta jest prosta do określenia powinowactwa wiązania leków z białkiem docelowym za pomocą widzialnego sygnału fluorescencyjnego emitowanego z matrycami białkowymi Au NC.
Ogólnym celem tej nowej metody fluorometrycznych badań przesiewowych leków jest określenie powinowactwa wiązania małych cząsteczek leku z białkiem docelowym poprzez tworzenie fluorescencyjnych nanoklastrów złota w matrycy białkowej załadowanej lekiem. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wykrywania leków ukierunkowanych na białka, takie jak to, w jaki sposób siła cząsteczki leku może wpływać na stabilność białek przed rozwinięciem, prowadząc do tworzenia się fluorescencyjnych nanoklastrów złota o różnej intensywności. Główną zaletą tego teniksu jest to, że możemy przekształcić cel białkowy w bioczujnik fluorescencyjny, aby umożliwić szybkie badania przesiewowe leków małocząsteczkowych bez konieczności stosowania wyrafinowanego sprzętu i żmudnych etapów znakowania.
Połączenie mojej własnej wiedzy, a także jej współautorki, jej odkrycie, że białko jest naładowane, ma wyraźny efekt stabilizujący na plazmon. Nanocząstka zainspirowała pomysł na tę metodę. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania odczynników chemicznych do badań przesiewowych leków, jak wyszczególniono w protokole tekstowym, aby przygotować albuminę surowicy ludzkiej lub matrycowe nanoklastry złota HSA, umieść dwie szklane fiolki, z których każda zawiera mikromagnetyczny pręt mieszający, na dwóch oddzielnych mieszadłach magnetycznych o kontrolowanej temperaturze.
Ustaw temperaturę jednego mieszania magnetycznego na 60 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu albuminy surowicy ludzkiej, 200 mikrolitrów ultraczystej wody i 200 mikrolitrów roztworu chlorku złota do każdej fiolki pod ciągłym mieszaniem, aby umożliwić enkapsulację jonów złota wewnątrz matrycy białkowej, dwie minuty później dodaj 20 mikrolitrów roztworu wodorotlenku sodu do każdej fiolki, aby aktywować zdolność redukcyjną albuminy surowicy ludzkiej informującej o nanoklastrach złota. Zacznij rejestrować czas reakcji przy zerowych minutach co 20 minut.
Pobrać 50 mikrolitrów z każdej próbki i przenieść na czarną płytkę z 384 dołkami. Zmierz widmo emisyjne za pomocą czytnika mikropłytek. Przerwij mieszanie magnetyczne po 100 minutach.
Ostudzić szklane fiolki pod bieżącą wodą w zlewie. Wykreśl widma fotoemisji przez cały czas dla każdej próbki, aby uzyskać kinetykę powstawania nanoklastrów złota w różnych warunkach temperaturowych. Aby przygotować albuminę surowicy bydlęcej lub szablonowe nano klastry złota BSA, umieść szklaną fiolkę zawierającą mikromagnetyczny pręt mieszający na wierzchu mieszadła magnetycznego.
Pozostaw temperaturę jako temperaturę pokojową. Wymieszać 200 mikrolitrów roztworu BSA, 200 mikrolitrów mocznika i 200 mikrolitrów roztworu chlorku złota w szklanej fiolce przy ciągłym mieszaniu. Dwie minuty później w 20 mikrolitrach roztworu wodorotlenku sodu.
Aby aktywować zdolność redukcyjną BSA do tworzenia nanoklastrów złota i zacząć rejestrować czas reakcji jako zero minut. Mierzyć widmo fotoemisji mieszaniny reakcyjnej co godzinę. Umieść pięć szklanych fiolek, z których każda zawiera mieszadło magnetyczne i jest wstępnie oznakowana lekiem lub czystym HSA, na wierzchu wielopunktowego mieszadła magnetycznego o kontrolowanej temperaturze.
Dodać 200 mikrolitrów HSA do każdej fiolki. Następnie dodaj jeden mikrolitr każdego wcześniej przygotowanego roztworu leku do czterech odpowiednich plików. Dodaj również jeden mikrolitr DMSO do przełącznika sterującego na mieszadle.
Ustaw prędkość wirowania na 360 obr./min i inkubuj przez jedną godzinę, aby umożliwić wiązanie leku z HSA godzinę później w 200 mikrolitrach wody mili Q i 200 mikrolitrach roztworu chlorku złota do każdej fiolki przy ciągłym mieszaniu. Ustaw temperaturę na 60 stopni Celsjusza pod ciągłym mieszaniem przez 10 minut. Po 10 minutach w 20 mikrolitrach 1,5 molowego wodorotlenku sodu do każdego pliku i zacznij rejestrować czas reakcji po zerowych minutach.
Wspólne roztwory reakcyjne do pomiaru powinny przebiegać zgodnie z tą samą sekwencją dodawania leków i powinny być ćwiczone tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować efekt opóźnienia Szybko pobrać 50 mikrolitrów roztworu z każdej fiolki. Przenieś na czarną płytkę 384-dołkową i zmierz widmo emisyjne. Rejestruj widma emisyjne każdej próbki co 10 minut, zbierając co najmniej cztery widma w czterech różnych momentach.
Powtórz te kroki kilka razy, aby uzyskać wyniki ze spójnym trendem. Wykreślić widma emisji foto-rozdzielczej dla każdej próbki. Zidentyfikuj szczytową intensywność wszystkich próbek i wykreśl w zależności od czasu, aby porównać kinetykę powstawania nanoklastrów złota w różnych matrycach białkowych obciążonych lekiem, aby zmierzyć stałą wiązania między każdym lekiem a HSA.
Zastąp roztwory leku roztworami ibuprofenu w czterech różnych stężeniach. 10 minut później schłodzić szklane fiolki pod bieżącą wodą w zlewie. Pobrać 50 mikrolitrów powyższych roztworów z każdej fiolki na czarną płytkę z 384 dołkami i zmierzyć widmo emisyjne.
Powtórz te kroki jeszcze dwa razy, aby uzyskać kolejne dwa zestawy wyników przy różnych stężeniach leku przed zatrzymaniem mieszania magnetycznego. Następnie wykreśl widma emisji zdjęć i przeanalizuj wyniki dla surowca uzyskanego w każdej pojedynczej partii. Wykreśl widma emisji zdjęć każdej próbki w oprogramowaniu takim jak Origin Pro i określ intensywność szczytu.
Obliczyć i wykreślić względną intensywność fluorescencji w stosunku do stężenia leku. Następnie oblicz stałą powiązania, dopasowując dane do modelu powiązania pojedynczej witryny. Używając równania cementu Mics, aby to zrobić w oprogramowaniu takim jak Origin Pro.
Wybierz menu analizy pasujące do nieliniowego dopasowania krzywej, a następnie wybierz funkcję gradu z kategorii sigmoidalnej wzrostu na stronie wyboru funkcji ustawień. Kliknij przycisk Dopasuj, aby wyświetlić. Przedstawione tutaj dopasowane wyniki są reprezentatywnymi wynikami widm fotoemisyjnych w czasie klastrów nano złota wytworzonych w różnych warunkach denaturacji białek.
Można to zaobserwować w złocie, nanoklastry tworzą się szybciej w wyższej temperaturze. Warunek denaturacji mocznika może również ułatwić bezpośrednią syntezę nanoklastrów złota przy użyciu białka BSA jako matrycy. Poniżej przedstawiono typowe wyniki szybkich fluorometrycznych badań przesiewowych leków opartych na intensywności fluorescencji nanoklastrów złota przy użyciu HSA załadowanego lekiem jako matrycy.
Im wyższa intensywność fluorescencji, tym słabsza siła wiązania cząsteczki leku z HSA. Widma te pokazują wpływ stężenia obciążenia lekiem na szybkość tworzenia fluorescencyjnych nanoklastrów złota wewnątrz HSA obciążonego ibuprofenem. Im wyższe stężenie leku, tym niższy sygnał fluorescencyjny wynikowych nanoklastrów złota pokazanych tutaj jest reprezentatywnym wynikiem oznaczania stałej wiązania białka z lekiem.
Oblicza się go, dopasowując względną intensywność fluorescencji nanoklastrów złota zsyntetyzowanych w matrycy HSA wstępnie załadowanej lekiem ibuprofenem o różnych stężeniach przy użyciu równania cementyny MICU Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu 30 minut w celu równoległego badania przesiewowego wielu leków, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak syntetyzować wodz, go nano cluster w białku załadowanym lekiem i określać powinowactwo wiązania leków do białka docelowego, co jest wykrywalne przez sygnał fluorescencyjny emitowany z powstałych nanoklastrów złota.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nowatorską metodę przesiewowego badania leków, która wykorzystuje syntezę in situ fluorescencyjnych nanoklastrów złota (Au NC) w obrębie ładowanego lekami szablonu białkowego. Podejście to pozwala na oznaczanie wiązania leków do białek docelowych poprzez widoczną fluorescencje, upraszczając proces przesiewowy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Odkrywanie leków
- Chemia białek
- Nanotechnologia
Tło
- Rozumienie interakcji leki-białko jest kluczowe dla efektywnego projektowania leków.
- Tradycyjne metody przesiewowych badań wiązania leków mogą być skomplikowane i czasochłonne.
- Fluorescencyjne bioczujniki mogą zapewnić szybkie wgląd w interakcje molekularne.
- Nanoklastry złota mają unikalne właściwości optyczne, które mogą być wykorzystane do wykrywania.
Cel badania
- Rozwój prostej i efektywnej metody przesiewowego badania małych cząsteczek leków.
- Wykorzystanie szablonów białkowych do syntezy fluorescencyjnych nanoklastrów złota.
- Poprawa zrozumienia wiązań leków i ich wpływu na stabilność białek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie reagentów chemicznych do badania leków.
- Użycie albuminy surowicy ludzkiej (HSA) jako szablonu do syntezy nanoklastrów złota.
- Zastosowanie mieszania magnetycznego do kontroli reakcji.
- Pomiar intensywności fluorescencji do oceny wiązania leków.
Główne wyniki
- Metoda z powodzeniem wytworzyła fluorescencyjne nanoklastry złota w obrębie szablonu białkowego.
- Intensywność fluorescencji korelowała z wiązaniem cząsteczek leków.
- Podejście wykazało potencjał do szybkiego przesiewowego badania leków bez skomplikowanego sprzętu.
- Obserwowano efekty stabilizacji białek ładowanych lekami.
Konkluzje
- Ta nowatorska metoda przesiewowa oferuje prosty podejście do oceny interakcji leki-białko.
- Może ułatwić szybsze procesy odkrywania leków w dziedzinie biomedycyny.
- Wykorzystanie fluorescencyjnych bioczujników reprezentuje znaczący postęp w metodologiach przesiewowych leków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, label-free assessment of small molecule binding to target proteins using fluorescence readout from in situ synthesized gold nanoclusters. It supports early-stage target validation by providing quantitative, reproducible binding affinity data without sophisticated instrumentation. The approach improves screening throughput and reduces mechanistic ambiguity in lead identification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures relative binding strength of drug candidates to albumin proteins via inverse correlation of fluorescence intensity with binding affinity.
- Operational Value: Enables parallel screening of multiple compounds in 384-well format with results obtainable in approximately 30 minutes.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by identifying compounds with higher binding affinity through lower fluorescent signal output.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative fluorescence intensity outputs that correlate with drug-protein binding constants (KD) when drug concentration is varied.
- Reproducibility: Uses standardized denaturing conditions (60°C or urea) to ensure consistent nanocluster formation kinetics across replicates.
- Scalability: Compatible with high-density microplate formats for parallel compound evaluation in screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides binding affinity data that can inform preclinical dose selection and target engagement studies.
- Mechanistic De-risking: Links drug-induced protein stabilization to reduced nanocluster formation, offering insight into binding effects on protein conformation.
- Platform Reuse: Adaptable to other serum albumin models (e.g., BSA) and extensible to additional drug-target systems beyond the validated ibuprofen-HSA model.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting lead identification by delivering binding affinity measurements that precede functional assays and medicinal chemistry optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of drug-target interactions through direct fluorescence readout of binding-induced changes in protein nanocluster templating.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs suitable for primary screening campaigns requiring affinity ranking of compound libraries.
- Analytics: Produces time-resolved fluorescence emission spectra and peak intensity measurements that allow kinetic and equilibrium binding analysis.
- Translational Research: Supports advancement decisions by providing KD estimates alignable with orthogonal biophysical methods.
- Enterprise Reuse: Represents a portable, low-infrastructure capability for binding affinity assessment across multiple projects and protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by correlating fluorescence signal with binding affinity through a physical transduction mechanism.
- Operational Value: Eliminates need for fluorescent labeling or complex detection systems, reducing assay development time and reagent costs.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of compounds based on binding strength before investing in downstream characterization.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by delivering early, quantitative binding data that inform lead optimization paths.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling, fluorescence spectroscopy, and nonlinear regression for binding constant calculation.
- Dependent on access to temperature-controlled magnetic stirrers, microplate readers with emission scanning capability, and 384-well black plates.
- Necessitates standardization of denaturing conditions (temperature or urea concentration) across laboratories to ensure reproducible nanocluster formation.
- Adaptation to non-albumin proteins may require optimization of reducing conditions and nanocluster templating efficiency.
- Practical limitation: Method assumes drug binding alters protein’s reducing microenvironment; may not apply to targets where binding does not affect nanocluster nucleation kinetics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Synthesis of Protein-templated Gold Nanoclusters (Au NCs)
3:17
Screen Relative Binding Affinity of Different Small Molecular Drugs to HSA
5:19
Measure the Binding Constant of a Specific Drug to HSA
6:41
Results: Studying Protein-drug Binding by Forming Fluorescent Gold Nanoclusters (Au NCs) using Drug-loaded Serum Albumen as Template
7:53
Conclusion
