Ocena właściwości immunomodulacyjnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC)
24 grudnia 2015
Właściwości immunomodulacyjne ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wydają się coraz bardziej istotne dla zastosowań klinicznych. Korzystając z systemu kohodowli MSC i leukocytów krwi obwodowej wstępnie wybarwionych estrem sukcynimidylu barwnika fluorescencyjnego karboksyfluoresceiny sukcynimidylu (CFSE), opisano ocenę in vitro immunomodulacji MSC na proliferację leukocytów efektorowych i określone subpopulacje.
Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ocena właściwości immunomodulacyjnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów zaangażowanych w immunomodulację ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, co może mieć znaczenie terapeutyczne. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oceny zarówno występowania proliferacji leukocytów efektorowych, jak i liczby podziałów komórkowych, co demonstruje przebieg procedury.
Technik z mojego laboratorium, aby wyizolować pbmc, rozpoczyna od rozcieńczenia 25 ml próbki pełnej krwi z heparyną w 25 ml PBS w 50 ml probówce stożkowej. Następnie do nowej probówki 50 ml dodaje 15 ml gradientu gęstości phi, call pack. Potem, trzymając probówkę pod kątem, powoli nakłada rozcieńczoną zawiesinę komórek na gradient gęstości.
Dzięki temu warstwy nie mieszają się. Jednym z najważniejszych etapów tego eksperymentu jest nakładanie krwi w taki sposób, aby nie zakłócić gradientu gęstości. Ma to na celu zapewnienie wysokiej czystości oraz niskiego poziomu zanieczyszczenia erytrocytami wyizolowanych pbmc.
Następnie oddziel komórki poprzez wirowanie. Powinny być widoczne trzy wyraźne warstwy: górna warstwa osocza, dolna warstwa gradientu gęstości Ficoll oraz cienka, środkowa warstwa PBMC.
Za pomocą pipety PE usuń górną warstwę, uważając, aby nie odessać warstwy interfazy. Następnie użyj pipety 10 ml, aby ostrożnie przenieść PBMC do probówki stożkowej 50 ml. Wymieszaj komórki z 20 ml PBS, a następnie odwiruj je, aby usunąć wszelkie ślady gradientu gęstości.
Następnie przemyj osad w kolejnych 20 ml PBS, aby usunąć płytki krwi. Ponownie zawieś drugi osad w pełnej pożywce dla leukocytów, osiągając stężenie 1 × 10⁷ komórek/ml. Aby przygotować kokulturę MSC i leukocytów, podgrzej pełną pożywkę dla MSC do 37 °C, nie dłużej niż przez 30 minut.
Następnie wysiej 5×10⁴ MSC na 1 ml kompletnego medium MSC na dołek w płytkach 24-dołkowych w celu przylgania przez noc w temperaturze 37°C, aby komórki osiągnęły 80% konfluencji. Następnego dnia rano odessaj medium i dodaj odpowiednią liczbę PBMC znakowanych CFSE do MSC w 1 ml kompletnego medium dla leukocytów. Przy stosunku MSC do PBMC wynoszącym 1:10 aktywuj komórki za pomocą 10 µg PHA na 1 ml kompletnego medium dla leukocytów.
Następnie w trzecim i piątym dniu kokultury przenieś odpowiednią liczbę kokultur do probówek z okrągłym dnem i oceń proliferację leukocytów znakowanych CFSE za pomocą analizy cytometrycznej w celu przeprowadzenia testu supresji efektorowej. Rozpocznij od przygotowania kokultury MSC-pBMC, tak jak pokazano przed chwilą, stosując 2,5 × 10⁶ pBMC w kokulturze z 250 000 MSC. Zapewni to wystarczającą liczbę pBMC z kokultury MSC do selekcji subpopulacji.
Po 48 do 72 godzinach w temperaturze 37°C, wyselekcjonuj odpowiednie indukowane przez MSC leukocyty immunomodulacyjne za pomocą właściwych kulek magnetycznych. Następnie dodaj allogeniczne limfocyty T CD4+ znakowane CFSE w 1 mL kompletnego medium dla leukocytów na dołek, stosując różne proporcje eksperymentalne. W kolejnym kroku dodaj mikrokuleczki sprzężone z anty-CD3 w stosunku 1:1 (kuleczki do komórek), aby stymulować limfocyty T CD4+.
W trzecim dniu kokultury należy ocenić proliferację komórek T CD4+ znakowanych CFSE za pomocą cytometrii przepływowej. MSC są komórkami adherentnymi o fibroblastoidalnej morfologii wrzecionowatej, natomiast PBMC i leukocyty są małymi, okrągłymi komórkami nieadherentnymi, co pozwala na wyraźne rozróżnienie tych dwóch populacji komórek. W kokulturze, w przypadku braku proliferacji, komórki znakowane CFSE w stanie aktywacji widoczne są jako jeden, silnie dodatni i ostry pik fluorescencji.
Proliferacja objawia się w postaci wielu mniejszych pików wraz z utratą i przesunięciem w lewo intensywności fluorescencji w przypadku wystąpienia supresji proliferacji. Na przykład w kokulturze MSC liczba mniejszych pików zmniejsza się przy jednoczesnym wzroście intensywności fluorescencji, co przejawia się przesunięciem pików w prawo oraz zwiększeniem ostrości prawego pików, reprezentującego komórki niedzielące się w teście supresji efektorowej. Efekt supresyjny MSC na proliferację limfocytów T CD4+ można dodatkowo ocenić w sposób zależny od dawki.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak oceniać immunomodulację ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Należy pamiętać, że praca z ludzkimi komórkami może być niebezpieczna i zawsze należy przestrzegać środków ostrożności.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje właściwości immunomodulacyjne ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) z wykorzystaniem systemu kokultury z leukocytami krwi obwodowej. Ocena koncentruje się na proliferacji leukocytów efektorowych oraz specyficznych subpopulacji, podkreślając potencjalne znaczenie terapeutyczne komórek MSC.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Proliferacja komórek
Wstęp
- Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) posiadają właściwości immunomodulacyjne.
- Zrozumienie oddziaływań MSC z leukocytami jest kluczowe dla zastosowań terapeutycznych.
- Proliferacja efektorowych leukocytów jest kluczowym aspektem odpowiedzi immunologicznej.
- Systemy kokultury mogą skutecznie modelować te oddziaływania in vitro.
Cel badania
- Ocena efektów immunomodulacyjnych MSC w odniesieniu do proliferacji leukocytów.
- Wyjaśnienie mechanizmów immunomodulacji MSC.
- Zbadanie znaczenia terapeutycznego MSC w zastosowaniach klinicznych.
Zastosowane metody
- System kokultury MSC i leukocytów krwi obwodowej.
- Zastosowanie estru bocznego karboksyfluoresceiny z sukcynimidem (CFSE) do śledzenia komórek.
- Ocena proliferacji efektorowych leukocytów.
- Analiza specyficznych subpopulacji leukocytów.
Główne wyniki
- Wykazano indukowaną przez MSC modulację proliferacji leukocytów.
- Zidentyfikowano specyficzne subpopulacje podlegające wpływowi MSC.
- Dostarczono informacji na temat mechanizmów immunomodulacji MSC.
- Podkreślono potencjał MSC w kontekstach terapeutycznych.
Wnioski
- MSC wykazują znaczące działanie immunomodulujące na leukocyty.
- Wyniki wspierają zastosowanie terapeutyczne MSC w warunkach klinicznych.
- Konieczne są dalsze badania, aby w pełni zrozumieć zaangażowane mechanizmy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena funkcji immunomodulacyjnej MSC za pomocą testów proliferacji leukocytów opartych na CFSE zapewnia ilościową i powtarzalną metodę oceny potencjału terapeutycznego w chorobach zapośredniczonych immunologicznie. Podejście to wspiera walidację celu, umożliwiając mechanistyczną minimalizację ryzyka w zakresie immunosupresji indukowanej przez MSC przed inwestycją w badania przedkliniczne. Możliwość dostosowania testu do konkretnych subpopulacji leukocytów zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze wiodących kandydatów do projektów rozwoju leków immunomodulujących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie supresji proliferacji leukocytów efektorowych zapośredniczonej przez MSC jako funkcjonalnego wskaźnika aktywności immunomodulacyjnej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną metodę opartą na znakowaniu w celu ilościowego określenia historii podziałów i kinetyki proliferacji bez użycia izotopów promieniotwórczych.
- Wartość naukowa: Wspiera screening fenotypowy dawców MSC lub strategii wstępnego kondycjonowania poprzez pomiar supresji proliferacji leukocytów znakowanych CFSE.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia izolację i śledzenie specyficznych subpopulacji leukocytów (np. limfocytów T CD4+) za pomocą selekcji magnetycznej przed kokulturą, co pozwala na profilowanie immunomodulacji specyficznej dla danej subpopulacji.
- Wartość operacyjna: Profile rozcieńczenia CFSE generowane przez cytometrię przepływową dostarczają ilościowych, wieloparametrycznych danych na temat supresji proliferacji i historii podziałów.
- Wartość naukowa: Ułatwia ocenę zależności dawka-odpowiedź w immunomodulacji MSC przy różnych stosunkach MSC do leukocytów oraz w różnych warunkach aktywacji (np. stymulacja PHA).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy potencjał immunomodulacyjny in vitro z potencjalną skutecznością kliniczną w chorobach związanych z układem odpornościowym poprzez modelowanie interakcji między MSC a leukocytami.
- Wartość operacyjna: Umożliwia pobieranie próbek wzdłużnych (np. w dniach 3. i 5.), aby ocenić dynamikę czasową supresji i regeneracji.
- Wartość naukowa: Wspiera ewaluację zgodną z biomarkerami poprzez korelację supresji proliferacji z wewnątrzkomórkową ekspresją cytokin w kokulturach leukocytów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test proliferacji leukocytów oparty na CFSE integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych jako funkcjonalne narzędzie do przesiewowego badania immunomodulacji, stanowiąc pomost między etapem walidacji celu a etapem optymalizacji kandydata w rozwoju terapii opartych na MSC.
- Biologia odkrywcza: Weryfikuje hipotezę, że MSC hamują proliferację leukocytów, dostarczając wglądu w mechanizmy szlaków immunosupresyjnych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty proliferacji, które umożliwiają porównanie partii MSC, dawców lub warunków prymowania.
- Analityka: Generuje dane z cytometrii przepływowej zdolne do rozdzielenia pików proliferacji, śledzenia podziałów oraz odpowiedzi specyficznych dla poszczególnych subpopulacji w heterogenicznych populacjach leukocytów.
- Badania translacyjne: Modeluje oddziaływania między ludzkimi komórkami odpornościowymi a MSC in vitro, wspierając ekstrapolację do klinicznych kontekstów immunomodulacyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy modularną, adaptacyjną platformę możliwą do zastosowania w różnych typach komórek odpornościowych i warunkach stymulacji istotnych dla danej choroby.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną, dostarczając bezpośrednich, mierzalnych dowodów na supresję leukocytów pośredniczoną przez MSC.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację analizy poprzez zdefiniowane stosunki MSC:leukocyty, protokoły znakowania CFSE oraz strategie bramkowania w cytometrii przepływowej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go poprzez wczesną identyfikację MSC o silnej, powtarzalnej aktywności immunomodulującej na etapie rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów MSC z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalną siłę immunomodulacyjną, a nie tylko markery fenotypowe.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w izolacji pierwotnych leukocytów, znakowaniu CFSE oraz wielokolorowej analizie cytometrii przepływowej.
- Metoda jest zależna od dostępu do cytometrów przepływowych zdolnych do rozdzielenia pików rozcieńczenia CFSE oraz systemów separacji magnetycznej do izolacji subpopulacji.
- Konieczna jest standaryzacja warunków aktywacji leukocytów (np. stężenia PHA) oraz protokołów prekultury MSC we wszystkich ośrodkach.
- Wymagana jest optymalizacja stosunku MSC:leukocyty oraz czasu kokultury, aby uniknąć artefaktów wynikających z nadmiernego rozrostu komórek lub wyczerpania składników odżywczych.
- Ograniczeniem jest zmienność dawców w zakresie reaktywności leukocytów, co wymaga stosowania kontroli z puli dawców lub kontroli dopasowanych w celu uzyskania powtarzalnych wskaźników supresji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Isolation
2:23
MSC: Leukocyte Co-culture and Leukocyte Activation
3:31
Variation: Effector Suppression Assay
4:38
Results: Representative Suppressive Effects of MSC on Leukocyte Proliferation
5:51
Conclusion
