Name: Ocena właściwości immunomodulacyjnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Poznaj metodę oceny właściwości immunomodulacyjnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w układzie współkultury z leukocytami krwi obwodowej. Technika ta pozwala analizować proliferację leukocytów efektorowych i ich podpopulacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty od NHRI (CS-104-PP-06 dla B.L.Y.).

Na wykorzystanie komórek ludzkich musi zostać uzyskana świadoma zgoda pacjenta, zatwierdzona przez instytucjonalną komisję rewizyjną.
1. Izolacja gradientu gęstości ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs)
<ol>
	<li>Dodać 25 ml heparynizowanej krwi pełnej do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 25 ml.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć komórki 25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 15 ml gradientu gęstości Ficoll-Paque do nowej probówki o pojemności 50 ml i przechylając probówkę, bardzo powoli i ostrożnie dodać 25 ml rozcieńczonej zawiesiny komórek na gradieniu gęstości, tak aby nie doszło do zmieszania krwi pełnej z gradientem gęstości, tj. nie doszło do zakłócenia granicy faz gradientu gęstości krwi.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę od kroku 1.2 przy 400 × g przez 30 do 40 minut w wirniku z kubełkiem wahliwym o regulowanej temperaturze bez hamulca w temperaturze 20 °C. 
	Uwaga: Po odwirowaniu powinny być widoczne trzy wyraźne warstwy: górna warstwa to osocze; dolna przezroczysta warstwa jest gradientem gęstości Ficoll-Paque; oraz cienka, środkowa warstwa komórkowa będąca PBMC</li>
	<li>Odessać i wyrzucić górną warstwę przez odsysanie pipetą Pasteura, uważając, aby nie naruszyć warstwy interfazowej komórek jednojądrzastych (tj. limfocytów, monocytów i płytek krwi).</li>
	<li>Ostrożnie zebrać tę jednojądrzastą warstwę komórek za pomocą pipety o pojemności 10 ml do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Napełnić probówkę 20 ml PBS, dobrze wymieszać i odwirować przy stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 20°C. Po odwirowaniu całkowicie usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 20 ml PBS i odwirować przy 200 × g przez 10-15 minut w temperaturze 20 °C. Po odwirowaniu całkowicie usunąć supernatant. 
	Uwaga: Ten krok usuwa płytki krwi, które są niepożądane w PBMC; Ten krok można powtórzyć, aby zapewnić całkowite usunięcie płytek krwi.</li>
	<li>Jeśli nie jest pożądany wybór określonych populacji, ponownie zawieś osad komórkowy w kompletnej pożywce leukocytów (10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy i 1% penicyliny/streptomycyny w pożywce RPMI-1640) do hodowli po wykonaniu zliczania komórek16 w celu zawieszenia 1 ml pożywki na 107 PBMC przed przejściem do następnego kroku.</li>
</ol>
2. Magnetyczne znakowanie populacji leukocytów (przejdź do KROKU 4, jeśli nie jest wymagany wybór określonych populacji)
<ol>
	<li>Odwirować zawiesinę PBMC o stężeniu 300 × g przez 10 minut i całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 80 μl PBS na 107 wszystkich komórek.</li>
	<li>Dodać 20 μl określonych kulek magnetycznych (tj. kulek magnetycznych CD14 do izolacji monocytów, kulek magnetycznych CD4 do izolacji limfocytów T) na 107 komórek ogółem.</li>
	<li>Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze od 2 do 8 °C w lodówce.</li>
	<li>Dodać 1-2 ml PBS na 107 komórek do przemycia i odwirować przy 300 × g przez 10 min.</li>
	<li>Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić do 108 komórek w 500 μl PBS.</li>
</ol>
3. Selekcja magnetyczna subpopulacji leukocytów
Uwaga: Dostępne są różne magnetyczne separatory i kolumny do izolacji określonej populacji leukocytów za pomocą markera powierzchni komórki od wielu producentów. Izolacja może odbywać się przez selekcję pozytywną opartą na jednym lub kilku markerach dodatnich lub przez selekcję negatywną po uszczupleniu niepożądanych populacji. Poniżej przedstawiono ogólne podejście do przeprowadzania selekcji pozytywnej przy użyciu jednego markera (tj. CD4 dla limfocytów T pomocniczych lub CD14 dla monocytów).
<ol>
	<li>Przygotować i zalać separator magnetyczny wraz z kolumną separacyjną zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Nałożyć probówkę zawierającą próbkę znakowanych PBMC. Dostarczyć dwie probówki wirówkowe o pojemności 15 ml do pobierania dodatnio znakowanych i nieznakowanych frakcji komórkowych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Policz komórkę numer15 i ponownie zawieś pozytywnie wybrane leukocyty (tj. Limfocyty T CD4 + lub komórki CD14 +) w kompletnej pożywce leukocytów, używając 1 ml pożywki na 107 komórek.</li>
</ol>
4. Barwienie leukocytów metodą CFSE do oceny proliferacji
Uwaga: CFSE jest szeroko stosowany w badaniach immunologicznych, zarówno in vivo, jak i in vitro. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem badań in vitro interakcji MSC/PBMC (lub innych leukocytów). Chociaż ogólne etapy związane z przeprowadzaniem znakowania CFSE in vitro są podobne, mogą występować różnice w konkretnej dawce i czasie stosowania protokołu14. Może to być spowodowane wieloma czynnikami, tj. konkretnym typem użytych komórek, liczbą użytych komórek - które mogą prawdopodobnie wpływać na intensywność sygnału fluorescencyjnego CFSE.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy CFSE (10 mM) w PBS do pożądanego stężenia roboczego 10 μM (roztwór roboczy CFSE). Przygotuj 107 komórek (tj. PBMC lub limfocyty T) do znakowania roztworem roboczym CFSE.</li>
	<li>Wirować przy 300 × g przez 10 minut w celu uzyskania osadu komórkowego i zassać supernatant.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić komórki w 1 ml wstępnie ogrzanego (37 °C) roztworu roboczego CFSE i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Aby zmyć nadmiar CFSE, rozcieńczyć zawiesinę ogniw 10 razy (objętościowo) wstępnie schłodzonego (4 °C) podłoża RPMI zawierającego 10% FBS. Osadzać komórki przez odwirowywanie przy 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Umyj w ten sposób osad komórkowy jeszcze dwukrotnie.</li>
	<li>Ponownie zagnieźlić komórki przez odwirowanie i policzyć komórkę numer15. Ponownie zawiesić 107 komórek (PBMC lub limfocyty T) w 1 ml świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki leukocytów.</li>
</ol>
5. Współhodowla MSCs z leukocytami i aktywacja leukocytów
<ol>
	<li>Wstępnie ogrzej kompletną pożywkę MSC (10% FBS (wstępnie przetestowane pod kątem optymalnego wzrostu MSC), 1% L-glutaminy i 1% penicyliny/streptomycyny w pożywce DMEM o niskiej zawartości glukozy) do 37 °C przez nie więcej niż 30 min.</li>
	<li>Wysiewaj MSCs w 50 000 komórek w 1 ml kompletnej pożywki MSC na płytkach 24-dołkowych (gęstość MSC: 25 000 komórek/cm2) w celu przyłączenia O/N w inkubatorze o temperaturze 37 °C, co pozwala komórkom macierzystym osiągnąć 80% konfluencji.</li>
	<li>Odessać pożywkę i na podstawie wysianych numerów MSC dodać PBMC znakowane CFSE (wcześniej oznaczone - patrz krok 4 protokołu powyżej) do hodowanych MSCs (wysianych poprzedniego dnia na płytkach 24-dołkowych) w 1 ml kompletnej pożywki leukocytów przy stosunku kohodowli 1:10 (stosunek komórek) MSCs do PBMC.</li>
	<li>Dodać mitogenną fitohemaglutyninę (PHA), niespecyficzny aktywator leukocytów, do końcowego stężenia 10 μg/ml w całkowitej objętości 1 ml kompletnej pożywki leukocytów na basenik.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, aby stymulować aktywację limfocytów T: użyj mikrokulek α-CD3/28 i dodaj do kokultury dwukomórkowej, aby uzyskać stosunek limfocytów kulkowych do T wynoszący 1:1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku kontroli ujemnej należy umieścić 500 000 PBMC/basenik (lub określoną populację leukocytów efektorowych; gęstość komórek: 250 000 leukocytów/cm2) na 24-dołkowej płytce z 1 ml kompletnej pożywki leukocytów; w przypadku kontroli pozytywnej, oprócz posiewu tej samej liczby PBMC/basenik, dodać PHA do końcowego stężenia 10 μg/ml.</li>
	<li>W 3 i 5 dniu eksperymentu z jednoczesną hodowlą ocenić proliferację leukocytów znakowanych CFSE (umieszczonych w probówkach okrągłodennych) za pomocą analizy cytometrii przepływowej17 z filtrami wzbudzenia i emisji 488 nm odpowiednimi dla fluoresceiny. 
	Uwaga: W tym momencie można również przeprowadzić barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej na tych leukocytach znakowanych CFSE, aby ocenić zmiany w profilu ekspresji cytokin leukocytów modulowanym przez MSC. Ponieważ CFSE ocenia się za pomocą filtra odpowiedniego dla fluoresceiny, przeciwciała wybrane do oceny różnych cytokin muszą być sprzężone z fluorochromami innymi niż fluoresceina lub podobne spektrum (tj. fikoerytryna, kompleks białkowy chlorofilu perydyniny (PerCP)).</li>
</ol>
6. Wariacja: Test supresji efektorów Wybrane przez kulki magnetyczne, indukowane przez MSC immunomodulujące leukocyty na aktywowanych limfocytach T efektorowych CD4 + znakowanych CFSE
<ol>
	<li>Wysiewać MSCs w 250 000 komórek w 3 ml kompletnego podłoża MSC na płytkach 6-dołkowych (gęstość MSC: 25 000 komórek/cm2) w celu przyłączenia O/N w inkubatorze o temperaturze 37 °C, co pozwala komórkom macierzystym osiągnąć 80% konfluencji. Niezbędne są co najmniej 3 płytki 6-dołkowe, aby zapewnić wystarczającą ilość PBMC współhodowanych przez MSC do selekcji subpopulacji. </li>
	<li>Odessać pożywkę i dodać PBMC oddzielone zgodnie z krokiem 1, ale na płytkach 6-dołkowych w proporcji 2,5 x 106 komórek/dołek (gęstość komórek: 250 000 leukocytów/cm2) z 3 ml kompletnej pożywki leukocytów. Współhodowla przez 48-72 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Specyficzna populacja leukocytów immunomodulujących indukowanych przez MSC (tj. komórek CD14 +) swoista do kulek magnetycznych, zgodnie z sekcjami 2-3. 
	Uwagi: W tym momencie można przeprowadzić barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej, aby ocenić zmiany w profilu ekspresji cytokin leukocytów, tj. ekspresji interleukiny-10-modulowanej przez MSC.</li>
	<li>Dodaj znakowane CFSE allogeniczne limfocyty T CD4 + wygenerowane zgodnie z sekcjami 2-4 na 24-dołkowych płytkach w 1 ml kompletnej pożywki leukocytów (gęstość limfocytów T: 250 000 komórek / cm2) do wybranych przez kulki leukocytów indukowanych przez MSC w różnych proporcjach, tj. Proporcje 1:10, 1:5, 1:2 i 1:1 (komórka do komórki).</li>
	<li>Aby stymulować limfocyty T CD4 +, dodaj α-CD3 / 28 sprzężone mikrogranulki, aby uzyskać stosunek kulek do komórek 1: 1.</li>
	<li>W celu kontroli ujemnej umieść 500 000 limfocytów T CD4 + / basenik na 24-dołkowej płytce (gęstość limfocytów T: 250 000 komórek / cm2) tylko z 1 ml kompletnej pożywki leukocytów; w celu kontroli pozytywnej, oprócz posiewu tej samej liczby limfocytów T CD4 + / basenik, dodaj α-CD3 / 28 sprzężonych mikrogranulek, aby uzyskać stosunek kulek do komórek 1: 1.</li>
	<li>W 3 dniu kohodowli ocenić proliferację limfocytów T CD4 + znakowanych CFSE (umieszczonych w probówkach okrągłodennych) za pomocą analizy cytometrii przepływowej16 z filtrami wzbudzenia i emisji 488 nm odpowiednimi dla fluoresceiny.</li>
</ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor+cells+of+mechanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Precursor cells of mechanocytes.</a> Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+stromal+cells+as+stem+cells+for+nonhematopoietic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.</a> Science. 276, 71-74 (1997).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).</li>
<li>Yen, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+cells+from+human+term+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent cells from human term placenta.</a> Stem Cells. 23, 3-9 (2005).</li>
<li>Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitor+cells+in+human+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.</a> Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).</li>
<li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).</li>
<li>Chang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placenta-derived+multipotent+cells+exhibit+immunosuppressive+properties+that+are+enhanced+in+the+presence+of+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma.</a> Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).</li>
<li>Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+properties+of+human+adult+and+fetal+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).</li>
<li>Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMuul%2C+LM+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Chen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+immunomodulatory+monocytes+by+human+mesenchymal+stem+cell-derived+hepatocyte+growth+factor+through+ERK1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2.</a> J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).</li>
<li>Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOughton%2C+JA+%22Curr+Protoc+Toxicol%22">Curr Protoc Toxicol</a>. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).</li>
<li>Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhelan%2C+MC+%22Curr+Protoc+Cytom%22">Curr Protoc Cytom</a>. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).</li>
<li>Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+capacity+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells.</a> Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).</li>
<li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+treatment+of+steroid-resistant%2C+severe%2C+acute+graft-versus-host+disease%3A+a+phase+II+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study.</a> Lancet. 371, 1579-1586 (2008).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+living-related+kidney+transplants%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial.</a> JAMA. 307, 1169-1177 (2012).</li>
<li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+inhibit+and+stimulate+mixed+lymphocyte+cultures+and+mitogenic+responses+independently+of+the+major+histocompatibility+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex.</a> Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+in+vitro+impairs+the+immunosuppressive+activity+of+mesenchymal+stem+cells+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells.</a> Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).</li>
<li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties?</a> Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).</li>
<li>Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+accumulation+mediates+differentiation+capacity+alteration%2C+but+not+proliferative+decline%2C+in+senescent+human+fetal+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Coraz częściej właściwości immunomodulacyjne MSCs przekładają się na zastosowanie kliniczne szybciej niż wieloliniowa zdolność tych komórek macierzystych18-20. W związku z tym techniki kohodowli MSCs z leukocytami oraz testy oceny funkcji immunologicznej są ważne dla dalszego nakreślenia specyficznych mechanizmów związanych z tymi właściwościami w celu optymalizacji skutecznego zastosowania terapeutycznego. 
Jednym z najbardziej krytycznych aspektów technicznych dla powodzenia tych ...

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są somatycznymi progenitorami, które mogą różnicować się w przyosiowe linie mezodermalne kości, chrząstek i tkanki tłuszczowej1-4, a także w kilka pozamezodermalnych linii5. Po raz pierwszy wyizolowane ze szpiku kostnego dorosłego człowieka, te wieloliniowe komórki progenitorowe zostały teraz znalezione w wielu tkankach6-8 i, nieoczekiwanie, wykazano, że mają silne właściwości immunomodulujące, które wydają się wysoce podatne na zastosowanie kliniczne9-12. Szczegółowe mechanizmy związane z efektami immunomodulacyjnymi są aktywnie badane pod kątem skutecznego zastosowania w określonych jednostkach chorobowych. Jednym z najprostszych sposobów oceny immunomodulacji jest ocena pod kątem supresji proliferacji leukocytów efektorowych13. Większość leukocytów efektorowych, takich jak limfocyty T i monocyty, rozmnaża się nadzwyczajnie, gdy są stymulowane lub aktywowane. Funkcję immunomodulacyjną można ocenić, gdy udowodnione jest zahamowanie proliferacji.
Tradycyjnie, proliferacja leukocytów efektorowych była oceniana przez wykrycie inkorporacji [3H] tymidyny do DNA. Jednak metoda ta ma znaczne wady ze względu na obawy związane z promieniowaniem i utylizacją po użyciu, a także skomplikowany potrzebny sprzęt. Chociaż istnieją testy nieradioaktywne do oceny proliferacji komórek, test estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) ma inne zalety, takie jak możliwość identyfikacji określonych populacji komórkowych, co jest szczególnie przydatne w eksperymentach z udziałem wielu typów komórek. CFSE jest fluorescencyjnym barwnikiem komórkowym, który można ocenić za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Gdy komórki się dzielą, intensywność tej etykiety komórkowej jest proporcjonalnie zmniejszana; Umożliwia to nie tylko określenie ogólnej proliferacji komórek, ale także ocenę liczby podziałów komórkowych do 8 podziałów, zanim fluorescencja stanie się trudna do wykrycia na tle sygnału. Co więcej, stabilność fluorescencyjnego CFSE pozwala na śledzenie in vivo znakowanych komórek, dzięki czemu komórki mogą być wizualizowane nawet przez wielemiesięcy14.
Ten test może być również zróżnicowany w celu oceny określonych typów leukocytów efektorowych lub funkcji immunomodulacyjnej określonych populacji leukocytów immunomodulujących indukowanych przez MSC, takich jak interleukina-10 (IL-10) produkujących monocyty CD14+ 15, przeprowadzając selekcję markerów powierzchniowych kulek magnetycznych interesujących populacji komórek przed lub po wspólnej hodowli, jeśli jest to właściwe. Nasz protokół opisuje podstawowy test oceny immunomodulacyjnego wpływu MSCs na leukocyty efektorowe (schemat blokowy pokazany na rycinie 1) oraz odmianę tego podstawowego testu do oceny immunomodulacji leukocytów indukowanej przez MSC na allogenicznych efektorowych limfocytach T CD4 + (schemat blokowy pokazany na rycinie 4).

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AG</td><td>Gęstość wspaniała do izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)</td></tr><tr><td>Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)</td><td>Life Technologies</td><td>V12883</td><td>Etykieta komórkowa do wykrywania podziału komórek</td></tr><tr><td>Fitoaglutynina (PHA)</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>Aktywacja ludzkich PBMC</td></tr><tr><td>Dynabeads Ludzki T-aktywator CD3/28</td><td>Life Technologies</td><td>111.32D</td><td>Aktywacja ludzkich limfocytów T, np. limfocyty T CD4+, limfocyty T CD8+, etc.</td></tr><tr><td>autoMACS&trade; Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>autoMACS&trade; Separator</td><td>Magnetyczny separator komórek</td></tr><tr><td>autoMACS&reg; Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td>Kolumny separacyjne</td></tr><tr><td>CD14 mikrogranulki, ludzkie&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>Do pozytywnej selekcji ludzkich monocytów i makrocytów CD14+</td>z</tr><tr><td>PBMC Mikrogranulki CD4, ludzkie&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>Do pozytywnej selekcji ludzkich limfocytów T CD4+ z PBMC</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td>Ludzka pożywka do hodowli PBMC/leukocytów</td></tr><tr><td>DMEM, niska glukoza, pirogronian</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>Pożywka hodowlana ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC)</td></tr><tr><td>L-glutamina</td> Life <td>Technologies</td><td>25030-081</td><td>Suplementacja dla MSC complete pożywki</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td>Suplementacja dla PBMC/leukocytów i MSC complete pożywki</td></tr><tr><td>Surowica płodowa bydlęca (FBS)</td><td>1) Hyklon, do hodowli MSC&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2) Life Technologies, dla wszystkich innych komórek (tj. PBMC, określonych populacji leukocytów)</td><td>1) SH30070.03M 2) 10091-148</td><td>Partie do badań wstępnych na wsparcie hodowli MSC in vitro</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Corning</td><td>COR3524</td><td>Płytka do wspólnej hodowli</td></tr><tr><td>50 ml Corning</td><td></td><td>430291</td><td>Izolacja PBMC z krwi pełnej za pomocą probówki wirówkowej Ficoll-Paque PLUS</td></tr><tr><td>15 ml&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430766</td><td>Zbieranie znakowanych i nieznakowanych frakcji komórkowych</td></tr><tr><td>Probówki okrągłodenne</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td>352008</td><td>Pobieranie komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej</td></tr></tbody></table>

ocena właściwości immunomodulacyjnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (msc)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Właściwości immunomodulacyjne wieloliniowych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wydają się być bardzo istotne do zastosowania klinicznego w szerokim zakresie chorób związanych z odpornością. Mechanizmy związane z tym zjawiskiem są coraz częściej wyjaśniane, a w tym artykule opisujemy podstawowy eksperyment mający na celu ocenę immunomodulacji MSC poprzez testowanie supresji proliferacji leukocytów efektorowych. Reprezentująca aktywację, proliferacja leukocytów może być oceniana za pomocą wielu technik, a w tym protokole opisujemy zastosowanie fluorescencyjnego barwnika komórkowego karboksyfluoresceiny estru sukcynimidylowego (CFSE) do znakowania leukocytów za pomocą kolejnych analiz cytometrycznych przepływowych. Technika ta może nie tylko ocenić proliferację bez radioaktywności, ale także liczbę podziałów komórkowych, które zaszły, a także pozwala na identyfikację określonej populacji proliferujących komórek i wewnątrzkomórkowej ekspresji cytokin/czynnika. Co więcej, test można dostosować do oceny określonych populacji leukocytów efektorowych poprzez wybór markera powierzchniowego kulek magnetycznych populacji pojedynczych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przed wspólną hodowlą z MSC. Elastyczność tego testu kokulturowego jest przydatna do badania interakcji komórkowych między MSCs a leukocytami.

Rycina 1 przedstawia ogólny schemat eksperymentu, a Rycina 2 obrazuje wygląd różnych warunków hodowli komórkowych w wizualizacji za pomocą odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego. MSC są komórkami adherentnymi o morfologii fibroblastycznej, wrzecionowatej, natomiast PBMC i leukocyty są małymi, okrągłymi komórkami nieadherentnymi. Te dwa morfologicznie różne typy komórek można wyraźnie dostrzec w ko-kulturze. Na koniec analizy, podczas aspiracji PBMC (lub leukocytów) do analizy cytometrycznej, nawet jeśli...

Właściwości immunomodulacyjne ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wydają się coraz bardziej istotne dla zastosowań klinicznych. Korzystając z systemu kohodowli MSC i leukocytów krwi obwodowej wstępnie wybarwionych estrem sukcynimidylu barwnika fluorescencyjnego karboksyfluoresceiny sukcynimidylu (CFSE), opisano ocenę in vitro immunomodulacji MSC na proliferację leukocytów efektorowych i określone subpopulacje.

Ocena właściwości immunomodulacyjnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ocena właściwości immunomodulacyjnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów zaangażowanych w immunomodulację ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, co może mieć znaczenie terapeutyczne. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oceny zarówno występowania proliferacji leukocytów efektorowych, jak i liczby podziałów komórkowych, co demonstruje przebieg procedury.Technik z mojego laboratorium, aby wyizolować pbmc, rozpoczyna od rozcieńczenia 25 ml próbki pełnej krwi z heparyną w 25 ml PBS w 50 ml probówce stożkowej. Następnie do nowej probówki 50 ml dodaje 15 ml gradientu gęstości phi, call pack. Potem, trzymając probówkę pod kątem, powoli nakłada rozcieńczoną zawiesinę komórek na gradient gęstości.Dzięki temu warstwy nie mieszają się. Jednym z najważniejszych etapów tego eksperymentu jest nakładanie krwi w taki sposób, aby nie zakłócić gradientu gęstości. Ma to na celu zapewnienie wysokiej czystości oraz niskiego poziomu zanieczyszczenia erytrocytami wyizolowanych pbmc.Następnie oddziel komórki poprzez wirowanie. Powinny być widoczne trzy wyraźne warstwy: górna warstwa osocza, dolna warstwa gradientu gęstości Ficoll oraz cienka, środkowa warstwa PBMC.Za pomocą pipety PE usuń górną warstwę, uważając, aby nie odessać warstwy interfazy. Następnie użyj pipety 10 ml, aby ostrożnie przenieść PBMC do probówki stożkowej 50 ml. Wymieszaj komórki z 20 ml PBS, a następnie odwiruj je, aby usunąć wszelkie ślady gradientu gęstości.Następnie przemyj osad w kolejnych 20 ml PBS, aby usunąć płytki krwi. Ponownie zawieś drugi osad w pełnej pożywce dla leukocytów, osiągając stężenie 1 × 10⁷ komórek/ml. Aby przygotować kokulturę MSC i leukocytów, podgrzej pełną pożywkę dla MSC do 37 °C, nie dłużej niż przez 30 minut.Następnie wysiej 5×10⁴ MSC na 1 ml kompletnego medium MSC na dołek w płytkach 24-dołkowych w celu przylgania przez noc w temperaturze 37°C, aby komórki osiągnęły 80% konfluencji. Następnego dnia rano odessaj medium i dodaj odpowiednią liczbę PBMC znakowanych CFSE do MSC w 1 ml kompletnego medium dla leukocytów. Przy stosunku MSC do PBMC wynoszącym 1:10 aktywuj komórki za pomocą 10 µg PHA na 1 ml kompletnego medium dla leukocytów.Następnie w trzecim i piątym dniu kokultury przenieś odpowiednią liczbę kokultur do probówek z okrągłym dnem i oceń proliferację leukocytów znakowanych CFSE za pomocą analizy cytometrycznej w celu przeprowadzenia testu supresji efektorowej. Rozpocznij od przygotowania kokultury MSC-pBMC, tak jak pokazano przed chwilą, stosując 2,5 × 10⁶ pBMC w kokulturze z 250 000 MSC. Zapewni to wystarczającą liczbę pBMC z kokultury MSC do selekcji subpopulacji.Po 48 do 72 godzinach w temperaturze 37°C, wyselekcjonuj odpowiednie indukowane przez MSC leukocyty immunomodulacyjne za pomocą właściwych kulek magnetycznych. Następnie dodaj allogeniczne limfocyty T CD4+ znakowane CFSE w 1 mL kompletnego medium dla leukocytów na dołek, stosując różne proporcje eksperymentalne. W kolejnym kroku dodaj mikrokuleczki sprzężone z anty-CD3 w stosunku 1:1 (kuleczki do komórek), aby stymulować limfocyty T CD4+.W trzecim dniu kokultury należy ocenić proliferację komórek T CD4+ znakowanych CFSE za pomocą cytometrii przepływowej. MSC są komórkami adherentnymi o fibroblastoidalnej morfologii wrzecionowatej, natomiast PBMC i leukocyty są małymi, okrągłymi komórkami nieadherentnymi, co pozwala na wyraźne rozróżnienie tych dwóch populacji komórek. W kokulturze, w przypadku braku proliferacji, komórki znakowane CFSE w stanie aktywacji widoczne są jako jeden, silnie dodatni i ostry pik fluorescencji.Proliferacja objawia się w postaci wielu mniejszych pików wraz z utratą i przesunięciem w lewo intensywności fluorescencji w przypadku wystąpienia supresji proliferacji. Na przykład w kokulturze MSC liczba mniejszych pików zmniejsza się przy jednoczesnym wzroście intensywności fluorescencji, co przejawia się przesunięciem pików w prawo oraz zwiększeniem ostrości prawego pików, reprezentującego komórki niedzielące się w teście supresji efektorowej. Efekt supresyjny MSC na proliferację limfocytów T CD4+ można dodatkowo ocenić w sposób zależny od dawki.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak oceniać immunomodulację ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Należy pamiętać, że praca z ludzkimi komórkami może być niebezpieczna i zawsze należy przestrzegać środków ostrożności.

assessment-immunomodulatory-properties-human-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test in vitro badający immunomodulacyjny wpływ mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) na proliferację efektorowych limfocytów T. Test obejmuje jednoczesną hodowlę MSCs z PBMC w celu skłonienia populacji monocytów do uzyskania fenotypu immunomodulującego, prowadzącego do wydzielania interleukiny-10 (IL-10). Po inkubacji z aktywowanymi limfocytami T CD4 + indukowane monocyty skutecznie hamują proliferację limfocytów T.

Test in vitro do oceny immunomodulacyjnego wpływu monocytów na proliferację leukocytów

Tutaj opisujemy zoptymalizowany, wysoce powtarzalny protokół izolacji mezodermalnych komórek progenitorowych (MPC) od ludzkiego szpiku kostnego (hBM). MPC scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej i ekspresji gniazdyny. Wykazali oni zdolność do tworzenia wykładniczo rosnących kultur komórkowych podobnych do MSC, przy jednoczesnym zachowaniu ich potencjału angiogennego.

Izolowanie mezangiogennych komórek progenitorowych (MPC) z ludzkiego szpiku kostnego

Potencjał terapeutyczny mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) jest dobrze udokumentowany, jednak najlepsza metoda przygotowania komórek dla pacjentów pozostaje kontrowersyjna. W tym artykule przekazujemy protokoły umożliwiające efektywne generowanie i podawanie terapeutycznych agregatów sferycznych lub "sferoid" MSCs przygotowanych w warunkach wolnych od ksenotypów do zastosowań eksperymentalnych i klinicznych.

Produkcja i podawanie terapeutycznych sferoid mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) przygotowanych w hodowlach 3D w warunkach wolnych od ksenotypów

Mysie badania na modelach zapalenia jelita grubego wykazały, że niewielki procent (1 - 5%) mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wstrzykniętych dożylnie lub dootrzewnowo do miejsca zapalnego jelita grubego1,2. Badanie to pokazuje, że dosercowe wstrzyknięcia MSC pod kontrolą USG powodują zwiększoną lokalizację w jelicie.

Wstrzyknięcie dosercowe pod kontrolą ultradźwięków ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia naprowadzania do jelita do stosowania w mysich modelach eksperymentalnych chorób zapalnych jelit

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Prezentowany tutaj jest protokół do ilościowego określania i tworzenia dynamicznych obrazów regulacji makrofagów (MΦ) za pośrednictwem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) fagocytozy nieopsonizowanych cząsteczek drożdży (zymosan), które są sprzężone z cząsteczką fluorescencyjną wrażliwą na pH.

Mezenchymalne komórki macierzyste regulują fagocytozę makrofagów; Kwantyfikacja i obrazowanie

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Ten protokół opisuje i porównuje dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na mezenchymalne komórki zrębu (MSC). Metoda jednowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym. Metoda ciał zarodkowych (EBs) charakteryzuje się mniejszym zużyciem czasu.

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Poznaj metodę oceny właściwości immunomodulacyjnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w układzie współkultury z leukocytami krwi obwodowej. Technika ta pozwala analizować proliferację leukocytów efektorowych i ich podpopulacji.

Ocena właściwości immunomodulacyjnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC)

Przeglądaj więcej filmów