Wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów w żywych komórkach pochodzenia mysiego, ludzkiego i świńskiego za pomocą nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza wewnątrzkomórkowej ekspresji genów bezpośrednio w żywych komórkach poprzez zastosowanie specyficznych dla genów nanocząsteczek fluorescencyjnych. Jest to realizowane poprzez najpierw zdefiniowanie odpowiednich sekwencji docelowych w badanym genie. Drugim krokiem jest wytworzenie nanocząsteczek z odpowiednimi niciami wychwytującymi i reporterowymi.

Następnie nanocząstki dodaje się bezpośrednio do pożywki hodowlanej żywych komórek. Ostatnim krokiem jest inkubacja komórek z nanocząstkami przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w atmosferze zwiększonej wilgotności. W końcowym etapie wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji fluorescencji specyficznej dla genu w żywych komórkach docelowych, natomiast analiza cytometryczna służy do ilościowego oznaczenia liczby komórek fluorescencyjnych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak immunohistochemia, sondy molekularne (molecular beacons) czy analiza PCR, jest możliwość wizualnej obserwacji ekspresji genów w żywych komórkach bez konieczności manipulowania kulturą komórkową. Procedurę zaprezentuje Martina Teresa, biolog i doktorantka z naszego laboratorium, a Lynette Henkel przedstawi cytometryczną analizę przepływową. Po ustaleniu sekwencji docelowych należy zamówić liofilizowane nanocząsteczki złota z dostępnych komercyjnie źródeł.

Cząstki te składają się z centralnej cząstki złota kowalencyjnie połączonej z nicią przechwytującą, która jest związana z nicią reporterową. Gdy docelowy mRNA wiąże się z nicią przechwytującą, nić reporterowa oraz połączony z nią fluorofor zostają uwolnione do roztworu, co umożliwia emisję fluorescencji przez Fluor four. Przed rekonstytucją.

Nanocząstki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, w tekturowym pudełku. Aby zrekonstytuować nanocząstki złota, należy dodać 20 µL wody dwukrotnie destylowanej, co pozwoli uzyskać końcowe stężenie 100 nM. Zrekonstytuowane nanocząstki można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez co najmniej rok.

W dniu aplikacji rozcieńczyć roztwór zapasowy nanocząsteczek złota do 20-krotnego roztworu roboczego w PBS, wyjąć płytkę 24-dołkową zawierającą komórki HEK 2 93 z inkubatora do hodowli komórkowej, odessać pożywkę, a następnie dodać 237,5 µL świeżej pożywki hodowlanej, po czym pipetować 12,5 µL roztworu roboczego nanocząsteczek do każdego przygotowanego dołka i zakręcić płytką, aby zapewnić równomierne rozłożenie nanocząsteczek. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w atmosferze nawilżonej. Następnego dnia.

Analizę kultur komórkowych pod kątem fluorescencji specyficznej dla miejsca trzech genów przeprowadź przy użyciu standardowego mikroskopu fluorescencyjnego, aby przygotować komórki do cytometrii przepływowej. Komórki HEK 2 9 3 wykazujące indukowaną fluorescencję miejsca trzech przemyj raz buforem PBS, a następnie dodaj 1 ml 0,05% trypsyny z EDTA; inkubuj komórki przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po inkubacji dodaj 0,5 ml pożywki CO i wymieszaj poprzez pipetowanie.

Następnie przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 3 ml pożywki hodowlanej i wiruj probówkę przez 5 minut przy 300 ×g. Następnie usuń nadsącz i resuspenduj komórki w 200 µl lodowatego buforu FAX. Przenieś komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i przechowuj je w ciemności w lodzie do momentu przeprowadzenia analizy.

Przed analizą FACS należy przepuścić komórki przez filtr 30 µm, aby zapobiec ich agregacji. Następnie do komórek należy dodać jodek propidyny do końcowego stężenia 2 µg/mL na co najmniej dwie minuty, przetransportować komórki do wirówki przy cytometrze przepływowym i załadować probówkę z próbką do urządzenia. W celu wykrycia komórek pozytywnych SI three.

Użyj nieleczonych komórek kontrolnych do ustawienia bramek hierarchicznych na podzbiorze obszaru rozproszenia przedniego (FSC-A) względem obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A), wysokości FSC względem FSC oraz wysokości SSC względem SSC, aby wykluczyć debris komórkowy i skupiska komórek. Usuń martwe komórki z analizy na podstawie barwienia jodkiem propidium, wyświetlając kanał PE względem kanału PE Texas Red, a następnie wykonaj końcową bramkę sortowania na komórkach pozytywnych w kanale PE. Detekcja GA dh.

W celu walidacji wykonalności eksperymentalnej przeprowadzono analizę konstytutywnie wyrażanego genu gospodarza w komórkach HEK 2 93. Nanocząstki służące jako ujemna kontrola (scrambled) wykazują znikomą lub żadną fluorescencję, podczas gdy pozytywna kontrola poboru wykazuje trwałą fluorescencję. Kontrole wykazują silny sygnał po inkubacji przez noc.

Wykazano, że nanocząsteczki te specyficznie wykrywają ekspresję genów markerów pluripotencjalnych komórek macierzystych, nano oraz GDF3, w ludzkich i świńskich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSCs). Co istotne, markery te wykryto wyłącznie w iPSCs, a nie w komórkach fibroblastów, które służyły jako warstwa pożywkowa podczas hodowli komórek iPS. Do oceny wydajności znakowania nanocząsteczkami GA DH wykorzystano analizę wizualną oraz ilościową za pomocą cytometrii przepływowej, stosując gradient stężeń nanocząsteczek od 0 do 1000.

Badanie PICO molar przeprowadzono z użyciem komórek HEK 2 93, w których wykazano wyraźny zależny od stężenia wzrost fluorescencji. Następnie przeprowadzono analizę ilościową w mysich embrionalnych komórkach macierzystych, w których po dodaniu 400 nanocząsteczek PICOMOLAR GA DH stwierdzono obecność około 40% komórek pozytywnych pod kątem CY three. Podobne wartości uzyskano dla markerów pluripotencji.

Nano i GDF three po opanowaniu. Technika ta może zostać wykonana w ciągu 16 godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać nanocząsteczki specyficzne dla genów do wykrywania wewnątrzkomórkowej ekspresji genów bezpośrednio w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.