2.3: Inżynieria genetyczna organizmów modelowych

Inżynieria genetyczna jest cennym narzędziem wykorzystywanym do modyfikowania genomów organizmów modelowych w procesie znanym jako transgeneza. W biologii rozwoju podejście to jest często stosowane do ekspresji zmodyfikowanych genów, które można uwidocznić w żywych tkankach. Alternatywnie, inżynieria genetyczna może być wykorzystana do zapobiegania lub zakłócania ekspresji białek w celu zbadania funkcji rozwojowej określonych genów.

Ten film podsumuje zasady stojące za tą technologią, dokona przeglądu niektórych procedur inżynierii genetycznej i podkreśli sposoby, w jakie te techniki są wykorzystywane w laboratorium.

Na początek przyjrzyjmy się kilku ważnym pojęciom leżącym u podstaw transgenezy. Polega to na wprowadzeniu DNA do genomu organizmu modelowego. Istnieje wiele podejść w zależności od celu badania.

Po pierwsze, dodanie zmienionego genu może ujawnić zmiany funkcjonalne lub morfologiczne spowodowane mutacją. Inną metodą jest umieszczenie dodatkowych kopii niezmienionego genu typu dzikiego w celu zbadania skutków nadekspresji, która często może być równie szkodliwa jak mutacja. Innym podejściem jest wstawienie białka fuzyjnego, które zawiera wizualizowalny znacznik, taki jak zielone białko fluorescencyjne, w celu śledzenia lokalizacji i czasu ekspresji genów u żywych zwierząt.

Segment DNA, który zostanie wstawiony do genomu, musi być starannie zaprojektowany, aby uzyskać pożądane wzorce ekspresji i wyniki. Promotor, który jest elementem sekwencji, który dyktuje, kiedy i gdzie gen ulega ekspresji, jest kluczowym komponentem. Niektóre promotory są wszechobecne w prawie wszystkich tkankach, podczas gdy inne są aktywne tylko w określonych tkankach. Indukowalne promotory, które są aktywowane przez podawanie chemiczne lub ekspozycję na wysokie temperatury, mogą być również używane do kontrolowania czasu ekspresji genów.

Aby uzyskać stabilną ekspresję w tkankach, transgen musi najpierw zintegrować się z genomem. Aby to osiągnąć, transgeny mogą zawierać flankujące sekwencje DNA, które pasują do obszarów genomu organizmu. Dzięki temu transgen może zintegrować się z DNA gospodarza w procesie znanym jako rekombinacja homologiczna. Alternatywnie, u niektórych gatunków specjalne elementy zwane transpozonami mogą sprawić, że transgeneza będzie bardziej efektywna poprzez włączenie miejsc rozpoznawania enzymu transpozy, który katalizuje losową insercję transgenu do genomu.

Teraz, gdy znasz już podstawy projektowania transgenów, przyjrzyjmy się, jak stworzyć transgeniczne zwierzę. Aby stworzyć konstrukt transgenu, zacznij od amplifikacji interesującego genu za pomocą PCR. Ten amplifikowany region jest następnie klonowany do wektora, który jest fragmentem DNA, który może przenosić transgen do komórek. Wektory zazwyczaj zawierają elementy, które umożliwiają wydajną amplifikację transgenu przy użyciu bakterii, takich jak E. coli. Po tym etapie amplifikacji wektor jest oczyszczany z kultury bakteryjnej.

Zwierzęta transgeniczne są wytwarzane poprzez wstrzykiwanie oczyszczonego DNA do embrionów. U ryb i żab konstrukty są zwykle wstrzykiwane bezpośrednio do żółtka lub cytoplazmy zarodków w stadium jednokomórkowym. W przypadku transgenezy, w której pośredniczy transpozon, do mieszaniny iniekcyjnej dodaje się transkrypt kodujący enzym transpozazy.

U myszy transgenezę można przeprowadzić poprzez manipulację nowo zapłodnionymi komórkami jajowymi, w których plemniki i przedjądrza komórki jajowej jeszcze się nie połączyły. Konstrukt jest wstrzykiwany bezpośrednio do większego przedjądrza, gdzie może integrować się z genomem podczas podziału komórki. Jaja muszą następnie zostać przeszczepione do macicy samicy w ciąży rzekomej w celu rozwoju.

Skuteczność transgenezy jest różna, dlatego zwierzęta muszą być poddawane badaniom przesiewowym w celu zidentyfikowania potomstwa, w którym konstrukt z powodzeniem zintegrował się z genomem. Można to zrobić, szukając znacznika fluorescencyjnego, który został wstawiony w celu łatwej identyfikacji, lub poprzez analizy molekularne, takie jak PCR genomowego DNA wyizolowanego z małych fragmentów tkanki.

Drugie podejście do inżynierii genetycznej koncentruje się na ukierunkowaniu na określone geny w celu zakłócenia funkcji genów. Istnieje wiele podejść do osiągnięcia tego celu. Jedna stosunkowo nowa metoda, znana jako edycja genomu, wykorzystuje enzymy specyficzne dla sekwencji zwane nukleazami, które przecinają szkielet DNA i powodują mutacje w genach podczas naprawy DNA.

Inna metoda celowania polega na zastosowaniu rekombinacji homologicznej w celu zastąpienia genu obcym DNA lub kopią genu otoczoną sekwencjami rozpoznającymi enzymy znane jako rekombinazy. Gdy rekombinazy są obecne, sekwencja z bokami zostanie wycięta z genomu. Jest to znane jako warunkowy nokaut, a kontrolę wycięcia genu można osiągnąć poprzez ekspresję enzymu w określonych tkankach lub w określonych punktach czasowych.

Przyjrzyjmy się ogólnej procedurze generowania myszy z nokautem przez rekombinację homologiczną. W tym przypadku należy przygotować konstrukt, w którym część sekwencji genomowego DNA jest zastępowana obcym DNA. To DNA często koduje inny gen, na przykład oporność na antybiotyki, który umożliwia selekcję pomyślnie zmodyfikowanych komórek w późniejszych etapach.

Aby rozpocząć procedurę, embrionalne komórki macierzyste są pobierane z wewnętrznej masy komórkowej wczesnego zarodka myszy, znanego jako blastocysta. Zlinearyzowany konstrukt jest następnie dostarczany do komórek macierzystych za pomocą elektroporacji, w której impulsy elektryczne generują przejściowe pory w błonie komórkowej. Komórki są następnie poddawane inkubacji w obecności antybiotyku w celu wyeliminowania komórek bez transgenu.

Po tym etapie selekcji komórki macierzyste mogą zostać wstrzyknięte do innego zarodka myszy w stadium blastocysty. Zarodki są następnie przenoszone do macicy samicy myszy w celu dalszego rozwoju. Powstałe szczenięta będą chimerami, które składają się zarówno z komórek typu dzikiego, jak i nokautującego. Niektóre chimery będą miały komórki nokautujące w swojej linii zarodkowej, które będą przekazywać uszkodzony gen podczas hodowli, co z kolei ustanowi nową linię nokautu.

Nauczyłeś się podstaw inżynierii genetycznej modeli rozwojowych, więc teraz przyjrzyjmy się kilku praktycznym zastosowaniom.

Badania rozwojowe często wykorzystują białka znakowane fluorescencyjnie do identyfikacji komórek i badania ich rozwoju. Wykorzystując specyficzne tkankowo promotory, organizmy transgeniczne mogą być modyfikowane w celu ekspresji białek fluorescencyjnych w określonych komórkach, takich jak grzebień nerwowy. Korzystając z zaawansowanych technik obrazowania, komórki fluorescencyjne mogą być obrazowane w czasie rzeczywistym, co pozwala naukowcom na bezpośrednią wizualizację złożonych zdarzeń rozwojowych.

Innym ważnym zastosowaniem inżynierii genetycznej jest badanie konkretnych genów i ich roli w fenotypach choroby. W tym przypadku ukierunkowane mutacje są wprowadzane do określonego genu myszy za pomocą nukleaz, takich jak TALEN. PCR pokazuje, czy mysz ma zero, jedną lub dwie zmutowane kopie genu. Zarodki zawierające dwie zmutowane kopie mogą być teraz szczegółowo badane w celu określenia funkcji rozwojowej genu.

Korzystając z warunkowych nokautów, naukowcy mogą określić funkcję genu w ograniczonym zestawie komórek. W tym przypadku gen po bokach loxP ulegał ekspresji w całym zarodku, ale Cre ulegał ekspresji tylko w komórkach śródbłonka, powodując delecję genu w sercu i naczyniach krwionośnych. Ten specyficzny tkankowo nokaut spowodował mierzalną zmianę w częstości akcji serca w zarodku i ilustruje, jak testować zlokalizowaną rolę genu bez zmiany całego organizmu.

Właśnie obejrzeliście wprowadzenie JoVE do technologii transgenicznej. Techniki te pomagają zrozumieć podstawy inżynierii genetycznej, niektóre z metod, które są z nią związane oraz sposób, w jaki jest ona stosowana w codziennej nauce. Inżynieria genetyczna może być szeroko stosowana w wielu organizmach i nadal będzie ważnym narzędziem do badania i zrozumienia roli genetyki w chorobach rozwojowych, a także tych, które pojawiają się w wieku dorosłym. Dzięki za oglądanie!