Repopulacja komórek nabłonkowych i przygotowanie rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej gryzoni do rozwoju tkanki nerkowej

Ogólnym celem tej procedury jest ponowne zasiedlenie bezkomórkowych trójwymiarowych rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej nerek gryzoni ludzkimi komórkami nabłonka nerkowego. Osiąga się to poprzez pierwszą decelularyzację, nerkę szczura haw z serią roztworów detergentów przenikających przez tętnicę nerkową przez okres 26 godzin. Nerka jest następnie sterylizowana, a bezkomórkowe rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej nerki są wstrzykiwane z 40 milionami ludzkich komórek nabłonka kanalików korowych lub RCTE pod ciągłą perfuzją tętniczą w specjalnie zaprojektowanym systemie reaktora Biore.

Ostatecznie zdolność komórek RCTE do ponownego zasiedlenia rusztowania nerkowego można ocenić za pomocą testu ER i perfuzji oraz analizy immunohistochemicznej. Ta technika hodowli komórkowej 3D pozwala badaczom na ponowne zasiedlenie macierzy zewnątrzkomórkowej całego narządu. Komórki rusztowania są osadzane w przestrzeni okołorurkowej w macierzy zewnątrzkomórkowej, aby umożliwić badanie i wiązanie czynników, które wpływają na wzrost, różnicowanie i dojrzewanie komórek.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z alternatywnymi metodami, takimi jak wytwarzanie syntetycznych rusztowań polimerowych, jest to, że macierz zewnątrzkomórkowa nerek ułatwia adhezję, proliferację i dojrzewanie perfundowanych komórek w skomplikowanej sieci naturalnych białek strukturalnych, czynników wzrostu i innych składników biologicznych. Procedurę decelularizacji należy rozpocząć od połączenia cewnika tętnicy nerkowej każdej rozmrożonej nerki z końcem rurki obwodu perfuzyjnego znajdującej się za pompą, upewniając się, że w cewniku nie są uwięzione pęcherzyki powietrza. Jeśli w cewniku znajdują się pęcherzyki powietrza, użyj mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby wyciągnąć pęcherzyki i napełnić cewnik płynem.

Zawieś nerkę wzdłuż wewnętrznej ściany pustej pięciolitrowej zlewki, tak aby tętnica nerkowa nie była zagięta ani zwinięta i wyreguluj napęd pompy na pięć mililitrów na minutę. Następnie naciśnij start po potwierdzeniu, że każda nerka ulega perfuzji, obserwując kapanie roztworów z dna narządu oraz każdej nerki z odpowiednimi roztworami, jak oznaczono na schemacie blokowym na końcu perfuzji, przechowuj pozbawione komórek nerki w PBS w 50-mililitrowej stożkowej probówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub maksymalnie dwóch. Po zmontowaniu obwodu perfuzyjnego zdejmujemy czerwoną nakrętkę z głowicy bioreaktora i pipetujemy 50 mililitrów 0,1% roztworu kwasu octowego, 4% etanolu do zbiornika pożywki przez otwór.

Za pomocą dużego wkładu pompy podłącz segment rurki pompy perystaltycznej do głowicy pompy. Następnie dostosuj natężenie przepływu do pięciu mililitrów na minutę. Naciśnij start i pozwól, aby obwód zalał, gdy ciecz wypełni linię obfitości i dotrze do pozostałego otwartego portu trójdrożnego kurka odcinającego.

Użyj męskiej wtyczki przynęty, aby podłączyć port. Pozwól, aby obwód całkowicie zalał, aż nie zaobserwuje się powietrza w rurce obwodu perfuzyjnego lub po wewnętrznej stronie wlotu. Akceptor przynęty usuwa pęcherzyki z obwodu perfuzyjnego poprzez tymczasowe zwiększenie natężenia przepływu pompy.

Gdy system jest całkowicie zalany, zatrzymaj napęd pompy i wysterylizuj sześciocalowe kleszcze. Aby ostrożnie podłączyć żeński koniec przynęty cewnika tętnicy nerkowej do wlotu męskiego, zwabić akceptor na wewnętrzną powierzchnię głowicy bioreaktora, upewniając się, że połączenie jest szczelne i że w cewniku nie pozostało powietrze. Pozwól, aby nerka delikatnie zwisała z cewnika tętnicy nerkowej, aby tętnica nerkowa nie skręcała się ani nie załamywała.

Następnie dokręć metalowy zacisk mocujący głowicę i korpus bioreaktora razem, tak aby zbiornik bioreaktora był szczelnie zamknięty i zamknij nakrętkę. Teraz wysterylizuj nerki perfuzją roztworu etanolu na kwas octowy w temperaturze pokojowej z prędkością pięciu mililitrów na minutę. Po godzinie zatrzymaj pompę i otwórz czerwoną nakrętkę.

Używając sterylnego szkodnika, pipeta ostrożnie odessuje cały roztwór ze zbiornika bioreaktora. Następnie odpipetować 50 mililitrów świeżego PBS do zbiornika bioreaktora. Zamknij nakrętkę i uruchom pompę na trzy sekwencyjne jednogodzinne perfuzje w temperaturze pokojowej z prędkością pięciu mililitrów na minutę.

Po ostatnim płukaniu PBS odessać sól fizjologiczną ze zbiornika i dodać 50 mililitrów pożywki do zbiornika z zamkniętą nakrętką. Przenieś bioreaktor z dołączonym obwodem perfuzyjnym do inkubatora o dużej pojemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie podłącz obwód perfuzyjny bioreaktora do pompy i perfekuj nerki z prędkością czterech mililitrów na minutę przez co najmniej godzinę przed wysiewem.

Aby uzyskać celulatorzę, nerki zbierają wystarczającą liczbę kolb hodowlanych, aby uzyskać pożądane stężenie siedzenia. Następnie, po zassaniu pożywki hodowlanej z każdej kolby, użyj 10 mililitrów odpowiedniego enzymu dysocjującego komórki, aby podnieść komórki nabłonka kanalików korowych nerki z kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 10 minutach zacznij sprawdzać kolby pod mikroskopem kontrastowym twarzy co dwie minuty, aż do zaobserwowania oderwania fałd.

Następnie, po pobraniu małej porcji komórek do liczenia, rozcieńczyć powiązaną zawiesinę komórkową w równej objętości pożywki przedmedycznej i odwirować resztki komórek. Zawiesić osad z odpowiednią objętością pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie dwa razy 10 do siódmych komórek na mililitr. Przenieś dwa mililitry zawieszenia do siedzenia, 35-milimetrową naczynie hodowlane, a następnie narysuj dwumililitrową objętość do sterylnej pięciomililitrowej strzykawki.

Przenieść bioreaktor perfuzyjny do komory bezpieczeństwa biologicznego i przekręcić zawór odcinający, aby zamknąć przepływ do portu gniazda. Usuń ślizg męskiej przynęty, zatkaj z kurka odcinającego i podłącz strzykawkę. Następnie szybko przenieś obwód perfuzyjny z powrotem do inkubatora i użyj dużego wkładu pompy, aby przymocować segment rurki pompy perystaltycznej do głowicy pompy, aby osadzić komórki.

Zamknij otwór zaworu kurka odcinającego skierowany w stronę pompy i powoli wstrzyknij komórki do rusztowania nerkowego. Następnie przekręć zawór odcinający, aby zamknąć przepływ ze strzykawki i uruchom pompę z prędkością 25 mililitrów na minutę. Po 15 minutach zmniejsz natężenie przepływu pompy do czterech mililitrów na minutę, wymieniając medium następnego dnia, a następnie co dwa dni.

Aby ocenić żywotność i proliferację komórek, należy aseptycznie wymienić pożywkę hodowlaną z 10 mililitrami roztworu roboczego zarynu na perfuzję rusztowań nerkowych z prędkością czterech mililitrów na minutę dokładnie po jednej godzinie, zebrać kondycjonowany i częściowo zredukowany roztwór zarynu i wykonać kolejną perfuzję o pojemności czterech mililitrów na minutę. Przy 100 mililitrach świeżej hodowli, średnie nerki kolejno obficie nalewane wodą i rozcieńczonymi roztworami detergentów stawały się stopniowo bardziej przezroczyste w ciągu 26 godzin przez końcową perfuzję detergentu, sieć naczyniową nerek, a w szczególności naczynia międzypęcherzykowe są wyraźnie widoczne w rusztowaniu bez celulozy. Cały narząd zostaje oczyszczony z komórek natywnych, pozostawiając nienaruszoną sieć błony podstawnej kanalików kłębuszkowych i przewodów zbiorczych oraz macierzy zewnątrzkomórkowej zdecelulizowanych naczyń krwionośnych.

Oprócz większych naczyń, błony podstawne mikronaczyń w kłębuszkach nerkowych również zachowują swoją integralność strukturalną. Komórki RCTE wysiane do rusztowania nerkowego, jak właśnie wykazano, znajdują się głównie w obszarach korowych rusztowania nerkowego, gdzie preferencyjnie ponownie zasiedlają kanaliki kłębuszkowe Pereg. Niewiele komórek osadza się w kłębuszkach nerkowych pierwszego dnia po wysiewie, a w siódmym dniu kłębuszki są praktycznie pozbawione komórek, podczas gdy większość tych komórek zajmuje obszary korowe macierzy zewnątrzkomórkowej nerek.

Po siedmiu dniach hodowli perfuzyjnej antegrade wiele kanalików liniowych RCTE jest obecnych w zewnętrznych kanalikach szpikowych i brodawkowatych oraz zbiera kaczki po ponownym zasiedleniu komórek RCTE i tygodniu hodowli perfuzyjnej. Jednak przezroczystość obserwowana po decelularyzacji zostaje utracona, a nerka wydaje się nieprzezroczysta i bliższa wyglądowi swojemu pierwotnemu stanowi. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza immunochemiczna kondycjonowanych pożywek hodowlanych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: w jaki sposób zmieniają się stany metaboliczne lub fenotypowe tych komórek w macierzy zewnątrzkomórkowej nerek?

Zdolność do tworzenia rusztowań zewnątrzkomórkowych i przywracania sprzedaży dawców do macierzy pozwala naukowcom na określenie wzrostu i dojrzewania w trzech wymiarach w naturalnych rusztowaniach egzomatrycy nerkowej. Ostatecznym celem jest wykorzystanie tej technologii jako narzędzia do lepszego zrozumienia mechanizmów naprawy i regeneracji nerek.