Produkcja mechanicznie przestrajalnych i bioaktywnych rusztowań metalowych do zastosowań biomedycznych

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie mechanicznie regulowanych i bioaktywnych rusztowań metalowych do zastosowań biomedycznych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie implantów ortopedycznych, takie jak możliwość zastosowania mechanicznie regulowanego rusztowania metalowego zdolnego do dostarczania leków. Ta metoda gentryfikacji jest prosta, ponieważ wymaga jedynie jednej kontroli.

Parametry te zapewniają zarówno wzmocnienie mechaniczne, jak i zrównoważone uwalnianie leku, a także umożliwiają wytwarzanie funkcjonalnych struktur porowatych. W pierwszej kolejności wymieszać odpowiednie ilości proszku tytanowego, kofeiny i KD 4 w celu przygotowania porowatych rusztowań tytanowych o czterech początkowych poziomach porowatości w polietylenowych butelkach o pojemności 500 ml. Butelki należy obracać w piecu z młynem kulowym z prędkością 30 RPM w temperaturze 55 °C przez 30 minut. Następnie przelać zawiesiny z butelek polietylenowych do cylindrycznych form aluminiowych o średnicy i wysokości 60 mm.

Po zamknięciu każdej aluminiowej formy aluminiową płytką przykrywkową, rotuj formy w piecu do młyna kulowego z prędkością 30 RPM w temperaturze 55 °C przez 10 minut. Następnie obniż temperaturę pieca do młyna kulowego do 44 °C i rotuj formy w sposób ciągły z prędkością 30 RPM w temperaturze 44 °C przez 12 godzin. Po schłodzeniu form poprzez rotację w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, wyjmij je z pieca do młyna kulowego.

Następnie wyjmij zastygły zielony korpus z tytanu i kofeiny z każdej aluminiowej formy za pomocą aluminiowego tłoka. Po tym kroku umieść zastygły zielony korpus z tytanu i kofeiny w gumowej torebce i całkowicie ją zamknij, zawiązując sznurkiem.

Umieść gumowy worek w zbiorniku wodnym maszyny do zimnego prasowania izostatycznego i zastosuj ciśnienie izostatyczne 200 megapascals przez 10 minut. Po wyjęciu gumowego worka z maszyny, usuń zeń sprasowany zielony ciało. Przenieś zielone ciało tytanu z kofeiną do tygla Illumina.

Umieść tygiel w liofilizatorze i poddaj zielony korpus liofilizacji w temperaturze -40 °C przez 24 godziny, aby przeprowadzić sublimację fazy kofeiny. Po liofilizacji zamknij tygiel za pomocą szkiełka nakrywkowe Illumina. Umieść zamknięty tygiel w piecu próżniowym w temperaturze pokojowej.

Następnie zwiększyć temperaturę pieca do 1300 °C z szybkością grzania 5 °C na minutę. Wysuszone na powietrzu próbki w stanie surowym (tzw. zielone ciała) są zazwyczaj kruche i mogą ulec zniszczeniu. Podczas manipulowania nimi należy zachować szczególną ostrożność.

Po utrzymaniu temperatury 1300 stopni Celsjusza przez dwie godziny, pozostaw wycentrowany porowaty tytan w piecu od sześciu do siedmiu godzin, aż piec całkowicie ostygnie do temperatury pokojowej. Po wyjęciu próbek z pieca, obrobb maszynowo próbki w celu przygotowania mniejszych okazów i przenieś je do zlewki szklanej. Umieść zlewkę w autoklawie i wysterylizuj próbki w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po zakończeniu przemyj zsterylizowane próbki dwukrotnie wodą destylowaną i dwukrotnie 70% etanolem. Następnie umieść porowaty tytan w szalce Petriego i pozostaw próbki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej pod światłem UV. W tym momencie rozcieńcz zielone białko fluorescencyjne (GFP) do stężenia 100 µg/ml, mieszając 1 ml białka z 9 ml roztworu soli fosforanowej PBS firmy ECCO. W sterylnej probówce polistyrenowej o pojemności 50 ml zanurz porowaty tytan w rozcieńczonym roztworze GFP w temperaturze pokojowej.

Następnie natychmiast umieść próbkę w deskryptorze próżniowym i usuń powietrze z naczynia przez 10 minut. Aby zapewnić skuteczniejszą penetrację porów tytanu porowatego przez roztwór GFP, wyjmij zbiór szklany z deskryptora. Następnie za pomocą pęsety wyjmij tytan porowaty ze zbiornika szklanego.

Umieść porowaty tytan pokryty GFP w szalce Petri o średnicy 10 centymetrów i pozostaw do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnego dnia wypłucz porowaty tytan dwukrotnie 10 mililitrami soli fizjologicznej PBS firmy ECCOs w szklance. Następnie, używając pęsety, umieść porowaty tytan w szalce Petri o średnicy 10 centymetrów i pozostaw do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie umieść próbki porowatego tytanu pokrytego GFP o różnych wysokościach w cylindrycznej formie stalowej i wprowadź zestaw wyciisków do górnych i dolnych otworów formy stalowej.

Ściśnij porowaty tytan w stalowym oprzyrządowaniu formierskim w temperaturze pokojowej w kierunku Z próbki. Użyj prasy przy pośrednich prędkościach odkształcania od 0,05 do 0,1 s⁻¹ zgodnie z wcześniej określonymi wartościami przyłożonego odkształcenia. Utrzymaj nacisk przez jedną minutę.

Wyjmij matrycę z prasy. Umieść stalowy pierścień na spodzie korpusu matrycy i ponownie włóż ją do prasy. Po odwróceniu matrycy powoli wywieraj nacisk, aż tłok wypchnie zagęszczone próbki z otworu D, a następnie wyjmij matrycę z prasy.

Wyjmij zagęszczone próbki tytanu z stalowej formy. Na koniec przemyj zagęszczone próbki dwukrotnie 10 mililitrami fosforanu buforu soli fizjologicznej ECCOs w zlewce i pozostaw do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Struktura porów tytanu uzyskana za pomocą konwencjonalnego odlewania mrożeniowego wykazuje kierunkowe uporządkowanie porów o nieregularnych kształtach ze względu na dendrytyczny wzrost kofeiny.

Podczas zamrażania próbka z dynamicznego odlewania mrozowego wykazuje prawie sferyczne pory o losowym rozkładzie; kształt porów staje się spłaszczony wraz ze wzrostem stopnia zagęszczania, a przy najwyższym zagęszczeniu pory niemal całkowicie zanikają, ponieważ sąsiednie pory stykają się ze sobą. Cztery próbki o różnej porowatości wykazują różne wysokości początkowe przed zagęszczaniem i niemal identyczne wysokości po zagęszczaniu. Zarówno w wgłębieniach, jak i w porowatym tytanie stwierdzono szybkie uwalnianie GFP z początkowym efektem gwałtownego wyrzutu, przy czym większość białka została uwolniona w ciągu jednego tygodnia.

Zagęszczony porowaty tytan wykazuje ciągłe uwalnianie przez okres do jednego miesiąca, co wyraźnie potwierdza obecność GFP na powierzchni nawet po upływie miesiąca. W przypadku rusztowania z gęstszym rdzeniem, część zewnętrzna została skrócona poprzez obróbkę mechaniczną. Obraz mikro-tomografii komputerowej (micro CT) po selektywnym zagęszczeniu wyższej części wewnętrznej przedstawia części wewnętrzną i zewnętrzną rusztowania o różnej porowatości; porowaty tytan z wyższą częścią zewnętrzną i niższą wewnętrzną prowadzi do powstania gęstszej części zewnętrznej po zagęszczeniu, w której porowatość części zewnętrznej została obniżona, podczas gdy część wewnętrzna zachowała początkową porowatość po opanowaniu procesu.

Technikę tę można przeprowadzić w ciągu 72 godzin, jeśli zostanie ona właściwie wykonana po etapie opracowania. Metoda ta utorowała badaczom z dziedziny biomateriałów drogę do zbadania możliwości wytwarzania metalogii o określonych właściwościach mechanicznych oraz związanych z lekami właściwościach służących do leczenia urazów kręgosłupa. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię urazów kręgosłupa, ponieważ wytworzone rusztowanie może pełnić funkcję sztucznej protezy dysku z możliwością dostarczania leku.