2.4: Wprowadzenie do molekularnej biologii rozwoju

Badania z zakresu molekularnej biologii rozwoju dostarczają informacji na temat zmian, jakie zachodzą na poziomie komórkowym podczas różnicowania i rozwoju. Naukowcy badają fizyczne i chemiczne mechanizmy, które regulują funkcje komórek. Pomaga to w zrozumieniu, w jaki sposób komórki dają początek wyspecjalizowanym tkankom w dojrzewającym zarodku i jak defekty na poziomie molekularnym mogą prowadzić do stanów chorobowych.

Ten film przedstawia krótką historię molekularnej biologii rozwoju, przedstawia kluczowe pytania zadawane przez naukowców w tej dziedzinie, opisuje niektóre dostępne narzędzia do odpowiedzi na te pytania oraz omawia kilka aktualnych zastosowań laboratoryjnych.

Zacznijmy od przeglądu kilku przełomowych badań w historii badań nad molekularną biologią rozwoju.

W 1957 roku Conrad Waddington opublikował książkę zatytułowaną "The Strategy of the Genes", w której próbował wyjaśnić, w jaki sposób decyduje się o losie komórki. Opierając się na wcześniej przeprowadzonych badaniach transplantacji tkanek, przedstawił model koncepcyjny opisujący, że komórka jest jak kulka staczająca się ze wzgórza, a droga, jaką pokona, aby dotrzeć do dna, określi jej ostateczny stan zróżnicowany. Pomysł, że odrębne typy komórek powstają z niezróżnicowanych komórek otrzymujących różne sygnały podczas rozwoju, stał się znany jako "krajobraz epigenetyczny".

Mniej więcej w tym samym czasie Rita Levi-Montalcini i Stanley Cohen zaobserwowali, że przeszczepianie guzów do zarodków piskląt prowadzi do szybkiego wzrostu neuronów. Postawili hipotezę, że substancja wydzielana przez guzy powoduje ten wzrost i zidentyfikowali białko jako czynnik wzrostu nerwów lub NGF. Wkrótce potem Cohen odkrył kolejny czynnik wzrostu, który był wydzielany przez gruczoły ślinowe myszy i promował wzrost komórek nabłonkowych. Zidentyfikował to białko jako naskórkowy czynnik wzrostu lub EGF.

Później, w 1969 roku, Lewis Wolpert zaproponował teorię o tym, jak pewna klasa cząsteczek sygnałowych, znanych jako morfogeny, działa bezpośrednio na komórki, wywołując określone reakcje w różnych stężeniach. Użył kolorów flagi francuskiej do modelowania stanów komórek, przy czym czerwony służył jako stan domyślny, gdy nie ma sygnału. Stamtąd niskie stężenia morfogenu, pokazane na biało, mogą aktywować jeden gen, podczas gdy wysokie stężenia morfogenu, pokazane na niebiesko, mogą aktywować inny gen.

Rozwijając tę pracę, w 1988 roku Christiane Nusslein-Volhard zidentyfikowała pierwszy znany morfogen, przeprowadzając genetyczne badania przesiewowe na muchach. Użyła przeciwciał, aby wykazać, że białko, znane jako Bicoid, tworzy gradient stężeń wzdłuż osi przednio-tylnej rozwijającego się zarodka i kontroluje ekspresję genów ważnych dla organizacji obszarów głowy i klatki piersiowej.

Na początku lat dziewięćdziesiątych Peter Lawrence i Gin's Morata wykorzystali swoje własne badania na muchach, aby rozszerzyć teorię gradientów morfogenów. Postawili hipotezę, że jeden zestaw komórek jest odpowiedzialny za organizację jednego konkretnego przedziału organizmu. W miarę postępu rozwoju sygnały molekularne instruują te komórki, aby dzieliły się i konstruowały więcej kompartmentów, kontynuując, aż do uformowania się całego organizmu.

Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu kilku najważniejszych wydarzeń historycznych, przyjrzyjmy się kilku fundamentalnym pytaniom zadawanym przez współczesnych biologów rozwojowych.

Na początek niektórzy badacze skupiają się na identyfikacji cząsteczek, które regulują rozwój. Na przykład, mogą badać pojedyncze czynniki wzrostu lub ich kombinacje, które powodują określoną odpowiedź komórki, taką jak różnicowanie lub migracja.

Inni biolodzy zajmujący się rozwojem badają, w jaki sposób te cząsteczki regulują proces rozwoju. Mogą badać, w jaki sposób stężenie sygnału molekularnego może poinstruować komórkę, aby się różnicowała lub migrowała. Pytają również o to, w jaki sposób komórki komunikują się z innymi pobliskimi komórkami i przyglądają się cząsteczkom sygnałowym, które dyfundują na niewielką odległość i działają lokalnie, znane jako czynniki parakrynne.

Wreszcie, niektórzy biolodzy rozwojowi chcą zrozumieć, w jaki sposób komórki reagują na sygnały zewnętrzne. Mogą badać zmiany wewnątrz samej komórki, takie jak wzrost lub spadek ekspresji poszczególnych genów, patrząc na poziomy kodowanych w nich białek. Inni koncentrują się na zmianach zewnętrznych, takich jak zmiany w kształcie lub rozmiarze komórki.

Teraz, gdy znasz już kluczowe pytania zadawane przez biologów rozwoju molekularnego, przyjrzyjmy się niektórym technikom, których używają, aby znaleźć odpowiedzi na te pytania.

Barwienie jest jednym z najczęściej stosowanych podejść do badania wzorców ekspresji genów i identyfikacji cząsteczek regulujących rozwój.

Immunohistochemia to technika barwienia, która wykorzystuje przeciwciała sprzężone z reporterami chemicznymi lub fluorescencyjnymi do znakowania białek. Wizualizacja białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej daje wgląd w ich lokalizację w skrawkach tkanek, a także ich potencjalny wkład w struktury komórkowe. Hybrydyzacja in situ typu whole-mount jest alternatywną metodą barwienia, która wykorzystuje znakowane oligonukleotydy DNA lub RNA do przyjrzenia się wzorcom ekspresji genów w tkankach trójwymiarowych.

Hodowla eksplantatów to kolejne powszechnie stosowane podejście w tej dziedzinie do badania mechanizmów, za pomocą których działają bodźce zewnętrzne. W tej technice tkanka jest usuwana z naturalnego miejsca wzrostu i hodowana w kulturze. Określone warunki wzrostu, takie jak substrat na płytkach hodowlanych lub czynniki wzrostu dodane do pożywki, można następnie zbadać pod kątem ich wpływu na rozwijające się komórki i tkanki.

Obrazowanie żywych komórek służy do analizy reakcji komórek na bodźce rozwojowe. Hodowle in vitro doskonale nadają się do rejestrowania ruchów komórek i wzorców lokalizacji w czasie rzeczywistym. Barwione lub znakowane fluorescencyjnie komórki można również śledzić in vivo za pomocą mikroskopii poklatkowej.

Często komórki z tkanki będącej przedmiotem zainteresowania są przeszczepiane od dawcy do organizmu gospodarza, a następnie monitorowane w trakcie rozwoju.

Teraz, gdy jesteś już zaznajomiony z niektórymi ogólnymi metodami laboratoryjnymi, przyjrzyjmy się niektórym zastosowaniom badań nad biologią rozwoju molekularnego.

Jednym z podejść do określenia roli, jaką odgrywają określone produkty genowe w rozwoju, jest zmiana ich ekspresji za pomocą środków zewnętrznych. W tym eksperymencie wstrzyknięto oligonukleotydy antysensowne zwane morpholinos, aby zniszczyć dwa geny danio pręgowanego ważne dla prawidłowego rozwoju ucha wewnętrznego. Barwienie immunologiczne białek strukturalnych wykazało, że zarodki o zmniejszonej ekspresji genów wykazują mniej neuronów i komórek rzęsatych w uchu wewnętrznym w porównaniu z grupą kontrolną.

Innym zastosowaniem molekularnej biologii rozwojowej jest ustalenie, kiedy i gdzie geny ulegają ekspresji, aby lepiej zrozumieć, jak mogą funkcjonować ich kodowane białka. Naukowcy w tym eksperymencie wykorzystali znakowane fluorescencyjnie sondy RNA komplementarne do dwóch docelowych transkryptów w celu zidentyfikowania komórek transkrybujących jeden lub oba interesujące ich geny.

Niektórzy naukowcy używają kultur eksplantatów do analizy reakcji komórek w różnych warunkach. W tym eksperymencie badacze wypreparowali neurony czuciowe z ucha wewnętrznego zarodków piskląt i hodowali je przez kilka godzin. Następnie kultury zamieniono na pożywki zawierające kulki białkowe. Poklatkowe obrazy konfokalne po inkubacji ze znakowanymi przeciwciałami ujawniły, że białka na kulkach sprzyjały wzrostowi wypustek z ciał komórek neuronów.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do molekularnej biologii rozwoju. W tym filmie dokonaliśmy przeglądu historii badań nad biologią molekularną rozwoju i przedstawiliśmy kluczowe pytania zadawane przez biologów rozwojowych. Przyjrzeliśmy się również najważniejszym strategiom badawczym i omówiliśmy niektóre z ich obecnych zastosowań. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!