Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zrewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej w celu określenia wpływu zmienionej ekspresji genów na wzrost i różnicowanie naskórka. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie dermatologii, takie jak określenie, które geny są odpowiedzialne za wzrost, różnicowanie i postęp choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że genetycznie zmieniona ludzka skóra jest generowana w ciągu kilku dni, co pozwala na badanie próbek ludzkich, które są potencjalnie istotne klinicznie.

Demonstracja procedury będzie jingly z mojego laboratorium. W przypadku zamrożonej ludzkiej skóry umieść tkankę w kapturze do hodowli tkanek na trzy do pięciu minut do rozmrożenia. Po rozmrożeniu przenieś tkankę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów lub butelki o pojemności 125 mililitrów, w zależności od wielkości.

Następnie dodaj cztery x penicylina i streptomycyna w jednym XPBS, aż pojemnik będzie wypełniony w 75%. Zakręć pojemnik i energicznie wstrząsaj przez pięć minut. Usuń roztwór antybiotyku i powtórz tę czynność.

Po ostatnim praniu wykonaj jeszcze trzy kroki, przenieś chusteczkę do nowego pojemnika i dodaj świeży roztwór antybiotyku. Inkubuj tę mieszaninę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa tygodnie, aby umożliwić oddzielenie skóry właściwej od naskórka. Po upływie dwóch tygodni użyj kleszczy, aby oderwać naskórek od skóry właściwej.

Wyrzuć naskórek zgodnie z protokołem postępowania z tkanką ludzką instytucji. Umieść skórę właściwą w pojemniku z roztworem antybiotyku i umyj energicznym potrząsaniem jak poprzednio. Po ostatnim myciu przenieś skórę właściwą do nowego pojemnika z roztworem antybiotyku i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu gotowości do użycia dzień przed transfekcją nasion komórek feniksa w kompletnych pożywkach na sześciodołkową płytkę o gęstości 800 000 komórek na dołek.

W dniu transfekcji zmieszać sześć mikrolitrów odczynnika do transfekcji ze 100 mikrolitrami dmm. Dla każdej studzienki, która ma być transfekowana i inkubowana w temperaturze pokojowej Przez pięć minut dodać mieszaninę do probówki zawierającej trzy mikrogramy wektora retrowirusowego dla każdej studzienki, która ma być transfekowana i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, dodawać całą mieszaninę kroplami do każdej studzienki komórek feniksa i inkubować komórki przez noc następnego dnia po transfekcji. Usuń pożywkę z komórek feniksa i dodaj dwa mililitry świeżej, kompletnej pożywki tego samego dnia.

Zawiesić pierwotne ludzkie keratynocyty w pożywce wolnej od keratynocytów z antybiotykami i nasionami do sześciu płytek ściennych o gęstości 75 000 komórek na studzienkę. Następnego dnia zbierz pożywkę, która teraz zawiera cząsteczki wirusa z transfekowanych komórek Phoenixa. Przepuść pożywkę przez filtr 0,45 mikrona za pomocą strzykawki, aby usunąć wszelkie zanieczyszczające komórki.

Dodaj pięć mikrogramów na mililitr bromku heksadimetylu do przefiltrowanej pożywki zawierającej wirusa, aby pomóc w procesie infekcji. Następnie pipetować dwa mililitry wirusa na keratynocyty posiane poprzedniego dnia. Następnie wiruj sześć płytek ściennych w wirówce o stężeniu 200 g przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu wyjmij i wyrzuć nośnik zawierający wirusa. Umyj ogniwa raz jednym XPBS, a następnie dodaj świeży K-C-S-F-M następnego dnia. Zainfekuj tę samą partię keratynocytów wirusem, postępując zgodnie z procedurą przedstawioną powyżej.

Do produkcji kaset organotypowych. Użyj kauteryzacji, aby usunąć kwadrat o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr ze środka pokrywki 3,5-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej. Przymocuj kwadratowe kołki do dolnej części kasety za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci i odczekaj pięć minut, aż lakier do paznokci wyschnie.

Na koniec odwróć kasetę i umieść ją w sześciocentymetrowym naczyniu z kasetą opartą na kołkach. Wyjmij skórę właściwą z magazynu w czterech stopniach Celsjusza i przenieś ją do pojemnika ze wzrostem keratynocytów. Średni do prania.

Po powtórzeniu mycia umieść skórę właściwą w świeżym KGM i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni. Po inkubacji za pomocą skalpela pokrój skórę właściwą na kawałki o wymiarach 1,5 centymetra na 1,5 centymetra. Następnie umieść na kwadratowym otworze organotypowym ustawia się górną część skóry właściwej skierowaną do góry.

Użyj kleszczy, aby odwrócić całą organotypową kasetę zawierającą skórę właściwą. Dodaj pięć kropli świeżo pobranej macierzy zewnątrzkomórkowej na dno skóry właściwej i lekko wstrząśnij, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie w skórze właściwej. Po pozostawieniu macierzy zewnątrzkomórkowej do zestalenia się przez pięć minut, użyj kleszczy, aby odwrócić kasetę z powrotem, a następnie dodaj cztery mililitry KGM do sześciocentymetrowej naczynia.

Następnie, po zebraniu i policzeniu genetycznie zmodyfikowanych keratynocytów, Resus zawiesza od 0,5 do 1 miliona komórek w 90 mikrolitrach KGM i dozuje komórki do skóry właściwej. Inkubuj kokulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zmieniaj media na kulturach co drugi dzień.

Pełne rozwarstwienie i różnicowanie naskórka następuje zwykle po piątym dniu. Tkankę można pobrać do 14 dni po posiewie. Ten obraz przedstawia barwienie hematyną i eozyną organotypowe.

Kultury skórne zregenerowana ludzka skóra zawiera zarówno naskórek, jak i skórę właściwą. Naskórek jest w pełni rozwarstwiony i zróżnicowany z czterema odrębnymi warstwami, w tym niezróżnicowaną warstwą podstawną i trzema zróżnicowanymi warstwami, w tym warstwą, kolczykiem, ranum i rogówką. Te obrazy immunofluorescencyjne pokazują, że nadekspresja SNA i dwóch, jak pokazano po prawej stronie, hamuje różnicowanie naskórka w porównaniu z tkanką kontrolną pokazaną na lewym barwieniu dla różnicowania.

Białko keratynowe jeden lub K jest pokazane na zielono, a jądra są oznaczone na niebiesko. Analiza RTQ PCR R w celu zmierzenia poziomów mRNA SNAI dwa w tkance kontrolnej, LAC Z i S NNA I, dwie nadekspresyjne wykazują ponad 50-krotną ekspresję SNAI dwa w stosunku do kontroli. Wreszcie, ta analiza RTQ PCR R pokazuje, że nadekspresja SNA I dwa powoduje utratę ekspresji genów strukturalnych indukowanych różnicowaniem, takich jak TGM jeden i SPRR jeden A. Zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak chipsy, immunofluorescencja, RN, ae lub western blotting, mogą być wykonywane w celu określenia mechanizmów wzrostu i różnicowania zewnątrzoponowego. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie dermatologii do zbadania, w jaki sposób zmiana funkcji genów wpływa na homeostazę skóry. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować genetycznie zmodyfikowane organiczne kultury ludzkiej skóry przy użyciu keratynocytów i skóry właściwej.