Name: Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę generowania genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej i keratynocytów. Technika ta umożliwia badanie wpływu zmienionej ekspresji genów na wzrost i różnicowanie naskórka w ciągu kilku dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez American Cancer Society Research Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) oraz CIRM Basic Biology Award (RB4-05779).

Protokół ludzkiej skóry został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego. Ludzka skóra może być pozyskana z wyrzuconych próbek chirurgicznych lub zakupiona w bankach skóry (bank skóry jest wymieniony w tabeli materiałów/sprzętu). Lokalizacja, od której pochodzi skóra, lub wiek dawcy nie ma decydującego znaczenia dla eksperymentu, o ile białka strefy błony podstawnej (kolagen / laminina) w skórze właściwej nie są zdegradowane.
1. Przygotowanie zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej
<ol>
	<li>Po otrzymaniu ludzkiej skóry umieść tkankę w kapturze do hodowli tkankowej do rozmrożenia (~3-5 min). W zależności od wielkości skóry rozmrożoną tkankę umieść w sterylnej jednorazowej stożkowej tubie o pojemności 50 ml lub butelce o pojemności 125 ml. Typowy rozmiar skóry z banku skóry to 0,75 stopy kwadratowej.</li>
	<li>Napełnij pojemnik w 75% 4x penicyliną i streptomycyną (wstrzykiwacz/paciorkowiec) w 1x PBS. Wstrząsaj energicznie przez 5 minut i wylej płyn. Powtórz ten krok jeszcze 3 razy.</li>
	<li>Po ostatnim umyciu przenieś chusteczkę do nowej probówki/butelki i dodaj świeże 4x wstrzykiwacz/paciorkowiec/PBS, aby wypełnić 75% pojemnika. Mieszaninę tę należy inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 2 tygodnie, aby umożliwić oddzielenie skóry właściwej od naskórka.</li>
	<li>W sterylnych warunkach użyj kleszczy, aby oderwać naskórek od skóry właściwej. Skóra właściwa jest całkowicie biała, podczas gdy naskórek będzie miał zabarwienie w zależności od rasy dawcy (ryc. 1A). Wyrzuć naskórek zgodnie z protokołem postępowania z tkanką ludzką instytucji.</li>
	<li>Umieść skórę właściwą w probówce lub butelce i umyj ją w 4x wstrzykiwaczu / paciorkowca rozcieńczonym w 1x PBS energicznym potrząsaniem (5 min mycia przez 4 razy). Po ostatnim myciu przenieś skórę właściwą do nowej tuby/butelki w 4x wstrzykiwaczu/paciorkowcach rozcieńczonych w 1x PBS i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Skóra właściwa może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do roku.</li>
</ol>
2. Genetycznie modyfikowane pierwotne ludzkie keratynocyty
UWAGA: Użyj amfotropowych komórek feniksa hodowanych na kompletnych pożywkach DMEM [DMEM +10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)+długopis/paciorkowca] do produkcji wirusów infekujących pierwotne ludzkie keratynocyty. Geny pakowania wirusów, które kodują białka, takie jak gag-pol i otoczka, są stabilnie zintegrowane z genomem komórki feniksa, co pozwala na produkcję wirusa po transfekacji wektorem retrowirusowym. Komórki Phoenix mogą być transfekowane z wysoką wydajnością, co pozwala na wysoką produkcję miana wirusa. Wirus wytwarzany z tej linii pakującej może również infekować wiele różnych komórek ssaków, w tym człowieka.
<ol>
	<li>Dzień 1: Dzień przed transfekcją wysiewaj komórki feniksa na 6-dołkowej płytce o gęstości 800 000 komórek na dołek w kompletnym pożywce DMEM.</li>
	<li>Dzień 2: W dniu transfekcji należy użyć 3 μg wektorów retrowirusowych na studzienkę. Podwielokrotność 3 μg wektora retrowirusowego do probówki o pojemności 1,5 ml. Użyj mieszaniny 100 μl DMEM plus 6 μl odczynnika do transfekcji na każde 3 μg wektora. Zmieszać 6 μl odczynnika do transfekcji ze 100 μl DMEM w probówce o pojemności 1,5 ml. (Stosowane wektory retrowirusowe są wymienione w tabeli sprzętu/materiałów).
	<ol>
		<li>Inkubować przez 5 minut i dodać mieszaninę o objętości 106 μl do wstępnie porcjowanej probówki zawierającej 3 μg wektora retrowirusowego. Mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodaj całą tę mieszaninę kroplami do każdej studzienki komórek feniksa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3: Dzień po transfekcji usuń pożywkę z komórek feniksa i dodaj 2 ml świeżej, kompletnej pożywki DMEM. Tego samego dnia wysiewaj pierwotne ludzkie keratynocyty na 6-dołkowe płytki o gęstości 75 000 komórek na dołek. Utrzymuj keratynocyty w pożywce wolnej od keratynocytów w surowicy (KCSFM) z antybiotykami (pen/strep). 
	UWAGA: Zakupiono pierwotne keratynocyty ludzkie. Ogniwa można kupić u różnych dostawców (wymienionych w tabeli Materiał/Sprzęt).</li>
	<li>Dzień 4: Zbierz pożywkę z transfekowanych komórek feniksa, które teraz zawierają cząsteczki wirusa. Przepuścić pożywkę przez filtr 0,45 μm za pomocą strzykawki (w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczających komórek feniksa) i umieścić 2 ml na keratynocytach (posianych w 75 000 komórek/studzienkę poprzedniego dnia: patrz krok 2.3). Dodać bromek heksadimetryny (5 μg/ml) do pożywki, aby pomóc w procesie infekcji. Miana wirusów wynoszą ~1 x 107 TU/ml.
	<ol>
		<li>Wirować 6-dołkowe płytki w wirówce o sile 200 x g przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu usuń pożywkę zawierającą wirusa i umyj komórki raz 1x PBS przed dodaniem KCSFM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 5: Ponownie zainfekuj tę samą partię keratynocytów, jak w kroku 2.4. 
	UWAGA: Wybierz keratynocyty za pomocą leku, jeśli na wektorze retrowirusowym znajduje się marker do wyboru i rozwiń do wykorzystania w dalszej analizie lub zastosowaniach, takich jak hodowle organotypowe.</li>
</ol>
3. Ustawianie organotypowych kultur skóry
<ol>
	<li>Zbuduj kasetę organotypową z typowych materiałów znalezionych w laboratorium lub kasety mogą być wykonane na zamówienie w warsztacie metalowym (rysunek 2A-F). Aby wykonać te kasety z płytki do hodowli tkankowej o średnicy 3,5 cm, użyj kauteryzacji, aby usunąć kwadrat o wymiarach 1,0 cm x 1,0 cm ze środka pokrywki naczynia o średnicy 3,5 cm (ryc. 2A-B). Zrób to w sterylnych warunkach.
	<ol>
		<li>Przymocuj kwadratowe kołki do dolnej części kasety (pokrywa naczynia o średnicy 3.5 cm) za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci (Rysunek 2C). Odczekaj 5 minut, aż lakier do paznokci wyschnie i odwróć kasetę tak, aby spoczywała na kwadratowych kołkach (Rysunek 2D). Umieść kasetę w naczyniu o średnicy 6 cm. 
		UWAGA: Kwadratowe kołki można kupić w różnych sklepach ze sztuką i rękodziełem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować pożywkę wzrostu keratynocytów (KGM) składającą się z 66% DMEM, 22% F12 Ham's, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 10% FBS, 2,67 μg/ml adeniny, 40 ng/ml hydrokortyzonu, 10 ng/ml toksyny, 4,94 μg/ml insuliny, 5 μg/ml transferyny, 1,36 ng/ml Trijodo-L-tyroniny, 10 ng/ml EGF, i 10 μg/ml chlorowodorku cyprofloksacyny. Przefiltruj media przez filtr 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do użycia.</li>
	<li>Wyjąć skórę właściwą z 4x roztworu wstrzykiwacza/paciorkowca + PBS i przemyć 2 razy w KGM, a następnie inkubować w KGM w temperaturze 37 °C przez dwa dni przed użyciem.</li>
	<li>Przeciąć skórę właściwą za pomocą skalpela na kawałki o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm, a następnie umieścić na kasecie organotypowej. Umieść skórę właściwą górną częścią skóry właściwej skierowaną do góry. Górna część skóry właściwej będzie stroną, która styka się z keratynocytami (ryc. 1B).</li>
	<li>Umieść wstępnie przyciętą skórę właściwą na kwadratowym otworze kasety organotypowej górną stroną skóry właściwej skierowaną do góry (ryc. 3A).</li>
	<li>Odwróć całą organotypową kasetę zawierającą skórę właściwą za pomocą kleszczy (ryc. 3B). Rozmrozić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie. Za pomocą igły i strzykawki pobrać 100 μl roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej na kasetę. Dodaj 5 kropli na spód skóry właściwej (błyszcząca strona) i lekko wstrząśnij, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie w całej skórze właściwej (ryc. 3B).</li>
	<li>Odczekaj 5 minut, aż dostępny w handlu roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej całkowicie się zestali (ryc. 3C). Po zestaleniu użyj kleszczy, aby odwrócić kasetę z powrotem. Dodać 4 ml KGM do naczynia o średnicy 6 cm.</li>
	<li>Umieść 0,5-1 miliona genetycznie zmodyfikowanych keratynocytów na organotypowych kasetach zawierających skórę właściwą (ryc. 3D).
	<ol>
		<li>Trypsynizuj keratynocyty, umieszczając 4 ml 0,05% trypsyny na 10 cm płytkach na 5 minut i zapełniając 4 ml kompletnej pożywki DMEM.</li>
		<li>Policz keratynocyty za pomocą hemocytometru, a następnie wiruj z prędkością 200 x g przez 5 minut. Ponownie zawieś 0,5-1 milion komórek (w zależności od liczby dostępnych komórek) w 90 μl KGM i umieść wszystkie komórki na skórze właściwej. 
		UWAGA: Ważne jest, aby umieścić tę samą liczbę komórek na skórze właściwej w tym samym eksperymencie, aby upewnić się, że wszelkie różnice w grubości zregenerowanego naskórka nie wynikają z różnic w początkowej liczbie komórek. Umieszczenie mniej niż 0,5 miliona komórek w skórze właściwej może prowadzić do słabego rozwarstwienia i różnicowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieniaj pożywki KGM na kulturach organotypowych co drugi dzień. Zbierz tkankę 1-14 dni po umieszczeniu keratynocytów na skórze właściwej. Pełne rozwarstwienie i różnicowanie naskórka następuje zwykle po 5 dobie.</li>
</ol>

<ol><li>Tadeu, A. M., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells+in+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells in adult skin.</a> Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).</li>
<li>Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remembering+one%27s+identity%3A+the+epigenetic+basis+of+stem+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions.</a> FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).</li>
<li>Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+barrier+formation+and+recovery+in+skin+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders.</a> J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).</li>
<li>Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase+function+in+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase function in epidermis.</a> J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).</li>
<li>Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+pathways+in+disorders+of+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation.</a> Trends Genet. 29, 31-40 (2013).</li>
<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+differentiation%3A+the+bare+essentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal differentiation: the bare essentials.</a> J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).</li>
<li>Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cancer+in+human+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling cancer in human skin tissue.</a> Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).</li>
<li>Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organotypic+culture+of+human+skin+keratinocytes+and+fibroblasts+to+achieve+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function.</a> Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).</li>
<li>Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+skin+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Organotypic skin culture.</a> J Invest Dermatol. 133, e14(2013).</li>
<li>Sen, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF750+Is+a+p63+Target+Gene+that+Induces+KLF4+to+Drive+Terminal+Epidermal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation.</a> Dev Cell. 22, 669-677 (2012).</li>
<li>Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+differentiation+in+a+self-renewing+mammalian+tissue+by+the+histone+demethylase+JMJD3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3.</a> Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAI2+controls+the+undifferentiated+state+of+human+epidermal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells.</a> Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).</li>
<li>Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+regulates+proliferation+and+differentiation+of+developmentally+mature+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes.</a> Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493, 231-235 (2013).</li>
<li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+function+in+self-renewing+human+epidermis+is+maintained+by+the+exosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome.</a> Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+progenitor+differentiation+requires+the+long+noncoding+RNA+ANCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR.</a> Genes Dev. 26, 338-343 (2012).</li>
<li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).</li>
<li>Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF750+interacts+with+KLF4+and+RCOR1%2C+KDM1A%2C+and+CTBP1%2F2+chromatin+regulators+to+repress+epidermal+progenitor+genes+and+induce+differentiation+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes.</a> Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).</li>
<li>Jameson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IQGAP1+scaffold-kinase+interaction+blockade+selectively+targets+RAS-MAP+kinase-driven+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors.</a> Nat Med. 19, 626-630 (2013).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+SNAI2+regulated+genes+in+primary+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+data%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes.</a> Genomics data. 4, 43-46 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
<li>Doebis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vitro+transduction+of+epithelial+cells+and+keratinocytes+with+improved+adenoviral+gene+transfer+for+the+application+in+skin+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering.</a> Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).</li>
<li>Melo, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+correction+of+junctional+epidermolysis+bullosa+by+a+highly+recombinogenic+AAV+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant.</a> Mol Ther. 22, 725-733 (2014).</li>
<li>Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+expansion+of+human+keratinocyte+stem%2Fprogenitor+cells+carrying+a+transgene+with+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res+ther%22%5BJournal%5D)">Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector.</a> Stem cell res ther. 4, 127(2013).</li>
<li>Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+maintains+progenitor+function+in+self-renewing+somatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue.</a> Nature. 463, 563-567 (2010).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).</li>
<li>Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+skin%3A+fibroblasts+facilitate+keratinocyte+growth+and+differentiation+on+acellular+reticular+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis.</a> J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).</li>
<li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+skin+models+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">The use of skin models in drug development.</a> Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Manipulacja genetyczna w kulturach organotypowych ludzkiej skóry oferuje wiele korzyści powszechnie badanym komórkom 2D, a także modelom mysim. Hodowle 2D nie mają trójwymiarowych interakcji komórka-komórka i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa, które można znaleźć w nienaruszonych tkankach i narządach. Ostatnie badania wykazały również ogromne różnice między komórkami raka skóry hodowanymi w 2D i 3D, przy czym komórki hodowane w 3D wykazują znacznie więcej podobieństw ekspresji genów do pierwotnych ludzkichnowotworów...

Ludzki naskórek to warstwowy nabłonek, który łączy się z leżącą pod nim skórą właściwą poprzez macierz zewnątrzkomórkową znaną jako strefa błony podstawnej. Naskórek służy nie tylko jako nieprzepuszczalna bariera zapobiegająca utracie wilgoci, ale także jako pierwsza linia obrony chroniąca organizm przed obcymi i toksycznymi substancjami1. Warstwa podstawna, która jest najgłębszą warstwą naskórka, zawiera komórki macierzyste i progenitorowe naskórka, które dają początek zróżnicowanemu potomstwu, które tworzy resztę naskórka2. W miarę różnicowania się komórek progenitorowych naskórka migrują one w górę, tworząc pierwszą warstwę zróżnicowanych komórek, znaną jako warstwa kolczysty3. W warstwie kolczystej komórki włączają ekspresję keratyny 1 i 10, które następnie zapewniają wytrzymałość na wytrzymanie stresu fizycznego dla zróżnicowanych warstw naskórka. W miarę dalszego różnicowania się komórek warstwy kolczystej przemieszczają się one w górę naskórka, tworząc warstwę ziarnistą, która charakteryzuje się tworzeniem keratohialiny i granulek blaszkowatych, a także białek strukturalnych, które są gromadzone poniżej błony plazmatycznej. W miarę jak komórki postępują w procesie różnicowania, białka pod błoną plazmatyczną są ze sobą sieciowane, podczas gdy granulki lamelarne są wytłaczane z komórek, tworząc bogatą w lipidy barierę zwaną warstwą rogowąnaskórka 4.
Choroby, które obejmują zmiany we wzroście i różnicowaniu naskórka, dotykają ~20% populacji5. Zrozumienie mechanizmów tego procesu ma więc ogromne znaczenie. Ponieważ manifestacja wielu z tych chorób jest zależna od kontaktu komórka-komórka lub komórka-macierz, stworzono hodowle organotypowe, w których ludzki naskórek jest odtwarzany w środowisku 3D. Metody te zazwyczaj polegają na użyciu pierwotnych lub przekształconych keratynocytów osadzonych na macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak zdewitalizowana ludzka skóra właściwa, Matrigel lub kolagen.
Aby zrozumieć mechanizmy regulacji genów, które są ważne dla wzrostu i różnicowania naskórka, keratynocyty mogą być genetycznie manipulowane za pomocą wektorów retrowirusowych w celu zniszczenia lub nadekspresji genów w kulturze 2D, a następnie odtworzone w 3D. Metody te były szeroko stosowane do scharakteryzowania genów zaangażowanych w samoodnawianie i różnicowanie komórek macierzystych i progenitorowych naskórka, a także progresję do neoplazji11-21. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół dotyczący zmiany ekspresji genów w organotypowych kulturach naskórka za pomocą retrowirusów.

<table><tbody><tr><td>Ludzka skóra</td><td>New York Firefighters Skin Bank</td><td><a href="http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html">http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html</a></td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>amfotropowe linie komórkowe feniksa</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 transfekcja odczynnik</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka keratynocytów (KCSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek cyprofloksacyny</td><td>Serologiczny</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>kauteryzacja</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Keratyny 1</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>kołki kwadratowe</td><td>Sklepy</td><td></td><td></td>artystyczne i rzemieślnicze</tr><tr><td>człowiek keratynocyty noworodkowe</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>ludzkie keratynocyty noworodkowe</td><td>Zastosowania komórkowe</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>Wektor retrowirusowy MSCV</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>Wektor retrowirusowy LZRS</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro Wektor retrowirusowy</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bromek heksadimetryny&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Hodowle organotypowe pozwalają na odtworzenie środowiska 3D krytycznego dla kontaktu komórka-komórka i interakcji komórka-matryca, które naśladuje funkcję i fizjologię ich tkankowych odpowiedników in vivo. Przykładem tego są organotypowe kultury skóry, które wiernie odwzorowują program różnicowania i stratyfikacji naskórka. Pierwotne ludzkie keratynocyty naskórkowe są genetycznie manipulowane przez retrowirusy, w których geny mogą być łatwo nadmiernie eksprymowane lub powalone. Te genetycznie zmodyfikowane keratynocyty mogą być następnie wykorzystane do regeneracji ludzkiego naskórka w organtypowych kulturach skóry, zapewniając potężny model do badania szlaków genetycznych wpływających na wzrost, różnicowanie i postęp choroby. Przedstawione tutaj protokoły opisują metody przygotowania zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej, a także genetycznej manipulacji pierwotnymi ludzkimi keratynocytami w celu wytworzenia organotypowych kultur skóry. Zregenerowana ludzka skóra może być wykorzystywana w dalszych zastosowaniach, takich jak profilowanie ekspresji genów, barwienie immunologiczne i immunoprecypitacja chromatyny, a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. W związku z tym wytwarzanie tych genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry pozwoli na określenie genów, które są kluczowe dla utrzymania homeostazy skóry.

Pierwszym krokiem w generowaniu organotypowej ludzkiej skóry jest oddzielenie naskórka od skóry właściwej. Dwutygodniowa inkubacja skóry w temperaturze 37 °C w 4x pen/strep/PBS powinna umożliwić oddzielenie skóry właściwej od naskórka (Rysunek 1A). Jeśli oddzielenie naskórka i skóry właściwej jest utrudnione, należy umieścić tkankę w temperaturze 37 °C w 4x pen/strep/PBS na kolejny tydzień, a następnie ponownie spróbować oddzielić warstwy za pomocą pęsety.
Jednym z kluczowych ...

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry z wykorzystaniem rewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej w celu określenia wpływu zmienionej ekspresji genów na wzrost i różnicowanie naskórka. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie dermatologii, takie jak określenie, które geny odpowiadają za wzrost, różnicowanie i progresję naskórka do stanu chorobowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że genetycznie zmodyfikowana ludzka skóra powstaje w ciągu kilku dni, co umożliwia badanie próbek ludzkich, które są potencjalnie istotne klinicznie.Procedura zostanie zademonstrowana w moim laboratorium. W przypadku otrzymania zamrożonej ludzkiej skóry, należy umieścić tkankę w komorze z laminarnym przepływem powietrza na od trzech do pięciu minut w celu rozmrożenia. Po rozmrożeniu należy przenieść tkankę do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml lub butelki o pojemności 125 ml, w zależności od jej wielkości.Następnie dodaj 4x penicylinę i streptomycynę do jednego XPBS, aż naczynie zostanie wypełnione w 75%. Zamknij naczynie i energicznie wstrząśnij przez pięć minut. Odlej roztwór antybiotyku i powtórz tę czynność.Po ostatnim przemyciu powtórz etap ten jeszcze trzy razy, przenieś tkankę do nowego pojemnika i dodaj świeży roztwór antybiotyku. Inkubuj tę mieszaninę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez dwa tygodnie, aby umożliwić oddzielenie skóry właściwej od naskórka. Po upływie dwóch tygodni za pomocą pęsety oddziel naskórek od skóry właściwej.Usunąć naskórek zgodnie z protokołem instytucji dotyczącym postępowania z tkanką ludzką. Umieścić skórę właściwą w pojemniku z roztworem antybiotyków i przemyć, energicznie wstrząsając, tak jak wcześniej. Po ostatnim płukaniu przenieść skórę właściwą do nowego pojemnika z roztworem antybiotyków i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia; dzień przed transfekcją wysiać komórki phoenix w pożywce kompletnej na płytkę 6-dołkową w gęstości 800 000 komórek na dołek.W dniu transfekcji wymieszaj 6 µL odczynnika do transfekcji ze 100 µL dmm. Dla każdej studni przeznaczonej do transfekcji inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut, następnie dodaj mieszaninę do probówki zawierającej 3 µg wektora retrowirusowego na każdą studnię i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodaj całą tę mieszaninę kroplami do każdej studni z komórkami phoenix i inkubuj komórki przez noc. Dzień po transfekcji usuń pożywkę z komórek phoenix i dodaj 2 mL świeżej pożywki kompletnej w tym samym dniu.Resuspenduj pierwotne ludzkie keratynocyty w bezsurowiczym medium do hodowli keratynocytów z dodatkiem antybiotyków i zasiaj je na sześciostudzienkowe płytki w gęstości 75 000 komórek na studzienkę. Następnego dnia zbierz medium, które teraz zawiera cząstki wirusowe z transfekowanych komórek Phoenix. Przepuść medium przez filtr 0,45 mikrona za pomocą strzykawki, aby usunąć wszelkie zanieczyszczone komórki.Do przefiltrowanych mediów zawierających wirus dodaj 5 µg/mL heksametylobromku, aby wspomóc proces infekcji. Następnie pipetuj 2 mL wirusa na keratynocyty wysiane w dniu poprzednim. Następnie wiruj sześć płytek w wirówce z prędkością 200 G przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu usunąć i zutylizować pożywkę zawierającą wirusa. Przemyć komórki raz roztworem XPBS, a następnego dnia dodać świeże K-C-S-F-M. Zainfekować tę samą partię keratynocytów wirusem, stosując procedurę przedstawioną powyżej.W celu przygotowania kaset organotypowych należy za pomocą kauteryzatora wyciąć kwadrat o wymiarach 1 cm na 1 cm ze środka pokrywki szalki hodowlanej o średnicy 3,5 cm. Do dna kasety należy przymocować kwadratowe podpórki za pomocą bezbarwnego laku do paznokci i odczekać pięć minut do jego wyschnięcia.Na koniec obrócić kasetę i umieścić ją w szalce o średnicy 6 cm, opierając kasetę na wypustkach. Wyjąć skórę właściwą z przechowywania w temperaturze 4 °C i przenieść ją do pojemnika z pożywką do wzrostu keratynocytów w celu przemycia.Po powtórzeniu płukania umieść skórę właściwą w świeżym KGM i inkubuj w temperaturze 37°C przez dwa dni. Po inkubacji użyj skalpela, aby pociąć skórę właściwą na kawałki o wymiarach 1,5 cm na 1,5 cm. Następnie umieść je w kwadratowym otworze zestawu organotypowego w taki sposób, aby górna część skóry właściwej była skierowana do góry.Użyj pęsety, aby odwrócić całą kasetę organotypową zawierającą skórę właściwą. Dodaj pięć kropel świeżo przygotowanej macierzy zewnątrzkomórkowej na spód skóry właściwej i lekko potrząśnij, aby zapewnić równomierny rozkład na całej powierzchni skóry. Po odczekaniu pięciu minut do zastygnięcia macierzy zewnątrzkomórkowej, użyj pęsety, aby odwrócić kasetę z powrotem, a następnie dodaj cztery mililitry KGM do naczynia o średnicy sześciu centymetrów.Następnie, po zebraniu i przeliczeniu zmodyfikowanych genetycznie keratynocytów, resztę zawiesiny od 0,5 do 1 miliona komórek w 90 µL KGM nanosi się na skórę właściwą. Kokulturę inkubuje się w temperaturze 37 °C. Pożywkę w kulturach należy wymieniać co drugi dzień.Pełna stratyfikacja i różnicowanie naskórka następują zazwyczaj po piątym dniu. Tkankę można pobrać do 14 dni po wysianiu. Ten obraz przedstawia barwienie hematyliną i eozyną preparatu organotypowego.Hodowle skóry zregenerowanej ludzkiej skóry zawierają zarówno naskórek, jak i skórę właściwą. Naskórek jest w pełni warstwowy i zróżnicowany, z czterema wyraźnymi warstwami, w tym niezróżnicowaną warstwą podstawną oraz trzema warstwami zróżnicowanymi, obejmującymi warstwę kolczystą, ziarnistą i rogową. Te obrazy immunofluorescencyjne wykazują, że nadekspresja SNA i dwa, pokazana po prawej stronie, hamuje różnicowanie naskórka w porównaniu z tkanką kontrolną pokazaną po lewej stronie, barwioną pod kątem różnicowania.Białko keratyna 1 lub K1 przedstawiono na kolor zielony, natomiast jądra komórkowe zaznaczono na niebiesko. Analiza RT-qPCR w celu pomiaru poziomów mRNA SNAI2 w kontrolnej tkance LACZ oraz tkance z nadekspresją SNAI2 wykazuje ponad 50-krotnie wyższą ekspresję SNAI2 w stosunku do kontroli. Ostatecznie analiza RT-qPCR ta wykazuje, że nadekspresja SNAI2 prowadzi do utraty ekspresji genów strukturalnych indukowanych różnicowaniem, takich jak TGM1 i SPRR1A. Po wykonaniu tej procedury.Inne metody, takie jak ChIP-seq, immunofluorescencja, RT-qPCR lub western blotting, mogą być stosowane w celu ustalenia mechanizmów wzrostu i różnicowania naskórka. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny dermatologii do zgłębiania tego, w jaki sposób zmiana funkcji genów wpływa na homeostazę skóry. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować genetycznie modyfikowane organiczne hodowle ludzkiej skóry z wykorzystaniem keratynocytów i ludzkiej skóry właściwej pochodzącej z płodów.

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Ten film opisuje szczegółowy protokół produkcji genetycznie modyfikowanych pierwotnych rekombinowanych retrowirusów ludzkich keratynocytów. Metoda ta może być stosowana do manipulowania ekspresją genów w keratynocytach.

Modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich keratynocytów: metoda genetycznej manipulacji keratynocytami przy użyciu rekombinowanych retrowirusów

Ten protokół wideo opisuje technikę hodowli in vitro opartą na kasecie do generowania ludzkiej skóry organotypowej przy użyciu keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej. Naśladują funkcję i fizjologię swoich odpowiedników tkankowych in vivo.

Organotypowa hodowla skóry 3D: kasetowa technika hodowli in vitro do regeneracji ludzkiego naskórka na bezkomórkowej skórze właściwej

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Ludzka skóra działa jako pierwsza linia obrony przed środowiskiem zewnętrznym. Przedstawiono metodę izolacji pierwotnych keratynocytów ludzkich od skóry osoby dorosłej. Te izolowane keratynocyty są przydatne w wielu konfiguracjach eksperymentalnych i są bardzo odpowiednim modelem do badania mechanizmów molekularnych w biologii skóry in vitro.

Wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej

Tutaj prezentujemy protokół generowania 3D organotypowego modelu skóry czerniaka sferoidalnego, który podsumowuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządu/guza in vivo, ale jednocześnie uwzględnia systematyczną interwencję eksperymentalną.

Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Celem tego protokołu jest opisanie generacji i analizy objętościowej unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry przy użyciu dostępnych i prostych technik dla długoterminowej hodowli. W miarę możliwości opisano uzasadnienie kroków, aby umożliwić badaczom dostosowanie ich do ich potrzeb badawczych.

Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Tutaj opisujemy protokoły dla trzech typów hodowli eksplantatów skóry embrionalnej ptaków, które mogą być użyte do badania interakcji tkankowych, obrazowania 4D filmu poklatkowego (3D plus czas), globalnych lub lokalnych zaburzeń funkcji molekularnych oraz charakterystyki biologii systemów.

Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

Protokół ten określa metodę wytwarzania organoidów skóry zawierających mieszki włosowe pochodzące z ludzko indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, wykorzystując płaski, fizjologicznie istotny system hodowli powietrzno-cieczowy, aby odwzorować architekturę i funkcję skóry.

Generowanie ludzko indukowanych pluripotentnych pluripotentnych organoidów skórnych z komórek macierzystych z użyciem systemu hodowli powietrze-ciecz

Poznaj metodę generowania genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej i keratynocytów. Technika ta umożliwia badanie wpływu zmienionej ekspresji genów na wzrost i różnicowanie naskórka w ciągu kilku dni.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Przeglądaj więcej filmów