Name: Modelowanie zawału torebki opisanej techniką fotozakrzepową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną technikę fotozakrzepową do modelowania zawału torebki wewnętrznej u szczurów. Ta metoda umożliwia precyzyjne wywołanie ograniczonego zawału z trwałym upośledzeniem ruchowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prace te były wspierane przez grant z Instytutu Inżynierii Systemów Medycznych (iMSE) i GIST-Caltech Collaborative Fund (K04592) z GIST oraz przez Program Badań Nauk Podstawowych za pośrednictwem NRF of Korea finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (NRF-2013R1A2A2A01067890).

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Gwangju Institute of Science and Technology (GIST) i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w GIST.
1. Kroki poprzedzające powstawanie zmiany
<ol>
	<li>Identyfikacja obszaru kończyny przedniej w torebce wewnętrznej przy użyciu AAV-GFP
	<ol>
		<li>Utrzymywać i obchodzić się ze szczurami linii Sprague Dawley (~400 g, 11–13 tygodni) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi.</li>
		<li>Sterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne i elektrody, używając odpowiedniego sterylizatora (sterylizatora parowego lub plazmowego). Sterylizator parowy należy stosować w temperaturze 121 °C przy ustawieniu 30 min na sterylizację i 30 min na suszenie.</li>
		<li>Zanurzyć zwierzę w narkozie, podając domięśniowo mieszaninę chlorowodorku ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (7 mg/kg). Sprawdzić głębokość znieczulenia poprzez uciśnięcie łapy. Utrzymywać temperaturę ciała na poziomie 37,5 ± 0.5 °C za pomocą maty grzewczej umieszczonej pod ciałem zwierzęcia.</li>
		<li>Umieść zwierzę w ramie stereotaktycznej, używając wsporników usznych i uchwytu jamowego.</li>
		<li>Oczyścić i zdezynfekować miejsce operacyjne 70% alkoholem oraz roztworem powidonu jodku. W miejscu planowanego nacięcia czaszki pod skórę głowy wprowadzić w infiltracji 2% chlorowodorek lidokainy, aby zmniejszyć ból śródoperacyjny.</li>
		<li>Nanieść weterynaryjną maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu oczu. Przykryć zwierzę sterylną draperią w obrębie pól operacyjnych. Wszystkie procedury należy przeprowadzać w warunkach sterylnych.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie czaszki w linii środkowej o długości 2 cm za pomocą skalpela, a następnie odsunie skórę obustronnie przy użyciu rozwieraków drucianych. Osusz czaszkę za pomocą patyczków bawełnianych i 30% nadtlenku wodoru.</li>
		<li>Przy użyciu wiertarki ręcznej wykonać otwór nad obszarem kory ruchowej kończyny przedniej (AP: +2,5 od bregmy, ML: ±2,5 od linii środkowej), a następnie oczyścić trakt za pomocą mikrokuretki w celu wstrzyknięcia wirusa.</li>
		<li>Rozmrozić AAV-GFP (2 x 1012 cząsteczek wirusa/ml) na lodzie i nanieś 1 µl wirusa w 10 µl strzykawkę. Umieść strzykawkę w ramie stereotaktycznej.</li>
		<li>Przesunąć igłę do przygotowanego otworu i wprowadzić ją na głębokość 1 mm do twardówki.</li>
		<li>Powoli wstrzyknąć wirusa (0.1 µl/min) przy użyciu mikropompy o wysokiej precyzji, a następnie pozostawić igłę w miejscu przez dodatkowe 10 min, aby umożliwić dyfuzję wirusa na zewnątrz.</li>
		<li>Po oczyszczeniu pola operacyjnego za pomocą przemywania solą fizjologiczną, zabezpieczone ranę szwem nylonowym 3-0; zwolnij szczura z uchwytu stereotaktycznego i przenieś go do komory rekonwalescencyjnej. W celu opanowania bólu pooperacyjnego podaj ketoprofen (2 mg/kg) w zastrzyku domięśniowym.</li>
		<li>Utrzymać temperaturę ciała (37 °C) z użyciem mata grzewczego i podać antybiotyki z grupy cefalosporyn drugiej generacji (0,1%, 1 ml) poprzez wstrzyknięcie domięśniowe oraz 2% chlorowodorek lidokainy poprzez wstrzyknięcie podskórne w razie potrzeby. Nie należy pozostawiać zwierzęcia bez nadzoru, dopóki nie odzyska świadomości wystarczającej do utrzymania pozycji sternalnej. Zwierzę należy trzymać w pojedynczej klatce do pełnego powrotu do zdrowia.</li>
		<li>Po 2–3 tygodniach rekonwalescencji szczura poddaje się głębokiej narkozie poprzez podanie przedawkowanej dawki chlorowodorku ketaminy (300 mg/kg) w zastrzyku domięśniowym w komorze. Śmierć zwierzęcia potwierdza się brakiem reakcji na uciśnięcie palca stopy, brakiem tętna oraz oddechu. Szczura umieszcza się w komorze w pozycji na plecach.</li>
		<li>Otwórz jamę brzuszną za pomocą nacięcia w kształcie litery „Y”, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Mocno zaklemuj aortę zstępującą za pomocą kleszczyków hemostatycznych i rozerwij prawy przedsionek serca szczura, aby umożliwić odpływ krwi. Rozpocznij perfuzję lewej komory serca zimnym 1% paraformaldehydem przez 5 min (10 ml/min), a następnie 4% paraformaldehydem przez 30 min (10 ml/min).</li>
		<li>Odciąć głowę szczura od tułowia za pomocą nożyczek. Wykonać cięcie w linii pośrodkowej od szyi do nosa, a następnie usunąć mięśnie szyi za pomocą nożyczek lub kleszczyków kostnych, aby odsłonić czaszkę. Ostrożnie oddzielić kości czaszki oraz opony twarde od mózgu.</li>
		<li>Wyjąć mózg i umieścić go w probówce stożkowej o pojemności 50 ml wypełnionej 4% paraformaldehydem na noc. Następnego dnia przemyć mózg trzykrotnie w 1x PBS i umieścić go w 30% roztworze sacharozy.</li>
		<li>Po całkowitym opadnięciu mózgu na dno 30% roztworu sacharozy, umieść go w formie do krioembeddingu z zastosowaniem związku OCT w temperaturze -20 °C w kriostacie. Przeciąć mózg w płaszczyźnie czołowej przy grubości wynoszącej 40 μm oraz przedział wynoszący 200 μm.</li>
		<li>Wykonanie barwienia immunohistochemicznego GFP metodą na szkiełku14. Nałożyć przeciwciało pierwotne (w rozcieńczeniu 1:200 przeciwciała anty-GFP, frakcja IgG królika) na skrawki mózgu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °CW dniu 2nd następnego dnia trzykrotnie przemyć preparat 1% roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo z dodatkiem Tween-20 (PBST), a następnie nanieść przeciwciało wtórne (rozcieńczenie 1:500 kozie anty-królicze IgG (H + L)) na 1 h. Przesuworkę przemyć trzykrotnie 1% roztworem PBST. Na skrawku mózgu umieścić szkiełko nakrywką.</li>
		<li>Przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego (długość fali wzbudzenia 470 nm, długość fali emisji 525 nm, powiększenie 5X) należy zaobserwować aksony transdukowane AAV-GFP w torebce wewnętrznej. Następnie należy porównać lokalizację transdukowanych aksonów z atlasem mózgu szczura (Rat Brain Atlas).15 aby wyznaczyć współrzędne stereotaktyczne transdukowanych aksonów</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosowanie natężenia światła przed wywołaniem uszkodzenia, odpowiednie dla modelowania zawału torebkowego
	<ol>
		<li>Budowa optycznego interfejsu neuronowego
		<ol>
			<li>Za pomocą wiertarki tnącej odciąć odpowiedni fragment (4 cm) igły spinalnej o rozmiarze 27 G z wsuniętym trzpieniem. 
			UWAGA: Przecinanie może spowodować ściśnięcie i zmiażdżenie końcówki igły spinalnej; należy wyjąć stilet i wypolerować końcówkę igły spinalnej, aby usunąć zmiażdżoną część oraz zachować wewnętrzną średnicę igły.</li>
			<li>Zdejmij fragment izolacji (płaszcza) włókna optycznego o odpowiedniej długości (10 cm) (125 µm z a 62.5 µm rdzeń jednego z końców patchcorda.</li>
			<li>Wprowadź nieizolowane włókno światłowodowe do metalowej rurki (średnica zewnętrzna: 3,8 mm, średnica wewnętrzna: 3,3 mm i długość: 17 mm), którą następnie zacisnąć wokół włókna. Metalowa rurka służy do wypełnienia przestrzeni między włóknem światłowodowym a piastą igły spinalnej. Dolną połowę metalowej rurki zacisnąć dwukrotnie za pomocą praski.</li>
			<li>Nanieś utwardzaną termicznie żywicę epoksydową na światłowód, a następnie wprowadź światłowód do igły spinalnej. Nanieś dodatkową ilość żywicy epoksydowej w wolną przestrzeń w piastce. Utwardzaj żywicę przez 20 min w temperaturze 100 °C dla stabilnej fiksacji.</li>
			<li>Przetnij światłowód wystający z igły spinalnej, a następnie wypoleruj końcówkę światłowodu znajdującą się w czubku igły spinalnej, używając diamentowych arkuszy polerujących.</li>
			<li>Podłączyć konektor FC/PC patchcordu do sprzęgała systemu zielonego lasera, a następnie zmierzyć natężenie światła na końcówce włókna optycznego przy użyciu cyfrowego miernika mocy i energii optycznej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Fototromboticzne tworzenie zmian niedokrwiennych w torebce wewnętrznej
<ol>
	<li>Sterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne i elektrody przy użyciu odpowiedniego sterylizatora (sterylizatora parowego lub plazmowego). W przypadku sterylizatora parowego stosować ustawienia 121 °C przez 30 min w celu sterylizacji oraz 30 min w celu osuszenia.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę (~400 g, 11 - 13 tygodni) mieszaniną hydrochlorczku ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (7 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie domięśniowe. Sprawdzić głębokość znieczulenia poprzez uciśnięcie łapy. Utrzymywać temperaturę ciała na poziomie 37,5 ± 0,5 °C za pomocą mata grzewczego umieszczonego pod ciałem zwierzęcia.</li>
	<li>Umieścić zwierzę w ramie stereotaktycznej, korzystając z prętów usznych i uchwytu jamowego.</li>
	<li>Oczyścić i zdezynfekować pole operacyjne 70% alkoholem oraz roztworem jodyny povidone. Wprowadzić 2% hydrochlorzku lidokainy pod skórę głowy w planowanym miejscu nacięcia czaszki, aby zmniejszyć ból śródoperacyjny. Nałożyć weterynaryjną maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu oczu.</li>
	<li>Przykryć zwierzę sterylną tkaniną i odsłonić miejsca operacyjne. Wszystkie procedury przeprowadzać w warunkach sterylnych.</li>
	<li>Wyonać 2 cm nacięcie w linii środkowej czaszki i odsunąć skórę obustronnie za pomocą rozwieraczy drucianych. Osuszyć czaszkę za pomocą patyczków bawełnianych i nadtlenku wodoru.</li>
	<li>Dostosować wysokość zacisku nosowego tak, aby bregma i lambda znajdowały się na tym samym poziomie. KROK KRYTYCZNY: To wyrównanie jest kluczowe dla poprawnego dotarcia do głębokich struktur, na przykład podczas wykonywania uszkodzenia niedokrwiennego w torebce wewnętrznej w głównym eksperymencie.</li>
	<li>Wywiercić otwór (średnica: 2 mm; AP: -2,04 od bregma; ML: ±3,0 od linii środkowej) za pomocą wiertarki w celu wywołania fototrombozy.</li>
	<li>Wypolerować i oczyścić końcówkę światłowodu interfejsu optycznego. Przymocować ONI do ramy stereotaktycznej, unikając zgięć. Sprawdzić końcówkę ONI i dokładnie ją przetrzeć przed oraz po wprowadzeniu interfejsu optycznego.</li>
	<li>Zmierzyć intensywność lasera na końcówce światłowodu przed wprowadzeniem interfejsu optycznego do docelowego miejsca w mózgu szczura. Dostosować intensywność lasera do 3,5 mW na końcówce światłowodu, zgodnie z potwierdzeniem w krokach przedoperacyjnych.</li>
	<li>Wprowadzić ONI do docelowego obszaru torebki wewnętrznej (-7,8 mm, potwierdzone w kroku przedoperacyjnym) przez otwór wiertniczy.</li>
	<li>Utrzymywać temperaturę ciała na poziomie 37,5 ± 0,5 °C podczas fototrombozy. Niższa temperatura ciała może nie spowodować oczekiwanego stopnia zawału. Wstrzyknąć Rose Bengal (2 ml/kg) do żyły ogonowej.</li>
	<li>Włączyć zielony laser o długości fali 532 nm na 90 s w 1 min po wstrzyknięciu Rose Bengal. Po napromieniowaniu ostrożnie usunąć ONI z mózgu. Po oczyszczeniu pola operacyjnego zabezpieczyć ranę szwem nylonowym 3-0; zwolnić szczura z ramy stereotaktycznej i przenieść go do komory regeneracyjnej.</li>
	<li>W przypadku grupy operowanej pozornie (SOG), przeprowadzić identyczną procedurę tworzenia uszkodzenia, z wyjątkiem wstrzyknięcia soli fizjologicznej (0,2 ml/100 g) zamiast Rose-Bengal.</li>
	<li>Utrzymywać temperaturę ciała (37 °C) za pomocą mata grzewczego po operacji i podać antybiotyki (cefalosporyna drugiej generacji, 0,1%, 1 ml) poprzez wstrzyknięcie domięśniowe. Nie pozostawiać zwierzęcia bez nadzoru, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję sternalną. Nie wprowadzać zwierząt pooperacyjnych do klatki zajmowanej przez inne zwierzęta do czasu pełnego wyzdrowienia. 
	UWAGA: Wstępny eksperyment przeprowadzono według tych samych procedur, aby znaleźć optymalną intensywność światła w zakresie od 1 mW do 5 mW; w różnych warunkach może być konieczne powtórzenie tej procedury w celu uzyskania satysfakcjonującego stopnia uszkodzenia.</li>
</ol>
3. Ocena zmian niedokrwiennych w obrębie torebki wewnętrznej
<ol>
	<li>Testy behawioralne i grupowanie zwierząt
	<ol>
		<li>Wykonaj zadania sięgania po pojedynczą pelletkę zgodnie z opisem Whishaw et al.14, aby każdego dnia przez 1 tydzień po modelowaniu udaru oceniać deficyt motoryczny kończyny przedniej. Zadanie sięgania po pojedynczą pelletkę (SPRT) przeprowadź u zwierząt z ograniczonym dostępem do pokarmu (90% masy ciała grupy kontrolnej), używając przezroczystego Plexiglasu (30 x 15 x 35 cm wysokości) z nacięciem o szerokości 1 cm i półką z pokarmem w przedniej części środkowej przedniej ścianki.</li>
		<li>Umieść pelletkę na półce z pokarmem ukośnie po stronie przeciwnej do preferowanej kończyny przedniej. Podawaj 20 pelletek na sesję przez 3 tygodnie. 
		UWAGA: Liczbę udanych prób SPRT definiuje się jako sięgnięcie, podczas którego zwierzę chwyta pelletkę z pokarmem i wkłada ją do pyska, nie upuszczając jej.</li>
		<li>Oblicz wynik jako procent udanych prób sięgnięcia, zgodnie z poniższym wzorem: 
		<img alt="Wzór na wskaźnik sukcesu: (Liczba udanych prób sięgnięcia x 100) / 20. Wyrażenie matematyczne." src="/files/ftp_upload/53281/53281equation1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation1"> 
		UWAGA: Zwierzęta dzielimy na 3 grupy: grupę pozorowaną (SOG), grupę z umiarkowaną regeneracją (MRG) oraz grupę z niską regeneracją (PRG). Jeśli wynik SPRT po udarze wynosi &gt;50%, klasyfikujemy szczury do grupy MRG, co wskazuje na obecność znacznej zmiany, ale nie całkowite zniszczenie obszaru docelowego. Jeśli wynik SPRT po udarze wynosi &lt;50% w porównaniu do wyniku SPRT przed udarem, klasyfikujemy grupę jako PRG, co wskazuje na całkowite uszkodzenie obszaru docelowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Neurohistologiczne potwierdzenie uszkodzenia zawałowego
	<ol>
		<li>Wykonaj perfuzję serca 4% paraformaldehydem zgodnie z wcześniejszym opisem. Po całkowitym zatopieniu mózgu w 30% roztworze sacharozy, wykonaj cięcia koronalne o grubości 10 µm i odstępie 200 µm przy użyciu mikrotomu lub kriotomu4.</li>
		<li>Wykonaj barwienie H&amp;E, Nissla, Luxol fast blue-PAS, barwienie na białko neurofilamentu-L lub kwaśne białko glejowe (GFAP) i przeanalizuj wyniki histologiczne, aby określić optymalną intensywność światła, która może objąć całą szerokość torebki wewnętrznej w obszarze docelowym w celu obserwacji barwienia4,17.</li>
		<li>Za pomocą oprogramowania ImageJ zmierz objętość obszaru zawału fototromboticznego torebki wewnętrznej na skrawkach mózgu.
		<ol>
			<li>Aby zmierzyć objętość obszaru zawału, uruchom oprogramowanie „ImageJ”. Aby otworzyć pliki do ułożenia w stosy, wybierz „Image to Stacks” („Image” → „Stacks” → „Image to Stacks”). Edytuj nazwę pliku i wybierz „Set the Scale” („Analyze” → „Set the Scale”), aby ustawić skalę.</li>
			<li>W menu „Plugins” wybierz „Measure Stacks”, aby obliczyć objętość lub powierzchnię obrazów. W polu „Slice Spacing” wprowadź odstęp między dwiema sąsiednimi warstwami obrazu. Obrysuj ROI (Region Of Interest – obszar zainteresowania) na wszystkich obrazach i kliknij „Measure”. 
			UWAGA: Oprogramowanie „ImageJ” automatycznie oblicza powierzchnię i objętość każdego obrazu oraz ich łączną objętość.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2012+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 125, 2-220 (2012).</li>
<li>Debette, S., Markus, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+importance+of+white+matter+hyperintensities+on+brain+magnetic+resonance+imaging%3A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmj%22%5BJournal%5D)">The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging: systematic review and meta-analysis.</a> Bmj. 341, 3666(2010).</li>
<li>Zhang, K., Sejnowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+scaling+law+between+gray+matter+and+white+matter+of+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex.</a> PNAS. 97 (10), 5621-5626 (2000).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+photothrombotic+capsular+infarct+with+a+marked+motor+deficit%3A+a+behavioral%2C+histologic%2C+and+microPET+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">A rat model of photothrombotic capsular infarct with a marked motor deficit: a behavioral, histologic, and microPET study.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 683-689 (2014).</li>
<li>Kleim, J. A., Boychuk, J. A., Adkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+models+of+upper+extremity+impairment+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Rat models of upper extremity impairment in stroke.</a> ILAR J. 48 (4), 374-384 (2007).</li>
<li>Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+capsular+infarct%3A+endothelin-1+injections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat.</a> Behav Brain Res. 169 (2), 206-211 (2006).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+anterior+choroidal+artery+territory+in+rats+using+intraluminal+occluding+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique.</a> J Neurol Sci. 182 (1), 16-28 (2000).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+of+lacunar+infarction+in+the+gyrencephalic+brain+of+the+miniature+pig%3A+neurological+assessment+and+histological%2C+immunohistochemical%2C+and+physiological+evaluation+of+dynamic+corticospinal+tract+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental model of lacunar infarction in the gyrencephalic brain of the miniature pig: neurological assessment and histological, immunohistochemical, and physiological evaluation of dynamic corticospinal tract deformation.</a> Stroke. 39 (1), 205-212 (2008).</li>
<li>Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+matter+lesions+and+glial+activation+in+a+novel+mouse+model+of+chronic+cerebral+hypoperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion.</a> Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Ann Neurol. 17 (5), 497-504 (1985).</li>
<li>Kuroiwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rat+model+of+photothrombotic+ischemia+and+infarction+within+the+caudoputamen%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen.</a> Stroke. 40 (1), 248-253 (2009).</li>
<li>Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBashkatov%2C+AN+%22Handbook+of+biomedical+optics%22">Handbook of biomedical optics</a>. 83, CRC Press. Boca Raton, Fl. (2011).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Whishaw, I. Q., Whishaw, P., Gorny, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+skilled+forelimb+reaching+in+the+rat%3A+a+movement+rating+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a movement rating scale.</a> J Vis Exp. (18), e816(2008).</li>
<li>Jang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+corticospinal+tract+location+at+corona+radiata+and+posterior+limb+of+the+internal+capsule+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRehabilitation%22%5BJournal%5D)">A review of corticospinal tract location at corona radiata and posterior limb of the internal capsule in human brain.</a> NeuroRehabilitation. 24 (3), 279-283 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+changes+in+resting-state+brain+activity+in+a+capsular+infarct+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Longitudinal changes in resting-state brain activity in a capsular infarct model.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 35 (1), 11-119 (2014).</li>
<li>Blasi, F., Whalen, M. J., Ayata, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lasting+pure-motor+deficits+after+focal+posterior+internal+capsule+white-matter+infarcts+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Lasting pure-motor deficits after focal posterior internal capsule white-matter infarcts in rats.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 35 (6), 977-984 (2015).</li>
<li>Metz, G. A., Antonow-Schlorke, I., Witte, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+improvements+after+focal+cortical+ischemia+in+adult+rats+are+mediated+by+compensatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+brain+research%22%5BJournal%5D)">Motor improvements after focal cortical ischemia in adult rats are mediated by compensatory mechanisms.</a> Behavioural brain research. 162 (1), 71-82 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony model zawału torebki wykazuje celowaną zmianę z wyraźnym i trwałym upośledzeniem ruchowym funkcji kończyn przednich. Dotychczasowe modele udaru podkorowego udaru torebkowego wykazywały niewystarczający stopień upośledzenia motorycznego i szybki proces powrotu do zdrowia6,8,9 . W tym sensie model ten przypomina kliniczne przypadki zawału torebki, które wykazują długotrwałe upośledzenie funkcjonalne.
Najważniejszymi etapami w rozwoju opisanego modelu zawału torebki są: 1...

Do niedawna modele "udaru istoty szarej (GMS)" były używane wyłącznie do zrozumienia patofizjologii udaru i do kierowania rozwojem nowych metod leczenia. Obserwuje się jednak coraz częstsze występowanie udaru, który dotyka podkorowej istoty białej u osób starszych, co stanowi 15 - 25% wszystkich udarów1,2. Przeprowadzono liczne badania dotyczące udaru mózgu przy użyciu modeli GMS, podczas gdy istnieje niewiele badań, w których wykorzystano modele udaru istoty białej (WMS). Istota biała u gryzoni jest znacznie mniejsza niż istota biała u ludzi lub naczelnych. W związku z tym trudniej jest selektywnie uzyskać dostęp i zniszczyć docelowe obszary w istocie białej3. Ponadto do tej pory nie opracowano skutecznych narzędzi do selektywnego niszczenia planowanego zasięgu docelowej istoty białej. W związku z tym brakowało odpowiednich modeli do badania udarów istoty białej.
Modele udarów u zwierząt są często używane do monitorowania postępu regeneracji motorycznej w celu opracowania nowych metod rehabilitacyjnych i terapeutycznych. Idealnym rozwiązaniem jest wykorzystanie modelu zwierzęcego, który wykazuje długotrwały deficyt neurologiczny zgodny ze zmianami anatomicznymi wykazywanymi w udarze mózgu4,5. W związku z tym szybkie odzyskanie deficytu motorycznego i szerokie zaangażowanie mózgu po zawale może nie być realistyczne w prowadzeniu badań nad udarem. Poprzednie modele zawału torebki były wykonywane przez zamknięcie tętnicy szyjnej wewnętrznej lub przednich tętnic naczyniówkowych i dyfuzję endoteliny-1 (ET-1) do torebki wewnętrznej6-9. Niemniej jednak niedrożność tętnic wymaga starannego rozwarstwienia tętnic, ale powoduje powstanie szerokiego obszaru uszkodzenia zawału, w tym torebki wewnętrznej, bez utrzymujących się deficytów behawioralnych. Co więcej, ET-1 nie był dyfundowany w celu całkowitego zniszczenia tylnej kończyny torebki wewnętrznej, a tym samym mniej wyraźnego lub utrzymującego się deficytu behawioralnego.
Model zawału fotozakrzepowego jest szeroko stosowany do generowania różnych typów zmian zawałowych w korze i strukturach podkorowych10. Technika ta obejmuje podanie dożylne, a następnie oświetlenie ogniskowe, które prowadzi do agregacji płytek krwi w małych naczyniach i powstania zmian zawałowych10. Technika fotozakrzepowa jest szeroko stosowana do tworzenia zmian GMS, podczas gdy rzadko jest stosowana do generowania zmian WMS5,11. W przypadku tej techniki wykazano, że połączenie barwnika Rose Bengal i promieniowania świetlnego jest przydatne w niszczeniu struktury docelowej, powodując odpowiednie deficyty funkcjonalne. Kluczowym elementem techniki fotozakrzepowej jest naświetlanie światłem, ponieważ to ono decyduje o wielkości zmian zawałowych. Naświetlanie światłem powoduje różny wpływ na istotę szarą i istotę białą, ponieważ rozpraszanie światła jest ponad 4 razy większe w istocie białej w porównaniu z istotą szarą12; W związku z tym, jeśli natężenie światła ma wystarczająco niskie natężenie promieniowania (<1 140 mW/mm2), można ograniczyć rozciągłość, do której zmiany fotozakrzepowe wpływają na zasięg istoty białej (tj. kapsułki wewnętrznej). Na przykład światło o wyższej energii może wywołać zawał zarówno w istocie szarej, jak i białej, ale światło o niższej energii może wywołać fotozakrzepicę tylko w istocie białej. Co więcej, przenikanie energii świetlnej było bardzo ograniczone. Około 99% energii świetlnej zostało utracone na odległość większą niż 1 mm od źródła światła13. Dlatego oczekuje się, że precyzyjnie ukierunkowane światło o niższej energii indukuje fotozakrzepicę tylko w istocie białej przy minimalnym naruszeniu sąsiedniej istoty szarej.
Tutaj opisujemy nowatorską metodę tworzenia zmian na zawale w obszarze kończyn przednich torebki wewnętrznej u gryzoni. Opisujemy sposób identyfikacji obszaru kończyny przedniej w kapsule wewnętrznej, technologię naświetlania światłem, w tym regulację i dostarczanie światła oraz powstawanie zmiany zawałowej. Opisujemy również testy behawioralne stosowane do oceny kompletności modelowania torebki.

<table><tbody><tr><td>Regulator temperatury prądu stałego</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.</td><td></td><td></td>ATC1000</tr><tr><td>Cyfrowe instrumenty stereotaktyczne</td><td>STOELTING CO.</td><td>51900</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator elektryczny</td><td>CyberMedic Corp.</td><td>Żywica epoksydowa EMGFES 2000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Produkty z włókien precyzyjnych, INC.</td><td>PFP-353ND1</td><td>Proporcje mieszania: 10 (A):1 (B-utwardzacz) wagowo&nbsp; Harmonogram utwardzania: 1 min @ 150 &deg; C 2 ~ 5 min @120 &deg; C 5 ~ 10 min @100 &deg; C 15 ~ 30 min @80 &deg; C</td></tr><tr><td>Skryba światłowodowy&nbsp;</td><td>THORLABS, INC</td><td>S90R</td><td></td></tr><tr><td>światłowodowy</td><td>KOREA OPTRON Corp.</td><td></td><td>Średnica zewnętrzna: 3 mm & Oslash; 200 i mikro; m 0,39 NA FC/PC-FC/PC 1 m</td></tr><tr><td>Zasilacz laserowy</td><td>CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD.</td><td>MGL-FN-532nm-200mW-14010196</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień zaciskany&nbsp;</td><td>DAWOOTECH CO., LTD.</td><td></td><td>Długość: 19 mm Średnica wewnętrzna: 3 mm Średnica zewnętrzna: 3,8 mm Materiał:</td></tr><tr><td>Sterownik pompy strzykawkowej SUS Micro4-micro</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>95100</td><td></td></tr><tr><td>Miernik mocy optycznej</td><td>THOLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Diamentowy arkusz do docierania (polerowania)</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF3D Ziarnistość</td><td>: 3 &mikro; </td></tr><tr><td>m Diamentowa blacha do docierania (polerowania)</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF6D</td><td>Ziarnistość: 6 i mikro; m</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>SIGMA-ALDRICH CO. LLC.</td><td>330000</td><td></td></tr><tr><td>Igła do znieczulenia podpajęczynówkowego z końcówką ołówkową (igła do kręgosłupa)&nbsp;</td><td>B.BRAUN MELSUNGEN AG&nbsp;</td><td>4502027</td><td>Rozmiar: 27 G Długość: 88 mm Igła: 0,40 mm</td></tr><tr><td>Wodoodporny papier ścierny&nbsp;</td><td>DEERFOS CO., LTD</td><td>CC261</td><td>Ziarnistość: 1,000 &mikro; m</td></tr><tr><td>Nanofil 10&nbsp; &mikro; l strzykawka</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33&nbsp; Igła G BVLD</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Wirus AAV-GFP</td><td>UNC Vector Core</td><td>AAV2-CamKIIa-eYFP</td><td>2 x 1012 cząsteczki wirusa/ml</td></tr><tr><td>Białko anty-zielonej fluorescencji, frakcja IgG królika</td> Life <td>Technologies, przeciwciało pierwotne INC</td><td>A11122</td><td>(1:200)</td></tr><tr><td>Kozioł IgG anty-królicze IgG (H + L)</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11034</td><td>wtórne przeciwciało (1:500)</td></tr><tr><td>Ceftezole</td><td>GUJU Pharma CO., LTD.</td><td>A27802741</td><td>0,1%, 1 ml</td></tr><tr><td>chlorowodorku lidokainy do wstrzykiwań</td><td>JEIL PHARMACEUTICAL CO., LTD.</td><td>A04900271</td><td>2%, 1 ml</td></tr><tr><td>Wiertarka z rękojeścią</td><td>Seshin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy miernik mocy optycznej i energii</td><td>THORLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>UNIBIOTech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie zawału torebki opisanej techniką fotozakrzepową

Circumscribed Capsular Infarct Modeling Using a Photothrombotic Technique

Niedawny wzrost częstości występowania udaru istoty białej wymaga konkretnych badań w tej dziedzinie. Jednak brak odpowiedniego modelu zwierzęcego udaru istoty białej utrudnił badania naukowe. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę tworzenia ograniczonego zawału torebki, która minimalizuje uszkodzenia sąsiednich struktur istoty szarej. Zastosowaliśmy przedoperacyjne śledzenie neuronalne za pomocą białka zielonej fluorescencji związanego z wirusem związanym z adenowirusem (AAV-GFP) w celu zidentyfikowania somatotopowej organizacji obszaru kończyny przedniej w torebce wewnętrznej. Regulacja natężenia światła w oparciu o różne właściwości optyczne istoty szarej i białej przyczynia się do selektywnego niszczenia istoty białej przy względnym zachowaniu istoty szarej. Dokładne umiejscowienie interfejsu wzrokowo-nerwowego umożliwia zniszczenie całego obszaru kończyn przednich w torebce wewnętrznej, co prowadzi do wyraźnego i utrzymującego się deficytu ruchowego. W ten sposób technika ta powoduje wysoce powtarzalne zmiany w zawale torebki z trwałym deficytem motorycznym. Model będzie pomocny nie tylko w badaniu udaru istoty białej (WMS) na poziomie behawioralnym, obwodowym i komórkowym, ale także w ocenie jego przydatności do opracowywania nowych interwencji terapeutycznych i rehabilitacyjnych.

Zaprezentowana tutaj metoda ma na celu wywołanie ograniczonego zawału torebki wewnętrznej z trwałym deficytem motorycznym. Dlatego kluczowe jest prawidłowe wyznaczenie celu w obrębie torebki wewnętrznej na etapie przedoperacyjnym. Mapowanie somatotopowe włókien piramidowych w torebce wewnętrznej nie zostało do dziś jednoznacznie ustalone. Aby prawidłowo zidentyfikować cel w torebce wewnętrznej, należy wyznaczyć obszar odpowiadający przedniej kończynie. Iniekcja AAV-GFP do obszaru przedn...

Ten manuskrypt opisuje technikę modelowania zawału torebkowego. W tym przypadku zastosowaliśmy zmodyfikowaną technikę fotozakrzepową o niskim natężeniu światła po przedoperacyjnym mapowaniu celu. Za pomocą tej techniki stworzyliśmy opisany model zawału torebki z trwałym upośledzeniem ruchowym.

Modelowanie zawału torebki opisanej techniką fotozakrzepową

Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for ...

Ogólnym celem tej techniki jest stworzenie modelu ograniczonego zawału torebki z trwałym deficytem motorycznym z wykorzystaniem techniki fototromboticznej. Przed wywołaniem zawału torebki konieczne jest zidentyfikowanie obszaru kończyny przedniej w torebce wewnętrznej poprzez wprowadzenie wirusa towarzyszącego adenowirusom wykazującego ekspresję GFP do obszaru kończyny przedniej kory ruchowej. Procedurę należy rozpocząć od umieszczenia znieczulonego szczura w aparacie stereotaksycznym.Następnie należy ogolić głowę szczura i wysterylizować skórę czaszki, używając 70% alkoholu oraz roztworu powidonu i jodu. W miejsce planowanego nacięcia skóry czaszki należy wstrzyknąć 2% Lidokainy hydrochlorid, aby zmniejszyć ból śródoperacyjny. Należy zastosować maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu oczu.Następnie przykryj zwierzę jałową draperią. Po wykonaniu dwucentymetrowego cięcia w linii środkowej skóry głowy, ustaw ramię stereotaktyczne, aby zlokalizować obszar kory ruchowej odpowiedzialny za kończynę przednią, zgodnie ze współrzędnymi stereotaktycznymi. Wywierć otwór wejściowy w tym miejscu.Przesuń igłę nad wywiercony otwór i wprowadź ją na jeden milimetr przez oponę twardą do kory rucho

circumscribed-capsular-infarct-modeling-using-photothrombotic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje procedurę generowania udaru fotozakrzepowego w modelu mysim poprzez laserowe oświetlenie nienaruszonej czaszki po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru fotozakrzepowego w modelu mysim: technika oświetlenia laserowego przez czaszkę myszy po podaniu barwnika światłoczułego w celu wywołania fotozakrzepicy

Fotozakrzepica to szybka, minimalnie inwazyjna technika wywoływania małego i dobrze zdefiniowanego zawału w obszarach zainteresowania w wysoce powtarzalny sposób. Jest szczególnie przydatny do badania odpowiedzi komórkowych i molekularnych leżących u podstaw plastyczności mózgu u myszy transgenicznych.

Fotozakrzepowe niedokrwienie: minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmiany korowej do badań nad udarem u myszy

Tutaj opisujemy półinwazyjną metodę mikroskopii optycznej do indukcji skrzepu fotozakrzepowego Rose Bengal w korze somatosensorycznej myszy in vivo.  Opisano techniczne aspekty procedury obrazowania, począwszy od indukcji zdarzenia fotozakrzepowego, a skończywszy na zastosowaniu i gromadzeniu danych.

Fotozakrzepica różana bengalska za pomocą konfokalnego obrazowania optycznego in vivo: model udaru pojedynczego naczynia

Fotozakrzepica jest minimalnie inwazyjną i wysoce powtarzalną procedurą wywoływania ogniskowego niedokrwienia rdzenia kręgowego i służy jako model uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy.

Ogniskowe niedokrwienie wywołane fotozakrzepicą jako model uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Udar mózgu jest globalnym problemem, z minimalnymi możliwościami leczenia i brakiem obecnie klinicznej terapii regenerującej utraconą tkankę mózgową. W tym miejscu opisujemy metody tworzenia precyzyjnego udaru fotozakrzepowego w korze ruchowej gryzoni, a następnie wstrzykiwania biomateriałów hydrożelowych w celu zbadania ich wpływu na regenerację tkanek po udarze.

Wstrzyknięcie hydrożelowych rusztowań biomateriałowych do mózgu po udarze mózgu

Tradycyjne modele udaru fotozakrzepowego (PTS) głównie indukują gęste agregaty płytek krwi o wysokiej odporności na tkankowe leczenie aktywatorem plazminogenu (tPA)-litycznym. Tutaj zmodyfikowany mysi model PTS jest wprowadzany przez jednoczesne wstrzykiwanie trombiny i barwnika światłoczułego w celu fotoaktywacji. Model PTS wzmocniony trombiną wytwarza mieszane skrzepy płytkowo-fibrynowe i jest bardzo wrażliwy na trombolizę tPA.

Wzbogacony fibryną i wrażliwy na tPA model udaru fototrombotycznego

Tutaj opisany jest model udaru fotozakrzepowego, w którym udar jest wytwarzany przez nienaruszoną czaszkę poprzez wywołanie trwałej okluzji mikronaczyniowej za pomocą oświetlenia laserowego po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru u myszy: ogniskowe zmiany korowe spowodowane fotozakrzepicą

Stosując całkowicie optyczne podejście, udar niedokrwienny jest indukowany, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów Ca2+ za pomocą fluorescencyjnego biosensora w wyłaniającym się rdzeniu udaru czujnej, zachowującej się myszy.

Jednoczesna fotozakrzemia i fotometria włókien w celu wywołania i monitorowania udaru niedokrwiennego u zachowujących się myszy

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Poznaj zmodyfikowaną technikę fotozakrzepową do modelowania zawału torebki wewnętrznej u szczurów. Ta metoda umożliwia precyzyjne wywołanie ograniczonego zawału z trwałym upośledzeniem ruchowym.

Modelowanie zawału torebki opisanej techniką fotozakrzepową

Przeglądaj więcej filmów