Modelowanie zawału torebki opisanej techniką fotozakrzepową
2 czerwca 2016
Ten manuskrypt opisuje technikę modelowania zawału torebkowego. W tym przypadku zastosowaliśmy zmodyfikowaną technikę fotozakrzepową o niskim natężeniu światła po przedoperacyjnym mapowaniu celu. Za pomocą tej techniki stworzyliśmy opisany model zawału torebki z trwałym upośledzeniem ruchowym.
Ogólnym celem tej techniki jest stworzenie modelu ograniczonego zawału torebki z trwałym deficytem motorycznym z wykorzystaniem techniki fototromboticznej. Przed wywołaniem zawału torebki konieczne jest zidentyfikowanie obszaru kończyny przedniej w torebce wewnętrznej poprzez wprowadzenie wirusa towarzyszącego adenowirusom wykazującego ekspresję GFP do obszaru kończyny przedniej kory ruchowej. Procedurę należy rozpocząć od umieszczenia znieczulonego szczura w aparacie stereotaksycznym.
Następnie należy ogolić głowę szczura i wysterylizować skórę czaszki, używając 70% alkoholu oraz roztworu powidonu i jodu. W miejsce planowanego nacięcia skóry czaszki należy wstrzyknąć 2% Lidokainy hydrochlorid, aby zmniejszyć ból śródoperacyjny. Należy zastosować maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu oczu.
Następnie przykryj zwierzę jałową draperią. Po wykonaniu dwucentymetrowego cięcia w linii środkowej skóry głowy, ustaw ramię stereotaktyczne, aby zlokalizować obszar kory ruchowej odpowiedzialny za kończynę przednią, zgodnie ze współrzędnymi stereotaktycznymi. Wywierć otwór wejściowy w tym miejscu.
Przesuń igłę nad wywiercony otwór i wprowadź ją na jeden milimetr przez oponę twardą do kory ruchowej. Za pomocą wysokoprecyzyjnej mikropompy powoli wstrzyknij jeden mikrolitr wirusa. Pozostaw igłę w miejscu przez kolejne 10 minut, aby zapobiec cofaniu się preparatu wzdłuż kanału wprowadzenia igły.
Po upływie 10 minut powoli wycofaj igłę. Po oczyszczeniu miejsca operowanego za pomocą płukania solutym, zamknij ranę szwem nylonowym 3-0. Następnie zwolnij szczura z ramki stereotaktycznej i przenieś go do komory rekonwalescencyjnej w celu monitorowania.
Podaj lek przeciwbólowy w celu opanowania bólu pooperacyjnego. Po dwóch do trzech tygodniach utnij szczura zgodnie z zatwierdzonymi metodami i wykonaj sekcje krioprotekcjonowanego mózgu. Po barwieniu na GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zaobserwuj aksony transdukowane AAV-GFP w torebce wewnętrznej.
Porównaj rozmieszczenie przetransdukowanych aksonów widocznych na obrazie fluorescencyjnym z atlasem mózgu szczura, aby dokładnie określić współrzędne stereotaksyczne przetransdukowanych aksonów. Aby przygotować optyczny interfejs neuronalny, najpierw użyj wiertarki tnącej do odcięcia około czterech centymetrów igły rdzeniowej o rozmiarze 27 G ze stiletami wewnątrz. Następnie usuń 10 centymetrów izolacji z włókna optycznego.
Wprowadź pozbawiony izolacji odcinek włókna optycznego do metalowej rurki. Następnie zaciśnij rurkę wokół włókna. Po tym użyj prasy, aby dwukrotnie zacisnąć dolną połowę (1/2) metalowej rurki.
Metalowa rurka wypełnia przestrzeń między światłowodem a nasadą igły rdzeniowej. Nanieś utwardzalną ciepłem żywicę epoksydową na światłowód. Nanieś dodatkową żywicę epoksydową w pustą przestrzeń w nasadzie.
Następnie należy wprowadzić światłowód do igły spinalnej. Żywicę epoksydową utwardzać przez 20 minut w temperaturze 100 °C, aby zapewnić stabilne mocowanie. Po utwardzeniu należy przeciąć wystający z igły spinalnej światłowód, a następnie wypolerować jego końcówkę za pomocą diamentowych arkuszy polerskich.
Na koniec podłącz końcówkę FCPC patchcordu do sprzęgała systemu zielonego lasera. Następnie za pomocą cyfrowego miernika mocy i energii optycznej zmierz natężenie światła na końcu światłowodu, aby upewnić się, że emisja światła jest prawidłowa. Pod ciałem zwierzęcia umieść podgrzewacz, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37.5 °C przez cały czas trwania operacji.
Zacznij od znieczulenia i przygotowania szczura do operacji zgodnie z wcześniejszą procedurą. Po wykonaniu dwucentymetrowego cięcia w linii środkowej, dostosuj wysokość zacisku nosowego tak, aby Bregma i Lambda znajdowały się na tym samym poziomie. Prawidłowe wyrównanie jest kluczowe dla precyzyjnego celowania w torebkę wewnętrzną.
Ustaw ramię stereotaktyczne, aby zlokalizować miejsce fototrombozy. Następnie wywierć w tym punkcie otwór o średnicy dwóch milimetrów. Potem wypoleruj i oczyść końcówkę włókna optycznego ONI, a następnie zamocuj ją do ramy stereotaktycznej, unikając jej zagięcia.
Sprawdź końcówkę interfejsu optycznego (ONI), aby upewnić się, że jest czysta i nieuszkodzona. Przed wprowadzeniem interfejsu optycznego do docelowego miejsca w mózgu szczura zmierz natężenie lasera na końcówce światłowodu. Dostosuj natężenie lasera do wartości 3,5 milliwattów na końcówce światłowodu.
Teraz opuść ONI do docelowego obszaru torebki wewnętrznej, korzystając z koordynaty grzbietowo-brzusznej wyznaczonej w pierwszej sekcji protokołu. Następnie wstrzyknij 2 mg/kg Rose Bengal przez żyłę ogonową i uruchom timer odliczający jedną minutę. Po upłynięciu minuty włącz zielony laser o długości fali 532 nm na 90 sekund, aby wywołać zawał.
Po naświetlaniu ostrożnie usuń ONI z mózgu. Po oczyszczeniu pola operacyjnego zabezpiecz ranę szwem nylonowym 3-0. Następnie wyjmij szczura z aparatu stereotaksycznego i przenieś go do komory rekonwalescencyjnej.
Na tym obrazie przedstawiono zasięg zmian zawałowych przy różnych intensywnościach światła laserowego, od 2 mW do 5 mW, dwa tygodnie po wywołaniu fototromboticznej zmiany. Strzałki wskazują zmianę zawałową. W tej konfiguracji eksperymentalnej przyjmuje się, że intensywność światła optycznego wynosi od 3 mW do 4 mW.
Kolejne dwa obrazy przedstawiają wygląd mikroskopowy zawału torebki trzy tygodnie po fototrombosie. Na tym przekroju czołowym mózgu szczura groty strzałek wskazują tor igły zawierającej światłowód w wzgórzu i prowadzącej do torebki wewnętrznej. Te seryjne, barwione sekcje ukazują zasięg zmiany zawałowej w torebce wewnętrznej.
Strzałki wskazują obszar zawału.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę modelowania zawału torebki za pomocą zmodyfikowanej metody fototromboticznej. Podejście to umożliwia stworzenie modelu ograniczonego zawału torebki, który skutkuje trwałą dysfunkcją motoryczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neurobiologia
- Zaburzenia motoryczne
Wstęp
- Zawały torebkowe wiążą się z deficytami motorycznymi.
- Techniki fototrombtyczne są wykorzystywane do indukowania zlokalizowanych uszkodzeń mózgu.
- Zrozumienie mechanizmów upośledzenia funkcji motorycznych jest kluczowe dla opracowania strategii terapeutycznych.
- Mapowanie celu jest niezbędne do dokładnego stworzenia modelu.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu zawału torebkowego.
- Zbadanie wpływu zawałów torebkowych na funkcje motoryczne.
- Wykorzystanie zmodyfikowanej techniki fototromboticznej w celu precyzyjnego celowania.
Zastosowane metody
- Identyfikacja obszaru kończyny przedniej w torebce wewnętrznej przy użyciu wirusa towarzyszącego adenowirusom wykazującego ekspresję GFP.
- Przygotowanie szczura poprzez podanie znieczulenia i umieszczenie w aparacie stereotaksycznym.
- Sterylizacja skóry głowy i przygotowanie nacięcia.
- Iniekcja lidokainy w celu zminimalizowania bólu śródoperacyjnego.
Główne wyniki
- Skuteczne stworzenie modelu ograniczonego zawału torebki wewnętrznej.
- Wykazanie trwałych zaburzeń motorycznych po zawale.
- Walidacja zmodyfikowanej techniki fototromboplastycznej.
- Opracowanie powtarzalnej metody do przyszłych badań.
Wnioski
- Zmodyfikowana technika fototrombotyczna jest skuteczna w modelowaniu zawałów torebkowych.
- Model ten może być wykorzystany do badania zaburzeń motorycznych oraz potencjalnych interwencji.
- Dalsze badania są niezbędne do zgłębienia mechanizmów leżących u podstaw deficytów motorycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta technika fototrombotyczna umożliwia precyzyjne modelowanie udaru w obrębie istoty białej poprzez selektywne celowanie w torebkę wewnętrzną przy jednoczesnym oszczędzaniu przyległej istoty szarej. Powstały w ten sposób ograniczony zawał torebki powoduje trwałe deficyty motoryczne, dostarczając istotnego z punktu widzenia choroby systemu do mechanistycznej oceny ryzyka kandydatów na leki neuroterapeutyczne. Model ten wspiera walidację celów oraz przedkliniczną ocenę interwencji ukierunkowanych na patologię istoty białej, wypełniając krytyczną lukę w badaniach nad udarem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z patofizjologią udaru w istocie białej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia istotny dla przebiegu choroby system do funkcjonalnej walidacji celów w obwodach ruchowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie lokalizacji zawału z trwałą dysfunkcją ruchową.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na wyznaczenie mierzalnych objętości zmian poprzez miareczkowanie intensywności optycznej w celu oceny odpowiedzi na dawkę.
- Wartość operacyjna: Umożliwia uzyskanie wysoce powtarzalnych modeli zawałów z powtarzalnymi wynikami deficytów motorycznych.
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewania związków w badaniach nad neuroprotekcją lub neuroregeneracją.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Modele udaru w istocie białej na poziomach behawioralnym, obwodowym i komórkowym w celu walidacji przedklinicznej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Uzasadnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o specyficzność zmiany oraz korelację z wynikiem funkcjonalnym.
- Korelacja z biomarkerami: Ułatwia korelację zakresu zawału z nasileniem deficytów motorycznych w celu opracowania prognostycznych biomarkerów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od identyfikacji celu po przedkliniczne testy skuteczności – umożliwiając iteracyjne udoskonalanie strategii neuroterapeutycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących podatności białej materii oraz zaburzeń specyficznych dla obwodów szlaków ruchowych.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki precyzyjnej kontroli zmian chorobowych i ilościowej ocenie deficytów ruchowych.
- Analityka: Zapewnia wolumetryczne pomiary obszaru zawału oraz odczyty behawioralne do analizy porównawczej różnych stanów.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez trwałe fenotypowanie deficytów ruchowych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną platformę do iteracyjnego testowania związków neuroprotekcyjnych i rehabilitacyjnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w zakresie oddziaływania na cel dzięki selektywnemu modelowaniu zawału istoty białej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki kalibracji intensywności lasera i celowaniu stereotaktycznemu.
- Wartość strategiczna: Zmniejszenie ryzyka biologicznego na późnych etapach poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka mechanistycznego w obrębie szlaków istoty białej.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zdolność do łagodzenia trwałych deficytów motorycznych w zwalidowanym modelu.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w dostarczaniu wektorów wirusowych, chirurgii stereotaktycznej oraz wytwarzaniu optycznych interfejsów neuronalnych.
- Zależy od precyzyjnej aparatury, w tym od aparatów stereotaktycznych, mikroinjektorów i skalibrowanych systemów laserowych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie spójności miana wirusów, przygotowania włókien optycznych i monitorowania pooperacyjnego.
- Kwestie adaptacyjne obejmują specyficzne dla gatunku współrzędne stereotaktyczne oraz właściwości optyczne istoty szarej w porównaniu do istoty białej.
- Ograniczenia praktyczne obejmują złożoność zabiegu chirurgicznego oraz konieczność walidacji pooperacyjnej za pomocą histologii i analizy behawioralnej.
