Modelowanie zawału torebki opisanej techniką fotozakrzepową
2 czerwca 2016
Ten manuskrypt opisuje technikę modelowania zawału torebkowego. W tym przypadku zastosowaliśmy zmodyfikowaną technikę fotozakrzepową o niskim natężeniu światła po przedoperacyjnym mapowaniu celu. Za pomocą tej techniki stworzyliśmy opisany model zawału torebki z trwałym upośledzeniem ruchowym.
Ogólnym celem tej techniki jest stworzenie opisanego modelu zawału torebki z trwałym upośledzeniem motorycznym przy użyciu techniki fotozakrzepowej. Przed utworzeniem zawału torebki konieczne jest zidentyfikowanie obszaru kończyny przedniej w torebce wewnętrznej poprzez wprowadzenie wirusa związanego z adenowirusem eksprymującym GFP do obszaru kończyn przednich kory ruchowej. Zacznij od umieszczenia znieczulonego szczura w stereotaktycznej ramce.
Następnie ogol głowę szczura i wysterylizuj skórę głowy za pomocą 70% alkoholu i roztworu powidonu i jodu. Wstrzyknąć 2% chlorowodorek lidokainy pod skórę głowy w obszar zamierzonego nacięcia skóry głowy, aby zmniejszyć ból śródoperacyjny. Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
I umieść sterylną serwetę na zwierzęciu. Po wykonaniu dwucentymetrowego nacięcia w linii środkowej skóry głowy, ustaw ramię stereotaktyczne tak, aby zidentyfikować obszar kończyn przednich kory ruchowej zgodnie ze współrzędnymi stereotaktycznymi. Wywierć otwór wejściowy w tym miejscu.
Przesuń igłę do wywierconego otworu i opuść igłę o jeden milimetr przez oponę twardą i do kory ruchowej. Użyj precyzyjnej mikropompy, aby powoli wstrzyknąć jeden mikrolitr wirusa. Pozostawić igłę na miejscu przez dodatkowe 10 minut, aby zapobiec cofaniu się igły w górę przewodu igły.
Po upływie 10 minut powoli wyjąć igłę. Po oczyszczeniu miejsca operacyjnego za pomocą irygacji solą fizjologiczną należy zabezpieczyć ranę nylonowym szwem 3-0. Następnie uwolnij szczura z ramy stereotaktycznej i przenieś go do komory odzyskiwania w celu monitorowania.
Podawać leki przeciwbólowe w celu kontroli bólu pooperacyjnego. Po dwóch do trzech tygodniach należy złożyć szczura w ofierze zgodnie z zatwierdzonymi metodami i podzielić mózg chroniony kriogenicznie. Po barwieniu na obecność GFP obserwuj aksony transdukowane przez AAV-GFP w wewnętrznej torebce za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Porównaj lokalizacje transdukowanych aksonów, jak widać na obrazie fluorescencyjnym, z atlasem mózgu szczura, aby dokładnie określić współrzędne stereotaktyczne transdukowanych aksonów. Aby przygotować optyczny interfejs neuronowy, najpierw użyj wiertła tnącego, aby przeciąć około czterech centymetrów igły rdzeniowej o rozmiarze 27 ze sztyfłem w środku. Następnie zdejmij 10 centymetrów płaszcza ze światłowodu.
Włóż nieosłonięty kawałek światłowodu do metalowej rurki. I zaciśnij rurkę wokół włókna. Następnie za pomocą docisku dwukrotnie zaciśnij dolną 1/2 metalowej rurki.
Metalowa rurka wypełnia przestrzeń między światłowodem a piastą igły rdzeniowej. Nałóż żywicę epoksydową utwardzaną termicznie na światłowód. Nałóż dodatkową żywicę epoksydową na pustą przestrzeń w piaście.
I włóż światłowód do igły rdzeniowej. Utwardzaj żywicę epoksydową przez 20 minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza, aby uzyskać stabilne utrwalenie. Po utwardzeniu rozetnij światłowód wystający z igły rdzeniowej, a następnie użyj diamentowych arkuszy docierających, aby wypolerować światłowód na końcu igły rdzeniowej.
Na koniec podłącz część złącza FCPC krosowego do łącznika systemu zielonego lasera. Następnie użyj cyfrowego miernika mocy optycznej i energii, aby zmierzyć natężenie światła z końcówki światłowodu, aby zapewnić dokładną emisję światła. Umieść poduszkę rozgrzewającą pod ciałem zwierzęcia, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37,5 stopnia Celsjusza
.Zacznij od znieczulenia i przygotowania szczura do operacji, tak jak poprzednio. Po wykonaniu dwucentymetrowego nacięcia w linii środkowej, wyreguluj wysokość zacisku nosowego, aż Bregma i Lambda znajdą się na tym samym poziomie. Prawidłowe wyrównanie ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego wycelowania w kapsułę wewnętrzną.
Ustaw ramię stereotaktyczne, aby zlokalizować miejsce fotozakrzepicy. Następnie wywierć w tym miejscu otwór o średnicy dwóch milimetrów. Następnie wypoleruj i wyczyść końcówkę światłowodu ONI, a następnie przymocuj ją do ramy stereotaktycznej bez zginania.
Sprawdź końcówkę ONI, aby upewnić się, że jest czysta i nienaruszona. Zmierz natężenie lasera od końcówki światłowodu przed wprowadzeniem interfejsu optycznego do miejsca docelowego mózgu szczura. Dostosuj intensywność lasera do 3,5 miliwata na końcówce światłowodu.
Teraz opuść ONI do obszaru docelowego kapsułki wewnętrznej, używając współrzędnej grzbietowo-brzusznej określonej w pierwszej sekcji protokołu. Następnie wstrzyknij dwa miligramy na kilogram Rose Bengal przez żyłę ogonową, a następnie uruchom minutnik ustawiony na jedną minutę. Po upływie minuty włącz zielony laser o długości 532 nanometrów na 90 sekund, aby wywołać zawał.
Po napromieniowaniu delikatnie usuń ONI z mózgu. Po oczyszczeniu miejsca operowanego należy zabezpieczyć ranę szokiem nylonowym 3-0. Następnie wyjmij szczura z ramy stereotaktycznej i przenieś go do komory regeneracyjnej.
Obraz ten pokazuje rozległość zmian zawałowych przy różnym natężeniu światła laserowego od dwóch miliwatów do pięciu miliwatów dwa tygodnie po zmianie fotozakrzepowej. Strzałki wskazują zmianę zawału. Uważa się, że natężenie światła optycznego wynosi od trzech miliwatów do czterech miliwatów w tym eksperymentalnym ustawieniu.
Kolejne dwa obrazy pokazują mikroskopijny wygląd zawału torebki trzy tygodnie po fotozakrzepicy. W tej koronalnej części mózgu szczura groty strzał wskazują drogę igły zawierającej światłowód we wzgórzu i aż do wewnętrznej torebki. Te szeregowo zagnieżdżone barwione skrawki pokazują zakres zmiany zawałowej w torebce wewnętrznej.
Strzałki wskazują zmianę zawału.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy rękopis opisuje technikę modelowania infarktu kapsyli za pomocą zmodyfikowanej techniki fototrombotyka. To podejście pozwala na stworzenie ograniczonego modelu infarktu kapsyli, który prowadzi do trwałego upośledzenia ruchowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Neurobiologia
- Upośledzenie ruchowe
Tło
- Infarkty kapsyli są związane z deficytami ruchowymi.
- Techniki fototrombotyka są stosowane do wywoływania zlokalizowanych urazów mózgu.
- Zrozumienie mechanizmów upośledzenia ruchowego jest kluczowe dla opracowania strategii terapeutycznych.
- Mapowanie docelów jest istotne dla dokładnego tworzenia modelu.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu infarktu kapsyli.
- Zbadanie wpływu infarktów kapsyli na funkcję motoryczną.
- Wykorzystanie zmodyfikowanej techniki fototrombotyka do precyzyjnego ukierunkowania.
Stosowane metody
- Identyfikacja obszaru kończyny przedniej w kapsyli wewnętrznej za pomocą wirusa adeno-stowarzyszonego ekspresującego GFP.
- Przygotowanie szczura przez znieczulenie i umieszczenie w rama stereotaktycznym.
- Sterylizacja skóry głowy i przygotowanie nacięcia.
- Wstrzyknięcie lidokainy w celu zminimalizowania bólu pooperacyjnego.
Główne wyniki
- Udane stworzenie ograniczonego modelu infarktu kapsyli.
- Wykazanie trwałego upośledzenia ruchowego po infarkcie.
- Walidacja zmodyfikowanej techniki fototrombotyka.
- Ustanowienie metody powtarzalnej dla przyszłych badań.
Wnioski
- Zmodyfikowana technika fototrombotyka jest skuteczna w modelowaniu infarktów kapsyli.
- Ten model może być wykorzystany do badania upośledzeń ruchowych i potencjalnych interwencji.
- Wymagane są dalsze badania w celu zbadania podstawowych mechanizmów deficytów ruchowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This photothrombotic technique enables precise modeling of white matter stroke by selectively targeting the internal capsule while sparing adjacent gray matter. The resulting circumscribed capsular infarct produces persistent motor deficits, providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking of neurotherapeutic candidates. The model supports target validation and preclinical assessment of interventions aimed at white matter pathology, addressing a critical gap in stroke research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to white matter stroke pathophysiology.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for functional target validation in motor circuitry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking infarct location to persistent motor impairment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable lesion volumes via optical intensity titration for dose-response assessment.
- Operational Value: Delivers highly replicable infarct models with consistent motor deficit readouts.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening in neuroprotection or neurorepair.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models white matter stroke at behavioral, circuit, and cellular levels for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on lesion specificity and functional outcome correlation.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of infarct extent with motor deficit severity for predictive biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through preclinical efficacy testing, enabling iterative refinement of neurotherapeutic strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of white matter vulnerability and circuit-specific motor pathway disruption.
- Screening: Enables assay standardization through precise lesion control and quantitative motor deficit scoring.
- Analytics: Provides volumetric infarct measurements and behavioral readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via persistent motor deficit phenotyping.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of neuroprotective and rehabilitative compounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through selective white matter infarct modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser intensity calibration and stereotaxic targeting.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of white matter pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on ability to mitigate persistent motor deficits in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector delivery, stereotaxic surgery, and optical neural interface fabrication.
- Depends on precision instrumentation including stereotaxic frames, microinjectors, and calibrated laser systems.
- Necessitates cross-team standardization for viral titer consistency, optical fiber preparation, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include species-specific stereotaxic coordinates and optical properties of gray versus white matter.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for postoperative validation via histology and behavior.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
