Name: Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metodę modyfikacji genetycznej komórek macierzystych w strefie V-SVZ dorosłej myszy za pomocą cząstek lentiwirusowych. Technika umożliwia analizę autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych w niszy neurogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za pomoc M.J. Palopa i wsparcie techniczne SCSIE z Universidad de Valencia. Dziękujemy również Antonii Follenzi za pomocne komentarze i dyskusję na temat manuskryptu. I.F jest wspierany przez Fundaciòn Botìn, przez Banco Santander za pośrednictwem Globalnego Oddziału Uniwersytetów Santander oraz przez granty z Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP i ISIC) i Ministerio de Economìa y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED i RETIC TerCel). Prace te były również wspierane przez granty BFU2010-21823 i RETIC TerCel od MINECO i Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) 2012-StG (311736- PD-HUMMODEL) dla A.C. B.M-P. jest stypendystą hiszpańskiego stypendium FPI MINECO.

<ol><li>Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+bridge+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells bridge their niche.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).</li>
<li>Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+and+their+niche%3A+a+dynamic+duo+during+homeostasis%2C+regeneration%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).</li>
<li>Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+progression+from+stem+cells+to+new+neurons+in+the+adult+brain+ventricular-subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone.</a> Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).</li>
<li>Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+oligodendrocytes+in+the+subventricular+zone+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain.</a> J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).</li>
<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).</li>
<li>Tavazoie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3A+wholemount+staining+and+ependymal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li>
<li>Ramirez-Castillejo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+epithelium-derived+factor+is+a+niche+signal+for+neural+stem+cell+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).</li>
<li>Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+from+the+choroid+plexus+to+the+subventricular+zone%3A+go+with+the+flow%21%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li>
<li>Delgado, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+NT-3+delivered+by+vasculature+and+CSF+promotes+quiescence+of+subependymal+neural+stem+cells+through+nitric+oxide+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction.</a> Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).</li>
<li>Kokovay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM1+is+essential+to+maintain+the+structure+of+the+SVZ+niche+and+acts+as+an+environmental+sensor+to+regulate+SVZ+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).</li>
<li>Porlan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MT5-MMP+regulates+adult+neural+stem+cell+functional+quiescence+through+the+cleavage+of+N-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin.</a> Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).</li>
<li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lake-front+property%3A+a+unique+germinal+niche+by+the+lateral+ventricles+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain.</a> Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).</li>
<li>Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+neural+stem+cells+in+the+subependymal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone.</a> Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).</li>
<li>Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeting+of+subventricular+zone+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo targeting of subventricular zone astrocytes.</a> Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).</li>
<li>Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+ex%2Fin+vivo+assay+to+detect+effects+of+exogenously+added+factors+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells.</a> Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).</li>
<li>Consiglio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+in+vivo+gene+transfer+into+adult+mammalian+neural+stem+cells+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).</li>
<li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Third-Generation+Lentivirus+Vector+with+a+Conditional+Packaging+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System.</a> J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Bomsel, M., Alfsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+viruses+through+the+epithelial+barrier%3A+pathogenic+trickery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).</li>
<li>Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+lentiviral+vector-mediated+transduction+on+the+tightness+of+a+polarized+model+of+airway+epithelium+and+effect+of+cationic+polymer+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine.</a> J Biomed Biotechnol. , (2010).</li>
<li>Bonazzi, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impenetrable+barriers+or+entry+portals%3F+The+role+of+cell-cell+adhesion+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection.</a> J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).</li>
<li>Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherens+junction+formation+inhibits+lentivirus+entry+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer.</a> PLoS One. 8 (11), (2013).</li>
<li>Yamashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone-derived+neuroblasts+migrate+and+differentiate+into+mature+neurons+in+the+post-stroke+adult+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum.</a> J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
</ol>

Wszystkie manipulacje zostały wykonane w pomieszczeniu o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Protokoły na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w Walencji i wszystkie były zgodne z dyrektywą europejską 2010/63/UE.

Lewa grupa wirusowa oferuje istotne korzyści w porównaniu z innymi systemami wirusowymi w zakresie modyfikacji genetycznej dorosłych NSC16,18. Stereotaktyczne dostarczanie lentiwirusów do niszy V-SVZ stanowi skuteczną metodę znakowania i śledzenia rzadko dzielących się B1-NSC, pokonując ograniczenia innych powszechnie stosowanych metod, takich jak BrdU, który jest rozcieńczany po wielu podziałach komórkowych, lub retrowirus, który celuje tylko w komórki, które proliferują w momencie aplikacji. Lewa dawka wraz ...

Mysia strefa komorowo-podkomorowa (V-SVZ), w ścianach bocznej komory skierowanej do prążkowia, jest bardzo aktywnym obszarem zarodkowym, w którym ciągły proces replikacji i różnicowania komórek progenitorowych powoduje trwałą produkcję interneuronów opuszki węchowej (OB) i oligodendrocytów ciała modzelowatego1. Wytwarzanie tych komórek przez całe życie wydaje się być wspierane przez obecność w tym regionie nerwowych komórek macierzystych (NSC; zwanych również komórkami B1), które wyrażają antygen astrocytarny glejowy fibrylarne kwaśne białko (GFAP) i markery komórek macierzystych, takie jak nestyna, Id1 i Sox22. Komórki B1 wykazujące ekspresję GFAP generują komórki progenitorowe amplifikujące tranzyt (TAP) (komórki C), które wyrażają czynniki transkrypcyjne Dlx2 (homeobox 2 bez dystalu) i Ascl1 (homolog 1 ssaków achaete-schute) i dzielą się szybko kilka razy, zanim doprowadzą do powstania migrujących neuroblastów (komórki A) lub oligodendroblastów3. Nowo wytworzone neuroblasty proliferacyjne migrują do przodu, tworząc rostralny strumień migracyjny (RMS) do OB, gdzie integrują się z warstwami ziarnistymi i kłębuszkowymi jako zróżnicowane interneurony hamujące. Migrujące młode oligodendroblasty przemieszczają się do CC, gdzie stają się niedojrzałymi komórkami NG2-dodatnimi, które nadal dzielą się lokalnie lub różnicują w dojrzałe mielinizujące oligodendrocyty1,4.
B1 komórki, które wywodzą się z płodowych promienistych komórek glejowych, zachowują wydłużoną i spolaryzowaną morfologię swoich poprzedników i wykazują wysoce wyspecjalizowany związek ze swoją niszą. Rozciągają się między wyściółczką, która wyrównuje komorę, a siecią naczyń krwionośnych, które nawadniają niszę V-SVZ. Mały wyrostek wierzchołkowy komórek B1 interkaluje się między wielorzęskowymi ependymocytami i kończy się pojedynczą nieruchomą rzęską pierwotną, podczas gdy ich wyrostek podstawowy rozciąga się na duże odległości, aby zbliżyć się do płaskiego splotu naczyniowego, który nawadnia tę niszę, kończąc się blaszką podstawy naczyń włosowatych splotu2,5-8 .
Najbardziej niezawodnym sposobem na odróżnienie B1-NSC od nieneurogennych astrocytów, które również są GFAP+, w nienaruszonej niszy V-SVZ jest oparte na całościowych przygotowaniach ściany bocznej komory i ich analizie za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D po barwieniu immunologicznym dla GFAP w celu oznaczenia cienkiego procesu wierzchołkowego B1-NSC, β-kateniny do wyznaczenia błon komórkowych, i albo γ-tubuliny jako markera rzęsek podstawnych, albo acetylowanej α-tubuliny do oznaczania zakresu każda rzęska5,8. Obserwacje tych całych wierzchowców z powierzchni komory wykazały, że komórki B1 i wyściółki są ułożone w "wiatraczki"5, w których jednorzęsowe wyrostki wierzchołkowe jednej lub kilku komórek GFAP+ B1 są otoczone rozetą wielorzęskowych komórek wyściółki.
Charakterystyczna morfologia komórek B1 koreluje z dowodami eksperymentalnymi wskazującymi, że naczynia krwionośne/komórki śródbłonka i komorowy płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) stanowią regulowane źródła rozpuszczalnych sygnałów działających na NSC2,6,9-11. Na powierzchni komory homotypowe i heterotypowe interakcje wierzchołkowo-boczne obejmujące komórki wyściółki i B1 obejmują połączenia ścisłe i połączenia adherenowe5,12. Co więcej, wykazano, że cząsteczki adhezyjne zaangażowane w kompleksy połączeniowe między komórkami B1 a wyściółką, takie jak N-kadheryna i V-CAM, regulują nie tylko wysoce zorganizowane pozycjonowanie B1 w niszy V-SVZ, ale także ich spoczynek12,13. Monowarstwa komórek wyściółki-B1 wydaje się działać jako bariera dyfuzyjna, umożliwiając regulowany przepływ wody i małych cząsteczek z płynu mózgowo-rdzeniowego, ale ograniczając przejście międzykomórkowe dużych białek10,11. Dowody eksperymentalne wskazują, że unikalnie umiejscowiona rzęska wierzchołkowa komórki B1 może odgrywać rolę jako czujnik polipeptydów sygnałowych obecnych w płynie mózgowo-rdzeniowym2,5-7. Komórki wyściółki są same w sobie również źródłem rozpuszczalnych i związanych z błoną sygnałów, które odgrywają rolę w regulacji zachowania NSC14,15.
Identyfikowalne nukleozydy, takie jak bromo-deoksyurydyna (BrdU), lub retrowirusy były powszechnie używane do oznaczania komórek progenitorowych, w tym NSC, in vivo. Jednak metody te nie są optymalne do długoterminowego śledzenia losu, ponieważ sygnały BrdU rozcieńczają się poprzez powtarzające się podziały komórkowe, a retrowirusy wydają się preferencyjnie celować w przejściowo amplifikujące komórki ze względu na ich wymóg proliferacji komórek do transdukcji16,17. Aby zbadać fizjologię NSC in vivo, w tym interakcje ze składnikami niszowymi, kluczowe jest ustalenie metody znakowania i śledzenia rzadko dzielących się komórek, ponieważ B1-NSC są w dużej mierze w stanie spoczynku, a sąsiednie komórki wyściółki nigdy nie dzielą się w warunkach fizjologicznych3. Tutaj pokazujemy, że wektory lentiwirusowe (LV) pozwalają na wysokowydajne znakowanie genów i długoterminową modyfikację dorosłych NSC i niedzielących się komórek wyściółki, ze względu na ich zdolność do transdukcji i integracji z genomem komórek docelowych w sposób niezależny od cyklu komórkowego. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób droga dostarczania i miano wirusa pomagają w specyficznej transdukcji komórek wyściółki, ale nie komórek B1, umożliwiając w ten sposób analizę zależnych od niszy, wyściółki efektów na NSC.

<table><tbody><tr><td>Część 1: Generacja LV do dostarczania in vivo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima XL-100K</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW-28</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW-55</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówki rurowe&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>358126</td><td>25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>Probówki ultrawirówkowe&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td>13 mm x 51 mm</td></tr><tr><td>Adaptery do ultrawirówek</td><td>Beckman Coulter</td><td>358156</td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa</td><td>SPL</td><td>PLC-30006</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>SPL</td><td>PLC-30024</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie 10 cm</td><td>SPL</td><td>PLC-20101</td> Probówki FACS <td>100 x 20 style</td></tr><tr><td></td><td>Afora</td><td>DE400800</td><td>12 mm x 75 mm, 5 ml</td></tr><tr><td>Sterylny filtr kubkowy FACS</td><td>BD</td><td>340626</td><td>30 & micro; m</td></tr><tr><td>Filtr nitrocelulozowy</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>0,22 &mu; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>Niebieski laser 488 nm</td></tr><tr><td>Filtr Steritop</td><td>Biofil</td><td>FPE-204-500&nbsp;</td><td>0,22 &mikro; Odczynniki m</td></tr><tr><td>Odczynniki:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE plazmid&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td>Plazmid opakowania rdzeniowego plazmid</td></tr><tr><td>pRSV.REV&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td>Plazmid opakowania rdzenia</td></tr><tr><td>pMD2G plazmid&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>Plazmid kopertowy</td></tr><tr><td>pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plazmid&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12252</td><td>Wektor transferowy plazmid</td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Medium Orła Dulbecco&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>L0101-500</td><td>Do hodowli komórkowych HeLa</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco firmy Isco&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>12440-053</td><td>Do hodowli komórek 293T</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td></td><td></td><td>Tris-HCl (sigma, T5941), 0,1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7,6,&nbsp; Bez DNAzy/RNAzy, 0,2 i mikro; m sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>2x HBS</td><td></td><td></td><td>0,28 M NaCl (Sigma, S7653), 0,05 M HEPES (Sigma, H7523), 1,5 mM bezwodny Na2HPO4 (Sigma, S7907) w dH2O (najlepiej nie MilliQ). Dostosuj pH do 7,0 za pomocą roztworu NaOH (Calbiochem, 567530).</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td>Roztwór podstawowy o stężeniu 100x, używany do przygotowania pożywki hodowlanej HeLa i 293T o końcowym stężeniu 10x.</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513-100</td><td>Roztwór podstawowy o stężeniu 200 mM, używany do przygotowania pożywki hodowlanej HeLa i 293T o końcowym stężeniu 6 mM.</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td> Life <td>technologies</td><td>11360-039</td><td>Roztwór podstawowy o stężeniu 100 mM, używany do przygotowania pożywki hodowlanej HeLa i 293T o końcowym stężeniu 1 mM.</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>Life technologie</td><td>35050-061</td><td>Służy do przygotowania pożywki hodowlanej 293T o końcowym stężeniu 1%.</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>Roztwór podstawowy zawiera 5 000 jednostek/ml penicyliny i 5 mg/ml streptomycyny. Służy do przygotowania pożywki HeLa i 293T o końcowym stężeniu 1%.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Z czerwienią fenolową, zawiera 2,5 g trypsyny wieprzowej i 0,2 g EDTA 4Na/L HBSS.</td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp; (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>Bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, 10x, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych. Roztwór podstawowy używany do przygotowania 1x PBS w wodzie klasy do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Polibren (bromek heksadimetryny)&nbsp;</td><td>Proszek Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>. Przygotuj 1,000x roztwór podstawowy o stężeniu 8 mg/ml w dH<sub2O</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd EM grade 16%</td><td>EM Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Część 2: Sterotoksyczne wstrzykiwanie LV do SSE właściwej lub komory bocznej.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vernier stereotaktyczny</td><td>instrument NeuroLab, Leica</td><td>39463001</td><td>http://www.leicabiosystems.com/</td></tr> Cunningham <tr><td>adaptor myszy i noworodka szczura</td><td>NeuroLab, Leica</td><td>39462950</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na strzykawkę</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-311-CE</td><td></td></tr><tr><td>33 strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>P/N&nbsp; &nbsp; &nbsp; 84851/00</td><td>#85RN</td></tr><tr><td>Wiertarka elektryczna</td><td>Fine Science Tool</td><td>98096</td><td></td></tr><tr><td>Koc termiczny</td><td>Ufesa</td><td>AL5512/01</td><td>230-240 V, 100-110 W, typ C_AL01</td></tr><tr><td>Golarka&nbsp;</td><td>Jata</td><td>MP373N</td><td>Model: piękny, 3 V, 300 mA, typ HT-03.</td></tr><tr><td>Odczynniki:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Esteve</td><td>DOMTOR&nbsp;</td><td>Roztwór handlowy o stężeniu 1 mg/ml.</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Merial</td><td>Imalgene 500&nbsp;</td><td>Roztwór handlowy o stężeniu 50 mg/ml</td></tr><tr>Mieszanina <td></td><td></td><td>medetomidyny i ketaminy</td><td>Przygotować mieszaninę roboczą medetomidyny w końcowym stężeniu 0,2 mg/ml rozcieńczenia i ketaminy w końcowym stężeniu 15 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej. Stosować jako znieczulenie, wstrzykując objętość, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5-1 mg medetomidiny na kg masy ciała i 50-75 mg ketaminy na kg masy ciała</td></tr><tr><td>Butorfanol</td><td>Pfizer</td><td>Torbugesic</td><td>Roztwór podstawowy w stężeniu 10 mg / ml. Stosowany jako środek przeciwbólowy w stężeniu 1 mg / ml w roztworze soli fizjologicznej.</td></tr><tr><td>Atipamezole</td><td>Esteve</td><td>Antisedan</td><td>Roztwór podstawowy w dawce 5 mg/ml, stosowany w końcowym stężeniu 0,5 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej do wyjścia ze znieczulenia.</td></tr><tr><td>0,9% roztwór soli fizjologicznej</td><td>Braun</td><td>13465412</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>Miejscowy klej do skóry</td></tr><tr><td>HydroGel</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>11 cm x 21 cm</td></tr><tr><td>Wybielacz/Virkon</td><td>Dupont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marker chirurgiczny</td><td>Staedler</td><td>313-9</td><td>Trwały lubrykant okulistyczny lumocolor</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td>SICCAFLUID</td><td>0,5 g/dawkę, karbomer 974P</td></tr><tr><td>Powidon-jod</td><td>Betadine</td><td>694109.6</td><td>10% powidonu-jodu</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Część 3: Analiza histologiczna.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt: </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Automatyczna pompa perystaltyczna</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07524-55</td><td>Masterflex L/S ekonomiczny napęd o zmiennej prędkości, 1,6-100 obr./min, 230 V</td></tr><tr><td>Głowica pompy</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07518-00</td><td>Głowica pompy Masterflex L/S Easy-Load do przewodów precyzyjnych; Obudowa PSF, wirnik CRS Rurka</td></tr><tr><td>silikonowa</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-96410-16</td><td>Platinum L/S 16</td></tr><tr><td>Zestaw żył</td><td>skóry głowy Vygon V-green</td><td>70246.05T</td><td>25 G, długość rurki 30 cm</td></tr><tr><td>Vibratome</td> Mikroskop konfokalny <td>Leica</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>FluoView FV10i</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Tehtnica</td><td>SHP-10</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PB)</td>0,2 M PB: <td></td><td></td><td>0,2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) i 0,2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) w dH2O, dostosuj pH do 7,2-7,4</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Panreac</td><td>141451.1211</td><td>Przygotuj świeże za każdym razem. Podgrzewanie dH2O do 55&ndash; 60 stopni Celsjusza; C za pomocą płyty grzejnej umieszczonej w dygestorii i wsypać proszek PFA, mieszając, aby uzyskać 8% roztwór. Roztwór jest mętno-biały, ponieważ PFA nie rozpuszcza się łatwo. Dodawaj 1N NaOH kropla po kropli, aż roztwór się usunie. Ostudzić, przefiltrować przez papier Whatman i dodać równoważną objętość 0,2 M PB.</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> soli <td>fizjologicznej 0,9% NaCl w dH2O</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>LOCTITE</td><td>767547</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Panreac</td><td>122712.1608</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Millipore</td><td>S30-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Przeciwciało królika anty-GFP</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-215</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Przeciwciało Sondy molekularne</td><td>A-21206</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:750</td></tr><tr><td>Hydrat dichlorowodorku 6-diamindino-2-fenyloindolu (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Fluorescencyjne barwienie jądrowe. Stosować w dawce 2 mg/ml w ddH2O. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>EM Sciences</td><td>17984-25</td><td>Podłoże montażowe do preparatów fluorescencyjnych</td></tr></tbody></table>

stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy v-svz do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Względnie spokojne somatyczne komórki macierzyste wspierają dożywotnią odnowę komórkową w większości dorosłych tkanek. Nerwowe komórki macierzyste w mózgu dorosłego ssaka są ograniczone do dwóch specyficznych nisz neurogennych: strefy podziarnistej zakrętu zębatego w hipokampie i strefy komorowo-podkomorowej (V-SVZ; zwanej również strefą podwyściółkową lub SEZ) w ścianach komór bocznych. Opracowanie strategii transferu genów in vivo dla populacji dorosłych komórek macierzystych (tj. populacji mózgu ssaków), skutkujące długotrwałą ekspresją pożądanych transgenów w komórkach macierzystych i ich pochodnym potomstwie, jest kluczowym narzędziem w obecnych badaniach biomedycznych i biotechnologicznych. W tym miejscu przedstawiono metodę bezpośredniego badania in vivo do stabilnej modyfikacji genetycznej dorosłych mysich komórek V-SVZ, która wykorzystuje niezależną od cyklu komórkowego infekcję przez LV i wysoce wyspecjalizowaną cytoarchitekturę niszy V-SVZ. W szczególności obecny protokół obejmuje wstrzyknięcie pustych LV (kontrolnych) lub LV kodujących specyficzne kasety ekspresji transgenu do samego V-SVZ, w celu ukierunkowania in vivo na wszystkie typy komórek w niszy, lub do światła komory bocznej, w celu ukierunkowania tylko na komórki wyściółki. Kasety ekspresyjne są następnie integrowane z genomem transdukowanych komórek, a białka fluorescencyjne, również kodowane przez LV, umożliwiają wykrycie transdukowanych komórek w celu analizy autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów komórkowych w znakowanych komórkach i ich potomstwie.

System dostarczania genów za pomocą LV może być wykorzystywany do długotrwałej transdukcji in vivo komórek w obszarze V-SVZ u dorosłych myszy, co umożliwia ich śledzenie oraz modyfikację genetyczną podczas proliferacji, migracji i różnicowania. Infekcja i ekspresja są bardzo skuteczne i dają liczne komórki, które można łatwo odróżnić od pozostałych, niezinfekowanych komórek dzięki ekspresji zawartego w systemie raportera. Do tej pory wizualizowaliśmy transdukowane komórki za pomocą fluorescencyjnych raporterów G...

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie małych objętości cząstek lentiwirusowych o wysokim mianie, niosących specyficzne konstrukty DNA, do komory wentrykularno-podkomorowej u dorosłej myszy w celu zainfekowania wszystkich typów komórek lub do komory bocznej, aby oddziaływać wyłącznie na komórki opony). Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące interakcji, jakie macierzyste komórki neuralne dorosłej niszy wentrykularno-podkomorowej wykazują z sąsiadującymi komórkami ependymalnymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że wektory lentiwirusowe integrują się z genomem komórek docelowych w sposób niezależny od cyklu komórkowego, co umożliwia długoterminową dyfuzję rzadko dzielących się komórek. W zaprezentowaniu procedury pomoże mi doktorantka Beatriz Mart

stable-efficient-genetic-modification-cells-adult-mouse-v-svz-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Źródło: Porlan, E., et al. Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek u dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje stabilną modyfikację genetyczną nerwowych komórek macierzystych (NSC) w strefie komorowo-podkomorowej (V-SVZ) poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie genu terapeutycznego przenoszącego wirusa w modelu mysim. Wirus wnika do NSC, ulega odwrotnej transkrypcji, integruje się z...

Stereotaktyczne wstrzykiwanie wirusów w celu stabilnej modyfikacji genetycznej w modelu mysim

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Opisujemy protokół chirurgii stereotaktycznej za pomocą domowego urządzenia do mikrowstrzykiwania odczynników do prążkowia mózgów noworodków myszy. Technika ta pozwala na manipulację genetyczną w komórkach neuronalnych określonych regionów mózgów noworodków myszy.

Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Metoda izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów z mózgów żywych szczurów jest tutaj przedstawiona w szczegółach eksperymentalnych. Pozwala to na wielokrotne pobieranie tych komórek od tych samych zwierząt bez uszczerbku dla ich dobrostanu.

Metoda "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Tutaj opisujemy protokół inżynierii chemicznie przeprogramowanych komórek macierzystych w celu osiągnięcia precyzyjnej modulacji neuronalnej poprzez różnicowanie tych komórek w dopaminergiczne komórki prekursorowe, przeszczepianie ich do mysich modeli choroby Parkinsona oraz ocenę wyników behawioralnych i elektrofizjologicznych w celu potwierdzenia udanej integracji i funkcjonalnej skuteczności przeszczepionych komórek.

Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

Poznaj metodę modyfikacji genetycznej komórek macierzystych w strefie V-SVZ dorosłej myszy za pomocą cząstek lentiwirusowych. Technika umożliwia analizę autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych w niszy neurogenezy.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów