Pole geomagnetyczne (Gmf) i ewolucja roślin: badanie wpływu odwrócenia GMF na rozwój Arabidopsis thaliana i ekspresję genów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie odwrócenia pola geomagnetycznego (GMF) za pomocą cewek Helmholtza sterowanych przez zasilacz. Ostatecznie wykazano, że odwrócenie GMF wpływa na morfologię i ekspresję genów roślin. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny ewolucji roślin, takie jak to, czy odwrócenie ziemskiego pola magnetycznego mogło odegrać rolę w ewolucji i adaptacji roślin.

Główną zaletą tej techniki jest to, że może być ona wykorzystana do badania potencjalnych efektów biologicznych słabych pól magnetycznych w prostym organizmie modelowym, który można hodować w wielu powtórzeniach, a wszystko to w precyzyjnie kontrolowanych warunkach. Procedurę tę zaprezentują Alberto Bocco wraz z prowadzącym studentem z mojego laboratorium, a także Kiara aa, doktorantka w moim laboratorium, oraz CIA Bertea, profesor adiunkt w mojej grupie.

Aby rozpocząć, należy włączyć trzy zasilacze prądu stałego podłączone do trzech par cewek Helmholtza oraz włączyć magnetometr trójosiowy, którego sonda jest umieszczona wewnątrz cewek. Następnie należy uruchomić komputer i uruchomić oprogramowanie magnetometru, które umożliwia gromadzenie danych z magnetometru trójosiowego. Zasilacze są również połączone z komputerem za pomocą interfejsu GPIB w celu sterowania.

Ustaw napięcia zasilaczy tak, aby wygenerować pożądane pole magnetyczne z odwróconym wektorem pól magnetycznych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść nasiona Arabidopsis Aliana ekotypu Columbia, zero w probówce o pojemności 1,5 ml, wysterylizowane poprzez traktowanie roztworem podchlorynu wapnia przez 10 do 12 minut w temperaturze 25 do 28 °C przy ciągłym wstrząsaniu. Następnie przepłucz nasiona dwukrotnie 80% etanolem, a następnie przemyj je 100% etanolem.

Na koniec należy wypłukać nasiona sterylną wodą destylowaną. Przed zestaleniem przygotować jeden litr zmodyfikowanej pożywki Murrah Shiga i SCOG zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Nalać 80 ml pożywki do każdej kwadratowej szalki Petriego, tak aby na jednej szalce znalazło się 30 sterylnych nasion.

Następnie szczelnie zamknij płytki za pomocą woskowej folii. Płytki poddaj wernalizacji w pozycji poziomej, w ciemności, w temperaturze 4 °C przez dwa dni, aby usprawnić i zsynchronizować kiełkowanie. Przygotuj lampy sodowe, zakrywając reflektor niebieską folią żelatynową, aby ograniczyć składową czerwoną lamp po zakończeniu wernalizacji.

Przygotuj szalki Petriego do ekspozycji na normalne lub odwrócone GMF. Eksponuj nasiona w środowisku o kontrolowanym klimacie w temperaturze 22 °C w pozycji pionowej. Przeprowadź równoległe eksperymenty zarówno poza cewkami triaksjalnymi, jak i w ich wnętrzu.

W cyklu fotoperiodu obejmującym osiem godzin ciemności i 16 godzin światła. Po ekspozycji należy wykonać zdjęcia szalek Petriego w celu obliczenia długości korzenia i powierzchni liści. Najpierw należy zmierzyć bok szalki Petriego.

Następnie otwórz obraz szalki Petriego w programie ImageJ i użyj opcji linii prostej, aby narysować linię przecinającą dokładnie krawędź szalki. W menu analizy (analyze) wybierz opcję ustaw parametr skali (set scale) i wprowadź rzeczywistą odległość w polu znanej odległości (known distance). Następnie wprowadź jednostkę długości.

Na koniec kliknij opcję globalną, aby ustawienia były dostępne dla wszystkich pomiarów długości korzenia. Starannie obrysuj kształt korzenia, korzystając z narzędzia freehand. Zmierz długość, używając opcji measure w menu analyze.

Kontynuuj pomiar wszystkich korzeni na zdjęciu i zapisz plik do dalszej analizy statystycznej. Aby zmierzyć powierzchnię liścia, z menu obrazu wybierz opcję dostosuj (adjust), następnie próg kolorów (color threshold), zaznacz poszczególne liście, a w menu analizy wybierz analizuj cząstki (analyze particles); zapisz poszczególne pomiary do analizy statystycznej. Zbierz oddzielnie 30 pędów i 30 korzeni, a następnie natychmiast zamroź je w ciekłym azocie.

Następnie utrzeć w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka, a następnie wyizolować całkowite RNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić w systemie czasu rzeczywistego z użyciem cyber green one z ROX jako wewnętrznego standardu ładowania; reakcję przeprowadzić w mieszaninie o objętości 25 µL. Korzystając z starterów wymienionych w protokole tekstowym, należy uwzględnić kontrole bez odwrotnej transkrypcji w celu monitorowania zanieczyszczeń DNA genomicznego, a także kontrole bez matrycy. Odczytywać fluorescencję po każdej fazie denaturacji i elongacji.

Dwie lupy reprezentują zebrane dane, w tym krzywe topnienia i dysocjacji. Przejdź do ekranu analizy i konfiguracji i upewnij się, że wybrany jest zestaw danych zebranych podczas segmentu dysocjacji eksperymentu. Aby przeprowadzić analizę dla wszystkich serii, wykonaj analizę krzywej topnienia w zakresie od 55 do 95 °C, uwzględniając segment dysocjacji w profilu termicznym.

Użyj ekranu krzywej dysocjacji dostępnego w zakładce wyników, aby wyświetlić profil dysocjacji. Przeanalizuj wszystkie wykresy amplifikacji za pomocą oprogramowania instrumentu do real-time PCR.

Aby uzyskać wartości CT, należy skalibrować i znormalizować względne poziomy RNA względem poziomu najlepiej dobranych genów referencyjnych. Przejdź do ekranu z wykresami amplifikacji za pomocą karty wyników. Na ekranie analizy, wyboru i konfiguracji wybierz fazę wzrostu (ramp) lub plateau, dla której dane mają zostać przeanalizowane.

Następnie z menu fluorescencji na panelu sterowania wybierz znormalizowaną fluorescencję z korekcją linii bazowej. Przejdź do ekranu wartości próbek płytki za pomocą karty wyników, aby wyświetlić wartości CT dla wybranych studzienek.

Do normalizacji wyników qPCR należy wykorzystać cztery różne geny referencyjne. Za pomocą oprogramowania analitycznego należy wyłonić najwyżej oceniony gen i użyć najbardziej stabilnego genu do normalizacji. Dane wejściowe należy krótko uporządkować w arkuszu Excel, w którym pierwsza kolumna zawiera nazwy genów, a pierwszy wiersz nazwy próbek.

Następnie wybierz oprogramowanie analityczne z paska menu. W oknie dialogowym wybierz dane wejściowe. Następnie zaznacz pola nazw próbek, nazw genów oraz opcję samego prostego wyjścia.

Kliknij przycisk „Go”. Aby przeprowadzić analizę, wybierz gen z najwyższym rankingiem jako gen kandydujący o najstabilniejszej ekspresji. Po 10 dniach ekspozycji rośliny kontrolne wykazują znacznie większą długość korzenia i bardziej rozwinięte listki w porównaniu do roślin, które były poddane odwróconym warunkom GMF po 10 dniach ekspozycji. Efektem odwrócenia GMF była drastyczna zmiana ekspresji genów wszystkich badanych genów, w tym crucifer in three copper transport protein one oraz redox responsive transcription factor one; paski oznaczają błąd standardowy, a gwiazdki wskazują istotne różnice między roślinami poddanymi odwróconym i normalnym warunkom GMF.

Odwrócenie GMF nie spowodowało istotnych zmian w ekspresji genów w pędach. Jednakże zaobserwowano drastyczne obniżenie poziomu ekspresji genów w korzeniach wyhodowanych roślin. W warunkach odwróconego GMF geny te obejmują thal, peroksydazę, peroksydazę, jedną dysmutazę ponadtlenkową żelazową, jeden N-A-D-P-H, białko oksydazy wybuchu oddechowego oraz katalazę trzy.

Po opanowaniu tej techniki, w zależności od wymagań danego eksperymentu, jej wykonanie może zająć od kilku minut do całego dnia, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak odwrócić lub zmienić pole geomagnetyczne oraz jak przeprowadzić badania morfologiczne i genetyczne roślin poddanych ekspozycji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest usunięcie wszelkich źródeł pola magnetycznego z obszaru otoczonego cewkami hełmu.

Ważne jest, aby cewki kasku oraz ich generatory nie wytwarzały ciepła ani wibracji. Badacz powinien pozostać zaślepiony względem warunków ekspozycji na pole magnetyczne aż do momentu zarejestrowania końcowych danych. Technika ta umożliwiła badaczom receptorów magnetycznych analizę wpływu pól magnetycznych na ewolucję roślin, zachowanie i nawigację zwierząt oraz na ludzkie linie komórkowe.

W przyszłości mamy nadzieję przeprowadzić podobne badania w warunkach mikrograwitacji, aby ocenić, w jaki sposób zmiana pola magnetycznego wpłynie w warunkach kosmicznych na wzrost roślin. Praca z systemami generującymi słabe pola magnetyczne nie jest uważana za niebezpieczną. Należy jednak zachować normalne środki ostrożności i skonsultować się z wykwalifikowanym elektrykiem przed pracą z urządzeniami takimi jak zasilacze dla par cewek Helmholtz.