Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zaprezentowanie właściwych technik monitorowania wzrostu komórek nowotworowych oraz guzów wewnątrzczaszkowych przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo w celu weryfikacji użyteczności modyfikacji lucyferazą mysich komórek nowotworowych GL261. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad immunologią nowotworów i podejściem immunoterapeutycznym, takie jak to, czy modyfikacja stresowa wpływa na proliferację komórek GL261 i ich wzrost in vivo.

Główną zaletą tej techniki jest to, że modyfikacja komórek nowotworowych GL261 lucyferazą umożliwia nieinwazyjne monitorowanie ich wzrostu oraz odpowiedzi na leczenie in situ. Gdy hodowla komórek GL261 z lucyferazą osiągnie 70% konfluencji w kolbie T75, należy zebrać komórki poprzez trypsynizację. Następnie należy policzyć komórki i przenieść je na płytkę 24-dołkową w stopniowanych zagęszczeniach.

Po trzech godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych uruchom oprogramowanie do obrazowania bioluminescencyjnego i zainicjuj system obrazowania. Gdy kamera schłodzi się do temperatury -90°C, ustaw w oprogramowaniu do obrazowania tryb Luminescent, czas ekspozycji 10 s oraz średnie binowanie (Medium Binning). Następnie inkubuj komórki w 25 µL lucyferyny na studzienkę przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i umieść płytkę na stacji obrazowania.

Wybierz Acquire, aby rozpocząć obrazowanie. Po pomyślnym uzyskaniu obrazu pojawi się okno obrazu oraz paleta narzędzi. Kliknij Regions of Interest Tools i wybierz 6 by 4 z ikony szczeliny.

Pokryj obszar sygnału szczelinami o rozmiarach 6 na 4 i wybierz ikonę ołówka w karcie Measurements. Pojawi się okno z tabelą pomiarów obszaru zainteresowania w jednostkach fotonów na sekundę na steradian na centymetr kwadratowy. Aby przeprowadzić test proliferacji in vitro, zbierz hodowle komórkowe w sposób przedstawiony przed chwilą, gdy osiągną one 70% konfluencji.

Używając pipety wielokanałowej, nanieś komórki nowotworowe do 20 studni płytki 96-dołkowej w zagęszczeniu 1,5 × 10³ komórek na 80 µL pożywki RPMI na studnię. Aby ograniczyć parowanie kultur komórkowych, wypełnij sąsiednie puste studnie 100 µL świeżej pożywki RPMI. Następnie, w celu oceny proliferacji komórkowej, dodaj 20 µL odczynnika MTS do każdej studni z komórkami.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po trzech godzinach użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję przy 490 nm. W celu normalizacji wartości absorbancji podziel wartości z każdego dnia przez odpowiadające im odczyty uzyskane pierwszego dnia.

W dniu implantacji zawiesić 10⁵ komórek na µL w buforze HBSS bez wapnia i magnezu, pobranych z hodowli komórek nowotworowych o 70% konfluencji. Następnie, po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji poprzez uciśnięcie palca u stopy, ogolić szczyt głowy każdego zwierzęcia doświadczalnego. Za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem oczyścić każdą czaszkę 2% chlorheksydyną.

Następnie należy nanieść środek smarujący do oczu każdej myszy. Teraz za pomocą sterylnego skalpela wykonaj nacięcie strzałkowe o długości około 1 centymetra nad kością ciemieniowo-potyliczną pierwszego zwierzęcia. Powierzchnię czaszki należy ponownie oczyścić 3% nadtlenkiem wodoru, zaznaczając widoczne bregma.

Następnie, używając sterylnej igły o rozmiarze 25G, wykonaj otwór o średnicy 3 mm w czaszce na prawo od bregmy i tuż za szwem czołowym. Aby zapewnić odpowiednią głębokość wstrzyknięcia, użyj nożyczek, aby odciąć 3 mm z ostro zakończonego końca końcówki pipety o pojemności 20 µL, a następnie wsuń strzykawkę Hamiltona o rozmiarze 26G do końcówki, aż z jej końca będą wystawać 3 mm igły. Wprowadź igłę do otworu w czaszce i powoli wstrzyknij 3 µL zawiesiny komórek nowotworowych o stężeniu 3 × 10⁵ w czasie jednej minuty.

Pozostaw igłę w miejscu na kolejną minutę, a następnie powoli ją wyjmij. Przemyj odsłoniętą kość 3% nadtlenkiem wodoru i 2% roztworem chlorheksydyny. Następnie, po osuszeniu czaszki nowym aplikatorem z watnym końcem, wytnij kawałek sterylnego wosku kostnego o wymiarach 3 mm² i przymocuj wosk do gołego końca aplikatora z watnym końcem.

Miejsce wstrzyknięcia należy pokryć woskiem kostnym. Następnie za pomocą pęsety naciągnąć brzegi skóry głowy nad woskiem. Po zamknięciu rany i podaniu odpowiedniej przeciwbólowej terapii pooperacyjnej, powtórzyć procedurę dla każdego zwierzęcia doświadczalnego.

Aby obrazować wzrost guza wewnątrzczaszkowego, najpierw uruchom stację obrazowania zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie, po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji poprzez uciśnięcie ogona, ustaw parametry systemu obrazowania zgodnie z wcześniejszą demonstracją, z wyjątkiem wyboru opcji Auto dla czasu ekspozycji.

Gdy system obrazowania będzie gotowy, umieść myszy na stacji obrazowania i wybierz Acquire, aby uzyskać obrazy ekspresji lucyferazy. Po pomyślnym wykonaniu obrazowania wybierz Region of Interest Tool z palety narzędzi oraz Auto z ikony koła. Obrysuj obszary sygnału, aby zdefiniować regiony zainteresowania, a następnie dokonaj pomiarów tych regionów w jednostkach fotonów na sekundę na steradian na centymetr kwadratowy.

Na koniec wyjmij myszy z komory obrazującej i monitoruj zwierzęta z nowotworami aż do ich pełnego powrotu do zdrowia. Obrazowanie bioluminescencyjne in vitro komórek GL261 zainfekowanych lentiwirusem zawierającym lucyferazę wykazuje silną ekspresję lucyferazy, podobną do poziomów lucyferazy wyrażanych przez pozytywną linię kontrolną ludzkich komórek glejaka U87MG wykazujących ekspresję lucyferazy. Zgodnie z oczekiwaniami, niezainfekowane komórki GL261 nie wykazują tła ekspresji lucyferazy.

Przed implantacją wewnątrzczaszkową nie zaobserwowano różnic w tempie wzrostu in vitro linii komórkowych GL261 luciferase oraz GL261. Jak wykazuje seryjne obrazowanie bioluminescencyjne zwierząt z wstrzykniętym guzami wewnątrzczaszkowo, komórki nowotworowe GL261 wykazujące ekspresję lucyferazy charakteryzują się również szybkim i spójnym tempem wzrostu in vivo, przy czym nie odnotowano istotnych różnic w przeżywalności pomiędzy badanymi grupami z nowotworem. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, można obrazować do 25 myszy na godzinę.

Po opracowaniu technika ta zwiększa użyteczność obrazowania bioluminescencyjnego w monitorowaniu wzrostu guza GL261 in vivo, co pozwala na dalsze badanie odpowiedzi immunoterapeutycznych w modelach mysich z zachowaną kompetencją immunologiczną.