Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Ogólnym celem tej techniki jest wykorzystanie komórek śródbłonka jako nowego typu płaskiego modelu komórkowego prezentującego antygen w celu zbadania podstawowych procesów sygnalizacji antygenowej. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odporności adaptacyjnej, takie jak to, w jaki sposób subkomórkowa i molekularna dynamika przebudowy jest koordynowana przestrzennie i czasowo w synapsie immunologicznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że śródbłonek tworzy praktycznie płaską powierzchnię PC.

Pozwala to na obrazowanie z optymalną rozdzielczością czasoprzestrzenną w kontekście fizjologicznie złożonej i formowalnej powierzchni komórki. Chociaż metoda ta koncentruje się na aktywacji komórek pamięci efektorowej CD four dodatnich TH, może być również stosowana do badania różnych typów antygenów komórek T i procesów sygnalizacyjnych. Dzisiaj Chris i ja pokażemy ci, jak wykonać drugi kod Rozpocznij za pomocą kodu, transektując pierwotne ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc lub skóry z błoną YFP i rozpuszczalną czerwienią DS poprzez uczucie jądrowe NU i umieść transfekowane komórki na płytkach do obrazowania żywych komórek.

Następnego dnia zastąp pożywkę do hodowli komórkowej świeżą pożywką uzupełnioną interferonem gamma w celu wywołania ekspresji M MHC two na komórkach śródbłonka, a następnie stymulację komórek 20 nanogramami na mililitr TNF alfa 24 godziny później w trzecim dniu od 30 do 60 minut. Przed rozpoczęciem eksperymentu inkubuj śródbłonek z jednym mikrogramem na mililitr, każdy z superantygenów bakteryjnych enterotoksynę gronkowcową B i toksynę zespołu wstrząsu toksycznego jeden w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podczas inkubacji policz liczbę żywotnych komórek z interesującej nas hodowli limfocytów i przenieś dwa razy 10 do szóstej komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach świeżo przygotowanego buforu A, tak aby nie pozostały żadne skupiska komórek. Następnie dodaj dwa mikromolowe RA dwa do próbki limfocytów T, zakryj probówkę i natychmiast odwróć ją do jednorodności. Rozprowadź barwnik w całej zawiesinie komórek.

Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, odwirować znakowane limfocyty i delikatnie, ale dokładnie zawiesić komórki w 20 do 40 mikrolitrach świeżego buforu A do obrazu na żywo, komórki włączają system mikroskopu i otwierają odpowiednie oprogramowanie do przechwytywania obrazu. Ustaw odpowiednie parametry dla automatycznego wielokanałowego obrazowania poklatkowego, a także interwał akwizycji od 10 do 30 sekund i łączny czas trwania około 20 do 60 minut. Następnie dodaj świeży olej do celu.

Zamontuj miskę mikroskopu zawierającą 0,5 mililitra buforu A na adapterze ogrzewania stage i natychmiast włącz adapter ustawiony wcześniej na 37 stopni Celsjusza. Po dwóch do trzech minutach równoważenia użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby dodać spoczynkowe RZS dwa załadowane limfocyty do zamontowanej komory czaszy mikroskopu i włącz obrazowanie w jasnym polu. Wybierz drogę światła do okularów i użyj pokrętła ostrości kursu, aby zetknąć obiektyw z dnem czaszy mikroskopu.

Następnie za pomocą okularu i pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości zlokalizować komórki T osadzone na dnie naczynia i za pomocą elementów sterujących XY stage wybrać pole zawierające co najmniej 10 komórek, gdy odpowiednie komórki zostały zlokalizowane. Przełącz z jasnego pola na fluorescencyjne źródło światła i z obrazowania IP na kamerę CCD. Zoptymalizuj parametry akwizycji, a następnie pozyskaj spoczynkowe obrazy Fira 2 3 40 i FIRA 2 3 80.

Jednym z kluczowych kroków do uzyskania pomyślnych wyników jest staranna optymalizacja parametrów akwizycji fluorescencji, zapewniająca zebranie wystarczającej ilości sygnału, a w przypadku fira dwa, że stosunek wyjściowy 3 43 80 jest bliski jeden. Po ustawieniu dwóch czasów ekspozycji FIRA, zastąp miskę limfocytów T naczyniem mikroskopowym z komórkami śródbłonka za pomocą jednorazowej pipety transferowej, szybko usuń pożywkę i przepłucz komórki raz jednym mililitrem wstępnie ciepłego buforu A, a następnie zastąp płukanie 0,5 mililitra świeżego buforu A. Korzystając z celu, zidentyfikuj pola, w których jasno fluorescencyjne komórki śródbłonka wydają się zdrowe. Następnie dostosuj parametry akwizycji dla membrany YFP i DS RED, jak właśnie pokazano dla fira two.

Dbając o to, aby średnie natężenie sygnału fluorescencyjnego w każdym kanale mieściło się w przedziale od 25 do 75% zakresu dynamiki detektora. Przed przeprowadzeniem eksperymentu z obrazowaniem żywych komórek uchwyć kilka interwałów obrazów samych komórek śródbłonka, aby ustalić linię bazową za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania. Następnie włóż końcówkę małej objętości do nośnika w pobliżu środka obiektywu.

Powoli dozuj pięć mikrolitrów skoncentrowanej firy, dwóch załadowanych limfocytów do środka pola obrazowania naczynia mikroskopu. Gdy limfocyty osiadają, dokonaj precyzyjnych regulacji ostrości, aby upewnić się, że interfejsy komórek śródbłonka komórek T są utrzymywane w płaszczyźnie ogniskowej. W przypadku obiektywów 40 i 63 x optymalna jest liczba komórek na pole od 10 do 20 razy.

Po upływie pożądanego interwału obserwacji kontynuuj obrazowanie i natychmiast pipetuj CIN bezpośrednio do czaszy mikroskopu do końcowego stężenia dwóch mikromolowców, aby wywołać sferę o maksymalnym strumieniu wapnia. Dwa sygnały. Podczas stosowania zabiegów na komórkach należy zwrócić uwagę na utrzymanie ostrości na powierzchni śródbłonka oznaczonej błoną wierzchołkową YFP, aby zapewnić optymalną rozdzielczość przebudowy synaps immunologicznych.

W przypadku braku superantygenu na śródbłonkowym superantygenie CD cztery dodatnie limfocyty TH one szybko się rozprzestrzeniają, polaryzują i bocznie migrują nad komórkami śródbłonka. Podczas tego procesu limfocyty rozciągają krótkotrwałe wypukłości lub ILP na powierzchnię śródbłonka, które są widoczne jako pierścienie fluorescencji błony YFP analogicznie do śladów stóp w obecności superantygenu, bliskie kontakty komórkowe z komórkami napędzane przez ILP są związane z inicjacją strumienia wapnia prowadzącego do akumulacji ustabilizowanych ILP w synapsie immunologicznej. Takie macierze ILP są sprzężone z trwałą sygnalizacją wapniową.

Pierścienie fluorescencji błonowej, które tworzą się podczas interakcji komórek śródbłonka komórek T, odpowiadają wypukłościom komórek T napędzającym dyskretne miejsca wgłębień w komórkach śródbłonka, co potwierdza wykazanie, że pierścienie te korelują przestrzennie i kinetycznie ze strefami przemieszczonej i wykluczonej cytoplazmy. W ciągu kilku minut od jednoczesnej inkubacji śródbłonka i limfocytów T w obecności adhezji superantygenu i cząsteczek sygnałowych związanych z sygnalizacją antygenową dochodzi do wzbogacenia w odciski pota i ILP synapsy immunologicznej. Rzeczywiście, synapsa immunologiczna śródbłonka komórek T wykazuje dyskretną trójwymiarową architekturę przerywaną ILP komórek T rozciągającymi się na powierzchnię komórki prezentującej antygen, w której wzbogacona jest molekularna maszyneria rozpoznawania antygenu.

Dzięki takiemu podejściu można pokonać kluczowe przeszkody w istniejących modelach PC, umożliwiając obserwację niewykrywalnej w inny sposób architektury subkomórkowej 3D i szybką przebudowę fizjologicznych interfejsów komórek T i PC. Stwarza to potencjał dla nowych poziomów zrozumienia procesów sygnalizacji antygenowej.