Name: Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj model płaskich komórek śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych. Ta metoda umożliwia badanie aktywacji limfocytów T z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Peterowi T. Sage'owi za pomoc w wygenerowaniu niektórych reprezentatywnych obrazów. Praca ta była wspierana przez grant NIH R01 dla C.V.C. (HL104006).

<ol><li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+function+and+migration.+Two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell function and migration. Two sides of the same coin.</a> N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+receptors+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adhesion receptors of the immune system.</a> Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).</li>
<li>Shaw, A. S., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+T+cell+receptor+go+the+distance%3A+a+topological+view+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation.</a> Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+T-cell+interactions+with+antigen+presenting+cells+in+culture+and+in+intact+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue.</a> Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).</li>
<li>Brossard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifocal+structure+of+the+T+cell+-+dendritic+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse.</a> Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+context+of+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cellular context of T cell signaling.</a> Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Oddos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+high-resolution+imaging+of+intercellular+immune+synapses+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers.</a> Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Bunnell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Seminario, M. C., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+T-cell+receptor+microclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in T-cell receptor microclusters.</a> Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+bilayers+at+the+vanguard+of+immune+cell+activation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies.</a> J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).</li>
<li>Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartinelli%2C+R+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).</li>
<li>Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte-endothelial cell interactions.</a> Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+the+endothelium%3A+a+green+light+for+antigen-specific+T+cell+trafficking%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+recognition+is+facilitated+by+invadosome-like+protrusions+formed+by+memory%2Feffector+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+foci+facilitate+activation+of+the+phospholipase+C-gama+in+primary+T+lymphocytes+via+the+WASP+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway .</a> eLife. , (2015).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+histocompatibility+complex+class+II-expressing+endothelial+cells+induce+allospecific+nonresponsiveness+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells.</a> J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).</li>
<li>Ma, W., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+effectively+costimulate+cytokine+production+by%2C+but+not+differentiation+of%2C+naive+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells.</a> J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).</li>
<li>Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+antigen+presentation%3A+stimulation+of+previously+activated+but+not+naive+TCR-transgenic+mouse+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells.</a> Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).</li>
<li>Epperson, D. E., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+human+endothelial+cells.+Direct+activation+of+resting+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells.</a> J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).</li>
<li>Shiao, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+memory+CD4%2B+T+cells+directly+recognize+allogeneic+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo.</a> J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-signal+model+for+T+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">A two-signal model for T cell trafficking.</a> Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+diapedesis+is+initiated+by+invasive+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes.</a> Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).</li>
<li>Carman, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+transcellular+diapedesis%3A+probing+and+pathfinding+by+%27invadosome-like+protrusions%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'.</a> J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).</li>
<li>Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dendritic+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell-dendritic cell immunological synapses.</a> Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).</li>
<li>Saito, T., Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+synapse+and+microclusters%3A+the+site+for+recognition+and+activation+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells.</a> Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).</li>
<li>Gomez, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+functions+as+an+essential+actin-regulatory+adaptor+protein+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse.</a> Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).</li>
<li>Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+signaling+to+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor signaling to integrins.</a> Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).</li>
<li>Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+during+leukocyte+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton during leukocyte responses.</a> Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).</li>
<li>Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+deformation+model+of+TCR+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">The receptor deformation model of TCR triggering.</a> Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).</li>
<li>Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-anchored+monomeric+agonist+pMHCs+alone+trigger+TCR+with+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity.</a> PLoS Biol. 6 (2), e43(2008).</li>
<li>Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+mechanics+and+molecular+organization+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Bending mechanics and molecular organization in biological membranes.</a> Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+receptor+activation+by+dynamic+membrane+binding+of+the+CD3epsilon+cytoplasmic+tyrosine-based+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif.</a> Cell. 135 (4), 702-713 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka jako i) niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC oraz ii) jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC". W odniesieniu do tych pierwszych, coraz bardziej docenia się, że niehematopoetyczne obwodowe (lub "zrębowe") APC odgrywają krytyczną, nieredundantną rolę (tj. w porównaniu z krwiotwórczymi APC) w kształtowaniu adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych 16-18. Wśród takich "półprofesjonalnych" APC, komórki śródbłonka nac...

Limfocyty T stanowią gałąź adaptacyjnego układu odpornościowego, charakteryzującą się zdolnością do wydajnego rozpoznawania antygenów peptydowych (Ag) związanych z cząsteczkami głównego układu zgodności tkankowej (MHC) za pomocą receptorów limfocytów T (TCR) 1. Limfocyty naiwne migrują konstytutywnie i skanują „profesjonalne komórki prezentujące antygen” (APC; np. komórki dendrytyczne) w obrębie węzłów chłonnych, natomiast limfocyty T pamięci oraz efektorowe muszą skutecznie monitorować niezwykle szeroki zakres APC i potencjalnych komórek docelowych w tkankach obwodowych.
W ciągu kilku minut po początkowym rozpoznaniu pokrewnego Ag na APC, limfocyty zatrzymują migrację i zaczynają tworzyć wyspecjalizowany, bliski interfejs komórka-komórka, nazywany „synapsą immunologiczną” (IS). Utrzymujące się (i.e., 30-60 min) kontakty IS są niezbędne do wzmocnienia i podtrzymania sygnalizacji 2-7. Nowe badania wskazują, że w obrębie IS to ciągłe tworzenie i szybka przebudowa dyskretnych subkomórkowych mikroklastrów sygnalizacyjnych (i.e., zawierających MHC/Ag-TCR, F-aktynę, cząsteczki adhezyjne i sygnalizacyjne) determinują siłę i jakość wynikających z nich odpowiedzi immunologicznych 2-7. Jednak dynamiczne szczegóły i mechanizmy regulacyjne tego procesu nie są w pełni poznane 8,9. Wynika to w dużej mierze z wyzwań technicznych związanych z nieregularną topologią powierzchni APC oraz słabą kontrolą orientacji płaszczyzn oddziaływań komórka-komórka, co w znacznym stopniu ogranicza wymagane podejścia do obrazowania czasoprzestrzennego 8-10 (Rycina 1A).
<img alt="Schemat tradycyjnego obrazowania IS przedstawiający modele komórek docelowych APC; układ mikroskopowy, rekonstrukcja synapsy." src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">
Rysunek 1. Fizjologiczny płaski model APC do obrazowania dynamiki synapsy immunologicznej. Schemat przedstawia tradycyjne obrazowanie synapsy immunologicznej pomiędzy limfocytem T a profesjonalną komórką prezentującą antygen (APC) (A) oraz limfocyt T i tradycyjny model APC oparty na płaskiej dwuwarstwie lipidowej (B) w porównaniu z tym nowym płaskim modelem śródbłonka APC (C). Profesjonalne komórki prezentujące antygen (APC) zapewniają fizjologiczne synapsy immunologiczne, lecz oferują słabo zorientowany interfejs międzykomórkowy (t.j.w odniesieniu do optymalnego x-y płaszczyzna obrazowania; rozdzielczość ~0.2 μm), co drastycznie upośledza rozdzielczość przestrzenną (z rozdzielczość w płaszczyźnie obrazowania ~1 μm) i czasowych (t. j.ze względu na konieczność wielokrotnego przeszukiwania wszystkich z płaszczyzny obrazowania) rozdzielczość obrazowania. Modele dwuwarstwowe posiadają topologię płaską, która zapewnia optymalną czasowo-przestrzenną rozdzielczość obrazowania, są jednak mocno uproszczone, niefizjologiczne i sztywne. Niniejszy model komórek śródbłonka łączy topologię płaską dwuwarstw lipidowych z fizjologicznym podłożem klasycznego APC, aby zapewnić optymalną przestrzenną i czasową rozdzielczość obrazowania w warunkach fizjologicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53288/53288fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Poprzednie prace częściowo ominęły te przeszkody poprzez opracowanie modeli na podłożach płaskich (t.j. dwuwarstw lipidowych i powierzchni powlekanych przeciwciałami), które zapewniają optymalną rozdzielczość czasowo-przestrzenną (t.j. poprzez ustalenie powierzchni aktywacji limfocytów T w jednej płaszczyźnie równoległej do optymalnej płaszczyzny obrazowania x-y) 11-15 (Rysunek 1B). Modele te umożliwiły uzyskanie istotnych informacji na temat dynamiki subkomórkowej i molekularnej kontrolującej sygnalizację antygenową w limfocytach T, w tym odkrycie dynamicznych mikroskupisk sygnalizacyjnych aktyny/TCR 7,11-14. Jednakże modele te są z natury nadmiernie uproszczone, a także sztywne (co uniemożliwia rozwój i badanie trójwymiarowych cech topologicznych) (Rysunek 1B). W związku z tym nie jest jasne, w jaki sposób odnieść takie wyniki do fizjologicznego nadzoru immunologicznego w interakcjach komórka-komórka.
Mimo że wciąż słabo przebadane, naczyniowe i limfatyczne komórki śródbłonka wyłaniają się jako rozległa (i.e., liczebniejsza od wszystkich profesjonalnych APC około 1000-krotnie) obwodowa populacja „półprofesjonalnych” APC 16-18. Komórki te wykazują ekspresję MHC-I, MHC-II oraz wielu cząsteczek kostymulujących (e.g., CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1; lecz nie CD80 i CD86) i są strategicznie rozmieszczone na granicy krew-tkanka, gdzie pełnią wyspecjalizowane funkcje strażnicze 16-18. Poprzednie badania wykazały, że komórki śródbłonka mogą skutecznie restymulować efektorowe/pamięciowe, ale nie naiwne limfocyty T 19-25. Zatem komórki śródbłonka prawdopodobnie pełnią unikalne role APC w fazie efektorowej adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych w tkankach obwodowych, wywierając np. lokalny wpływ na aktywację, różnicowanie, pamięć i tolerancję limfocytów T 16,17,26. Co istotne, hodowane in vitro komórki śródbłonka tworzą niemal płaskie powierzchnie komórkowe i łatwo poddają się transfekcji (e.g., reporterami białek fluorescencyjnych). Cechy te są idealne do obrazowania dynamiki topologicznej podczas interakcji międzykomórkowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną 19,27. W związku z tym komórki śródbłonka mogą służyć jako fizjologiczny model „płaskich komórkowych APC”, szczególnie odpowiedni do badania subkomórkowych i molekularnych mechanizmów przebudowy, które napędzają rozpoznawanie antygenów i regulują odpowiedzi (Figure 1C) 19,20.
Wcześniej opracowane komplementarne techniki obrazowania (w tym transfekcja komórek śródbłonka markerami fluorescencyjnymi błony plazmatycznej i cytozolu) służące do badania szczegółów interakcji leukocytów z śródbłonkiem podczas adhezji i migracji transendotelialnej 27, wykazały, że leukocyty aktywnie badają powierzchnię śródbłonka poprzez dynamiczne wysuwanie i chowanie submikronowych, bogatych w aktynę wypustek cylindrycznych (o średnicy i głębokości ~200-1 000 nm) nazwanych wypustkami typu invadosome (ang. i.e., 'ILPs') 27,28. Podejścia obrazowania te zostały następnie rozszerzone wraz z opracowaniem protokołów wykorzystujących funkcję APC śródbłonka, co pozwoliło na stworzenie pierwszych metod obrazowania synapsy immunologicznej między limfocytami T a śródbłonkiem o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej, zgodnie z doniesieniami 19,20 i dalszym opisem w niniejszym opracowaniu. Kluczowym wnioskiem wynikającym z tego nowego planarnego modelu komórkowego APC jest to, że ILPs limfocytów T pełnią funkcję zarówno w promowaniu wstępnej detekcji Ag, jak i w podtrzymywaniu późniejszego sygnalizowania. Rzeczywiście, układy wielu ILPs (które zostały ustabilizowane i nagromadzone w odpowiedzi na wstępny napływ wapnia) wykazują wzbogacenie w TCR oraz cząsteczki sugerujące aktywne sygnalizowanie, takie jak PKC-Q, ZAP-70, fosfotyrozyna i HS1. Zatem ILPs wydają się stanowić trójwymiarowy fizjologiczny odpowiednik mikroklastrów sygnalizacyjnych TCR obserwowanych w planarnych modelach dwuwarstwowych. Podejście to w czuły sposób ujawnia i raportuje dynamikę molekularną, architektoniczną (oraz domniemaną biomechaniczną), która w inny sposób byłaby niewykrywalna.
Opisana tutaj metoda powinna być przydatna w niwelowaniu różnic między profesjonalnymi komórkami APC a modelami sztucznych substratów APC, aby zwiększyć nasze możliwości badania podstawowych mechanizmów adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznej. Choć w niniejszym opracowaniu skupiono się na aktywacji efektorowych/pamięciowych komórek CD4+ typu Th1, to podstawowe podejście można łatwo zmodyfikować w celu badania szerokiego zakresu typów limfocytów T oraz antygenów (Ags), co omówiono poniżej.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer rozciągliwa bezlateksowa opaska uciskowa</td><td>BD Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>waciki nasączone alkoholem BD</td><td>Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Zestaw do pobierania krwi z przyciskiem</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Przynieś do RT przed użyciem</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td>Inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>enterotoksyna gronkowcowa</td><td>B Technologia</td> <td>toksynBT202RED</td><td>Roztwór podstawowy 1 mg / ml w zespole wstrząsu toksycznego PBS</td></tr><tr><td>toksyna 1</td><td>Technologia toksyn</td><td>TT606RED</td><td>Roztwór podstawowy 1 mg / ml w PBS</td></tr><tr><td>ludzka IL-15</td><td>R& D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>Roztwór podstawowy 50ug/ml w PBS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>Roztwór podstawowy 1mg/ml w H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>Można stosować inne ludzkie mikronaczyniowe EC, tj. HLMVECs</td></tr><tr><td>EGM-2 MV bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>Roztwór podstawowy 10x, rozcieńczony w PBS</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Zestaw Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>Wymagany zestaw do kroku 4</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>Roztwór podstawowy 1mg/ml w H20</td></tr><tr><td>TNF-alpha 10ug, human</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Roztwór podstawowy 1mg/ml w fenolu H20</td></tr><tr><td>HBSS bez czerwieni</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Roztwór podstawowy 1M w H20</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td>Roztwór podstawowy 1M w H20</td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F Bezfluorescencyjny olejek immersyjny</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Roztwór podstawowy 1mM w DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem (Mem-YFP)</td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer (rozpuszczalny cytoplazmatyczny DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Membrana monomerowa (Mem-DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>Toksyczny, użyj oparów</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kolby poddane hodowli tkankowej Falcon T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kolby poddane hodowli tkankowej Falcon T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Hodowla komórek Corning traktowana T175</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy</td><td>12-545-85&nbsp;</td><td>Średnica 12 mm</td></tr><tr><td>&nbsp; Płytki do hodowli tkankowych Falcon 24-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Delta-T</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety Pasteura</td><td>Wheaton Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka Eppendorf&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ICAM1 mysz anty-ludzka</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>HS1 mysz anty-ludzka</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Oczyszczona</td><td>ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 Alexa Fluor&reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MHC klasy II&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Talin 1</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PKC theta&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>fosfotyrozyna (4G10 Platinum)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>Wymagany elektroporator do kroku 4</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zeiss Axiovison</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (seria 60) Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Forma STRCYCLE 37 &deg; C, 5% CO2 Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; Z359629</td><td>Hemocytometr Bright-Line</td></tr><tr><td>Izotemp Kąpiel wodna model 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Odporność adaptacyjna jest regulowana przez dynamiczne interakcje między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen ('APC'), zwane 'synapsami immunologicznymi'. W tych intymnych interfejsach komórka-komórka tworzą się i szybko przekształcają dyskretne subkomórkowe klastry MHC / Ag-TCR, F-aktyny, adhezji i cząsteczek sygnałowych. Uważa się, że dynamika ta jest krytycznym wyznacznikiem zarówno skuteczności, jak i jakości rozwijających się odpowiedzi immunologicznych, a tym samym odporności ochronnej i patologicznej. Obecna wiedza na temat synaps immunologicznych z fizjologicznymi APC jest ograniczona przez nieadekwatność możliwej do uzyskania rozdzielczości obrazowania. Chociaż sztuczne modele substratów (np. płaskie dwuwarstwy lipidowe) oferują doskonałą rozdzielczość i są niezwykle cennymi narzędziami, są one z natury niefizjologiczne i nadmiernie uproszczone. Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych i limfatycznych stały się ważnym przedziałem tkankowym obwodowym (lub zrębowym) "półprofesjonalnych APC". Te APC (które wyrażają większość maszynerii molekularnej profesjonalnych APC) mają unikalną cechę tworzenia praktycznie płaskiej powierzchni komórki i są łatwo transfekcyjalne (np. za pomocą fluorescencyjnych reporterów białkowych). W niniejszym artykule opisane zostanie podstawowe podejście do implementacji komórek śródbłonka jako nowatorskiego i fizjologicznego "płaskiego komórkowego modelu APC" w celu poprawy obrazowania i badania podstawowych procesów sygnalizacji antygenowej.

Opracowano nowatorskie podejście obrazowania z wykorzystaniem komórek śródbłonka, łączące zalety rozdzielczości modelu płaskich dwuwarstw lipidowych z fizjologiczną złożonością i odkształcalnością profesjonalnych komórek APC (Rysunek 1). Rysunek 2 przedstawia przykłady typowej migracji, przepływu wapnia i dynamiki topologicznej obserwowanej przy zastosowaniu tej metody. W przypadku braku SAg na śródbłonku, specyficzne dla SAg limfocyty CD4+ Th1...

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Ogólnym celem tej techniki jest wykorzystanie komórek śródbłonka jako nowego rodzaju płaskiego modelu komórki prezentującej antygen w celu zbadania podstawowych procesów sygnalizacji antygenowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu odporności adaptacyjnej, takie jak sposób, w jaki dynamika przebudowy subkomórkowej i molekularnej jest koordynowana przestrzennie i czasowo w obrębie synapsy immunologicznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że śródbłonek tworzy w zasadzie płaską powierzchnię PC.Pozwala to na obrazowanie z optymalną rozdzielczością czasowo-przestrzenną w kontekście fizjologicznie złożonej i formowalnej powierzchni komórkowej. Chociaż ta metoda skupia się na aktywacji komórek efektorowych pamięci TH1 CD4+, może być ona również zastosowana do badania różnych typów limfocytów T, antygenów i procesów sygnalizacyjnych. Dzisiaj Chris i ja pokażemy wam, jak przeprowadzić drugą część. Należy rozpocząć od kotransfekcji pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka naczyń mikrokrążenia płuc lub skóry za pomocą membranowego YFP i rozpuszczalnego DS red poprzez nukleofekcję, a następnie wysiać transfektowane komórki na płytki do hodowli przeznaczone do obra

an-endothelial-planar-cell-model-for-imaging-immunological-synapse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wsparte płaskie dwuwarstwy są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metody zakotwiczenia białek adhezyjnych komórek, o których wiadomo, że modulują one tworzenie synaps, w górnej warstwie dwuwarstwy lipidowej oraz wizualizacji procesu tworzenia synapsy za pomocą mikroskopii TIRF.<br...

Wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Ten film demonstruje obrazowanie na żywych komórkach topologii synaps immunologicznych, badając interakcje między limfocytami T a komórkami nabłonkowymi przenoszącymi antygeny fluorescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przemieszczenie czerwonej cytoplazmy i żółte pierścienie błonowe w komórkach śródbłonka, co wskazuje na tworzenie się synaps immunologicznych.

Ocena topologii synaps immunologicznych za pomocą obrazowania żywych komórek

Źródło: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki. J. Vis. Exp. (2021)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dynamiki dendrytycznej w żywych eksplantatach siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy stabilizacji siatkówki pod mikroskopem konfokalnym, wykonywania obrazowania epifluorescencyjnego w celu...

Poklatkowe obrazowanie konfokalne dynamiki dendrytycznej neuronów w eksplantatach siatkówki myszy

Tutaj ilustrujemy protokół obrazowania za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED, cytotoksycznej synapsy immunologicznej komórek NK rekapitulowanej na szkle. Za pomocą tej metody uzyskujemy rozdzielczość sub-100 nm białek synapsy i cytoszkieletu.

Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED (Time-Gated Stimulated Emission Depletion)

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Opisujemy tutaj połączenie techniki tworzenia synaps immunologicznych z wykorzystaniem dwuwarstwowego lipidu na wspartym szkłem z techniką obrazowania w superrozdzielczości mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom instrukcji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia tych dwóch technik.

Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Poznaj model płaskich komórek śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych. Ta metoda umożliwia badanie aktywacji limfocytów T z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Przeglądaj więcej filmów