2.5: Hodowla eksplantatów do badań rozwojowych

Hodowla eksplantatów to technika, w której całe tkanki i narządy są usuwane lub "eksplantowane" z płodu lub zarodka i są hodowane poza ciałem, czyli "ex vivo". Metody te zapewniają unikalne okno, które pomaga nam zrozumieć proces rozwoju, umożliwiając bezpośrednie obserwacje wzrostu narządów i tkanek - procesu zwanego organogenezą.

W tym filmie omówiono podstawowe zasady hodowli eksplantatów, nakreślimy kluczowe etapy procedury, omówimy typowe manipulacje i przedstawimy konkretne zastosowania tej techniki w badaniach rozwojowych.

Zanim opiszemy, jak hodować eksplantaty, przyjrzyjmy się niektórym zasadom stojącym za tą techniką.

Hodowla eksplantatów ma zastosowanie do różnych tkanek embrionalnych z szerokiej gamy organizmów. Technika ta jest idealna do badania rozwoju narządów, ponieważ zmiany strukturalne, znane jako morfogeneza, można bezpośrednio zaobserwować w funkcji czasu. Ponadto tkanki można traktować eksperymentalnymi cząsteczkami w celu określenia ich wpływu na rozwój. Co więcej, gdy hodowla eksplantatów jest połączona z narzędziami molekularnymi do zmiany ekspresji genów i mikroskopią fluorescencyjną, staje się potężnym narzędziem do rozwiązywania problemów różnicowania komórek i tkanek.

Następnie przyjrzyjmy się protokołowi hodowli eksplantatów tkanek ssaków.

Aby rozpocząć procedurę, zarodki są usuwane z poddanej eutanazji ciężarnego gryzonia. Po usunięciu otaczających błon zarodek jest izolowany. Tkanki lub narządy będące przedmiotem zainteresowania są następnie izolowane z wyekstrahowanego zarodka i przenoszone na płytki w celu wzrostu. Dodaje się pożywki zawierające antybiotyki, a płytki hoduje się w inkubatorze ustawionym na temperaturę 37°C. Eksplantaty tkankowe są teraz gotowe do manipulacji.

Po ustaleniu kultur eksplantatów można wykonać kilka rodzajów manipulacji.

Na przykład, eksplantowana tkanka może być genetycznie manipulowana w celu przetestowania roli interesującego genu w określonym procesie rozwojowym. Można to osiągnąć poprzez wprowadzenie materiału genetycznego do tkanki za pomocą technik takich jak elektroporacja, w której pole elektryczne jest wykorzystywane do kierowania wstrzykniętego DNA do pobliskich komórek.

Eksplantaty są również często używane do testowania ról, jakie cząsteczki sygnałowe, takie jak czynniki wzrostu, odgrywają w organogenezie. Hodowla tkankowa in vitro jest szczególnie przydatna w tego typu badaniach, ponieważ leczenie tym związkiem jest tak proste, jak dodanie go do pożywki hodowlanej. Jednak małe kulki nasączone związkami eksperymentalnymi można również wszczepić w tkankę, aby uzyskać bardziej kontrolowane podejście do leczenia chemicznego.

Niezależnie od przyjętego podejścia, główną zaletą techniki eksplantacji jest to, że efekty eksperymentalnych manipulacji można łatwo zobrazować w czasie rzeczywistym, za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej.

Przyjrzyjmy się teraz kilku konkretnym zastosowaniom kultury ex vivo.

Po pierwsze, eksplantaty reprezentują system modelowy, w którym rozwój tkanek może być bezpośrednio wizualizowany. Na przykład, naukowcy usunęli rozwijającą się trzustkę od embrionalnych myszy i hodowali ją na naczyniach ze szklanym dnem w celu poprawy obrazowania.

Rozwój tkanki można obserwować za pomocą mikroskopii świetlnej, ale zastosowanie transgenicznych markerów fluorescencyjnych eksprymujących tkankę zapewnia jeszcze bardziej szczegółowy obraz procesów rozwojowych, takich jak pączkowanie kanalików. Eksplantowane tkanki można również poddać barwieniu immunologicznemu, które pozwala naukowcom monitorować rozwój określonych typów komórek, takich jak komórki produkujące insulinę pokazane tutaj na niebiesko i zielono.

Innym zastosowaniem kultur eksplantatów jest pomoc w rozszyfrowaniu roli określonych cząsteczek, takich jak czynniki wzrostu, w organogenezie.

W tym przypadku eksplantaty płuc płodu wypreparowane z zarodków myszy E12,5 hodowano w obecności lub braku czynnika wzrostu przez okres do 48 godzin. Wyniki wskazują, że ten czynnik wzrostu hamuje tworzenie się dróg oddechowych w płucach płodu.

Wreszcie, eksplantaty z wczesnych zarodków można wykorzystać do określenia mechanizmów kontrolujących ekspresję genów podczas pierwszych etapów embriogenezy.

Naukowcy wydali dwa różne typy komórek z 16-komórkowego stadium zarodków żaby: te, które są przeznaczone do tworzenia struktur grzbietowych i te, które będą przyczyniać się do rozwoju struktur brzusznych. Eksplantaty pozostawiono do rozwoju przez około dzień przed barwieniem, aby scharakteryzować wzorzec ekspresji genu specyficznego dla tkanki grzbietowej.

Ponieważ ekspresję tego genu obserwowano tylko u eksplantatów z okolicy grzbietowej, stwierdzono, że programy ekspresji genów były kodowane w tych komórkach embrionalnych, a nie były kierowane przez interakcje komórka-komórka, które zachodzą w późniejszym okresie rozwoju.

Przyjrzeliśmy się teraz systemom hodowli eksplantatów i zaobserwowaliśmy, jak można je wykorzystać w badaniach rozwojowych. Technika ta jest potężnym narzędziem, które ułatwia nam zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju zwierząt. Dzięki za oglądanie!