Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji

Ogólnym celem tych procedur jest pokazanie, jak precyzyjnie przenieść komórki lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji. Metody te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak badanie potencjału in vivo komórek hodowanych in vitro oraz funkcji niektórych genów w określonych stadiach embrionalnych. Głównymi zaletami tych technik jest to, że nie wymagają one żadnego specjalistycznego sprzętu i umożliwiają eksperymentalne manipulacje wcześnie pozującym mszakiem myszy plantacyjnej Po złożeniu w ofierze ciężarnej samicy w dniu E 7,5 lub E 8,5 zgodnie z protokołem tekstowym, użyj nożyczek i kleszczy, aby odizolować macicę i umieścić ją w 30-milimetrowym naczyniu wypełnionym pożywką M two z dwiema parami cienkich kleszczy.

Ostrożnie rozerwij mięśniówkę macicy, a następnie oderwij decidua, uważając, aby nie przebić dodatkowych jam zarodkowych. Usuń błonę rikera za pomocą kleszczy, aby ją uszczypnąć i powoli oddzielić od zarodka. Następnie pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym sprawdź zarodki, aby upewnić się, że woreczek żółtkowy, owodnia i stożek op-łożyskowy są nienaruszone Za pomocą pipety przenieś zarodki do czystego naczynia M dwa i umieść na 30-milimetrowej plastikowej pokrywce szalki Petriego na lodzie lub platformie lodowej, aby częściowo schłodzić zarodki.

Przygotować pożywkę hodowlaną i zarodki hodowlane zgodnie z protokołem tekstowym w celu przeszczepienia hodowanych komórek do zarodków myszy. Zacznij od użycia końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby fizycznie zeskrobać komórki macierzyste eblastu, które powszechnie wyrażają GFP z sześciodołkowej płytki hodowlanej. Przenieś komórki do naczynia zawierającego zarodki.

Przymocuj ręcznie ciągniętą kapilę do szczepienia do rurki aspiratora, aby pipeta doustna delikatnie zassała pipetę do ust, aby wciągnąć jedną lub więcej kępek komórek większych niż 20 komórek do kapilary do szczepienia. Następnie delikatnie wydmuchaj komórki, aby rozproszyć duże grudki. Wybierz jedną grudkę zawierającą około 10 do 20 komórek i wciągnij ją do naczynia włosowatego do szczepienia.

Ponownie, trzymając grudkę blisko otworu naczynia włosowatego za pomocą pary kleszczy. Przytrzymaj zarodek luźno na miejscu i włóż kapilarnę do szczepienia w obszar zainteresowania. Aby utworzyć otwór.

Delikatnie wypchnij grudkę z naczynia włosowatego do szczepienia, pozostawiając krótki sznurek od 10 do 20 komórek osadzony w zarodku. Pozostaw zarodki w tym samym naczyniu z pożywką M 2 i użyj mikroskopu preparacyjnego ze związkiem fluorescencyjnym i kamery, aby zobrazować przeszczepione zarodki. Ogranicz czas obrazowania do minimum, aby uniknąć narażenia zarodków na nadmierne światło i ciepło.

Natychmiast po obrazowaniu za pomocą pasty przenieś zarodki o minimalnej objętości M dwa podłoża do wstępnie zbalansowanej pożywki hodowlanej i kultury zgodnie z wytycznymi w protokole tekstowym przed przeprowadzeniem eksperymentów elektroporacyjnych użyj poziomej mikropipety biegunowej, aby wyciągnąć pipety do iniekcji DNA z cienką końcówką i otworem mniejszym niż 10 mikrometrów Aby uniknąć uszkodzenia tkanek. W przypadku szklanej elektroporacji kapilarnej użyj mikrokuźni, aby wyciąć otwór pipet do wstrzykiwań DNA na średnicę wewnętrzną 20 lub 30 mikrometrów z czystą końcówką i bez złamanych krawędzi. Przymocuj każdą elektrodę platynową do cienkiego izolowanego drutu i włóż ją do uchwytu igły do mikroiniekcji pokrytego taśmą izolacyjną.

Aby przygotować ręcznie robioną elektrodę kapilarną, włóż platynowy drut o średnicy 0,2 milimetra do szklanej kapilary do elektroporacji ze stałym otworem o średnicy 20 lub 30 mikrometrów. Aby skupić prąd elektryczny i dostarczyć DNA osocza do małego obszaru zainteresowania w zarodku. Aby wykonać elektrodę w kształcie litery L, zegnij drut platynowy o średnicy 0,2 milimetra, tworząc kształt litery L z poziomą częścią litery L o długości około jednego milimetra.

Zamontuj uchwyty igieł na standardowych uchwytach do mikromanipulacji. Podłącz elektrodę kapilarną do anody zasilacza. Podłącz elektrodę w kształcie litery L do anody multimetru.

Następnie podłącz katodę multimetru do katody zasilacza. Napełnij szklaną kapilę do elektroporacji PBS z dokładnością do jednego do dwóch milimetrów od góry i włóż prostą platynową elektrodę do szklanej kapilary, aż dotrze do dna kapilary. Zakotwicz elektrodę w kształcie litery L na powierzchni 30-milimetrowej szalki Petriego wypełnionej PBS.

Użyj pneumatycznej pompy pico do wstrzyknięcia DNA. Wprowadzić igłę do wstrzykiwań z bocznego eblatu do jamy owodniowej zarodka i wstrzyknąć około pięciu mikrolitrów roztworu DNA do jamy lub do jej całkowitego zapełnienia. Uważaj, aby nie rozsadzić zarodka.

Następnie ostrożnie umieść zarodek między elektrodami i przesuń elektrodę kapilarną w dokładne miejsce, w którym ma zostać dostarczone DNA. Używając 200 woltów w sześciu impulsach trwających 50 milisekund, naelektryzowano zarodek elektrolitycznie z jednosekundową przerwą między każdym impulsem. Natychmiast przenieś zarodek do wstępnie zbalansowanej pożywki hodowlanej przed powtórzeniem elektroporacji dla następnego zarodka.

Wykrywanie żywych lub martwych komórek poddanych elektroporacji dwie godziny po elektroporacji. Zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem tekstowym jest to zarodek z epi PSC wykazującymi wszechobecną ekspresję EGFP, przeszczepiony na E 7,5 i hodowany ex vivo przez 24 godziny. Kiedy 10 do 16 fsc zostało wszczepionych do zarodków E 7,5, zostały one dobrze włączone i namnażają się w zarodku gospodarza.

Jednak przeszczepienie większej liczby komórek nie powoduje lepszego chimeryzmu i w rzeczywistości powoduje powstawanie niewłączonych grudek, jak pokazano tutaj. Jak pokazano w tej elektroporacji plazmidów eksprymujących GFP. Komórki GFP dodatnie wykryto od jednej do dwóch godzin po elektroporacji.

Gdy dystalne komórki eblastu w zarodku w późnym stadium prymitywnej smugi były elektroporowane, znakowane komórki wprowadzały się do nerwowej skóry właściwej po 24 godzinach w hodowli, co odpowiada znanym mapom losu komórek eblastów w zarodkach w stadium żołądkowym. Rysunek ten pokazuje, że podobnie jak w przypadku stosowania innych typów elektrod do elektroporacji, elektroda kapilarna również powodowała pewien stopień śmierci komórki w docelowym obszarze. Ponieważ obszar ten wydawał się ciemniejszy w porównaniu z sąsiednimi regionami, oznaczając jądra martwych komórek nieprzepuszczalną błoną, matrycą dalekiej czerwonej fluorescencji.

Potwierdzono, że technika elektroporacji kapilarnej powoduje powstanie tylko niewielkiej liczby martwych komórek w pobliżu miejsca elektroporacji. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest, aby rozpocząć hodowlę zarodków w ciągu dwóch godzin. Po odizolowaniu macicy od myszy pod koniec hodowli można utrwalić zarodki.

Inne metody, takie jak barwienie sekcyjne, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wkład dawcy lub komórki splecione elektrycznie do zarodków gospodarza. Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy dobrze zrozumieć, jak precyzyjnie przenieść komórki naszego DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji.