Hybrydyzacja in situ z pełnym montażem

Hybrydyzacja in situ jest potężną techniką, która umożliwia naukowcom zrozumienie molekularnych podstaw rozwoju embrionalnego. "Całościowe zamontowanie" oznacza, że zostanie użyty cały zarodek, a nie tylko wycinek tkanki. "In situ" to łacińskie wyrażenie oznaczające "na miejscu". I wreszcie, "hybrydyzacja" odnosi się do komplementarnego wiązania syntetycznie wytworzonej cząsteczki RNA z transkryptem mRNA w komórce organizmu.

Ten film pokaże procedurę, oczekiwane wyniki i wybrane zastosowania tej techniki, które mogą pozwolić na lepsze zrozumienie zaburzeń rozwojowych.

Geny leżące u podstaw morfogenezy organizmu ulegają ekspresji w ograniczonych czasowo i przestrzennie wzorcach w trakcie rozwoju embrionalnego.

Syntetycznie wytwarzane sondy RNA, zwane rybosondami, służą do wykrywania mRNA poprzez komplementarne wiązanie. Rybosondy są znakowane specjalnymi nukleotydami zawierającymi "hapteny", takie jak dinitrofenol, biotyna lub digoksygenina. Hapteny to cząsteczki, które mogą wywoływać odpowiedź immunologiczną, gdy są przyłączone do większych cząsteczek, a zatem są celami do wiązania przeciwciał. Te przeciwciała detekcyjne są sprzężone z enzymami, takimi jak peroksydaza chrzanowa lub fosfataza alkaliczna, które katalizują reakcje chemiczne, w których może zostać osadzony fluorescencyjny lub kolorowy barwnik.

Tradycyjne techniki hybrydyzacji in situ wymagają przygotowania skrawków tkanki zarodka, aby ułatwić wykrycie struktur wewnętrznych. W rezultacie, za pomocą oprogramowania komputerowego konieczna będzie pełna ocena ekspresji genów w całym organizmie z wycinków tkanki o grubości 5-6 μm. Jednak wraz z rozwojem technik całego wierzchowania można uzyskać analizę ekspresji genów na większe odległości w obrębie całego zarodka.

Po zapoznaniu się z zasadami stojącymi za hybrydyzacją in situ, przejdźmy krok po kroku przez protokół eksperymentalny.

Pierwszym krokiem w tej procedurze jest identyfikacja sekwencji docelowej w organizmie modelowym, który ma być badany. Docelowa sekwencja DNA jest następnie amplifikowana metodą PCR przy użyciu starterów zawierających sekwencje inicjacyjne polimerazy RNA. Amplifikowany szablon DNA jest teraz transkrybowany in vitro za pomocą nukleotydów znakowanych haptenem. Ta rybosonda znakowana haptenem jest teraz gotowa do etapu hybrydyzacji.

Zarodki są przygotowywane do hybrydyzacji poprzez utrwalenie formaldehydem, odczynnikiem sieciującym, który stabilizuje białka i chroni przed RNazami. Po utrwaleniu formaldehyd jest usuwany przez kilkukrotne przemycie zarodka solą fizjologiczną buforowaną fosforanami zawierającą niewielką ilość detergentu, takiego jak Tween. Aby usunąć lipidy komórkowe i ułatwić penetrację sondy do tkanek, zarodki są odwadniane w stopniowanej serii płukania metanolem, na przykład: 25%, 50%, 75%, 100% metanolu. Zarodki mogą być przechowywane w 100% metanolu przez okres do jednego miesiąca (lub dłużej) w temperaturze -20°C.

Aby przygotować zarodki do hybrydyzacji, muszą one zostać ponownie nawodnione przez stopniowaną serię płukań metanolem z stopniowo zmniejszającą się ilością metanolu na płukanie. Zarodki są następnie trawione za pomocą proteazy, aby ułatwić dyfuzję ryboprobu do tkanek. Znakowaną rybosondę dodaje się do zarodka i przeprowadza się hybrydyzację.

Mycie po hybrydyzacji wykonuje się w celu usunięcia niespecyficznych hybrydyzacji. RNazy A i T1 są dodawane w celu usunięcia niecałkowicie zhybrydyzowanych sond poprzez trawienie jednoniciowego RNA. Zhybrydyzowane sondy są wykrywane za pomocą koniugatu przeciwciało-enzym, który wiąże rybosondy znakowane haptenem. Jak wspomniano wcześniej, enzymy, takie jak fosfataza alkaliczna, są sprzężone z przeciwciałami specyficznymi dla haptenu i są wykrywane przez dodanie substratów enzymatycznych w celu wywołania zmiany koloru. Produkt reakcji tworzy ciemnofioletowy osad oznaczający lokalizację wyrażonego mRNA, jak pokazano w tym przykładzie.

Teraz, gdy wiesz już, jak przeprowadzić hybrydyzację in situ, przyjrzyjmy się niektórym zastosowaniom tej techniki.

Hybrydyzacja in situ została wykorzystana, aby pomóc naukowcom w walce ze śmiertelnymi chorobami przenoszonymi przez komary, takimi jak malaria, gorączka denga i choroba Zachodniego Nilu. Charakteryzując geny zaangażowane w rozmnażanie i rozwój komarów, można zaprojektować nowe biologiczne lub chemiczne środki owadobójcze, aby lepiej zwalczać komary przenoszące choroby.

Inne zastosowanie tej techniki polega na scharakteryzowaniu zmian wzorca ekspresji genów związanych z ekspozycją na teratogeny, czyli czynniki zakłócające rozwój płodu.

W tym przypadku zastosowano hybrydyzację in situ w modelu alkoholowego zespołu płodowego u danio pręgowanego w celu zidentyfikowania genów, których wzorce ekspresji ulegają zmianie po ekspozycji na alkohol. Może to pomóc w opracowaniu terapii mających na celu złagodzenie konsekwencji ekspozycji na alkohol w życiu płodowym.

Hybrydyzacja in situ może być również wykorzystana do walidacji zmian fenotypowych związanych z chorobami wrodzonymi. Mutacje związane z zespołem Bardeta-Biedla zostały wprowadzone do zarodków zebry danio pręgowanego za pomocą syntetycznie wytworzonych zmutowanych mRNA. Po określonym czasie zarodki dzielono na grupy w zależności od stopnia zaawansowania wad. Wizualizacja ekspresji genów znajdujących się za zmutowanym genem została wykorzystana do walidacji zmian fenotypowych. Tak więc hybrydyzacja in situ w połączeniu z oceną fenotypową może ułatwić lepsze zrozumienie ról określonych mutacji leżących u podstaw wad rozwojowych.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat hybrydyzacji in situ. Technika ta jest potężnym narzędziem, które umożliwia precyzyjną czasową i przestrzenną charakterystykę ekspresji genów w organizmie. Hybrydyzacja in situ jest obecnie wykorzystywana do generowania atlasu wzorców ekspresji genów podczas rozwoju w wielu organizmach modelowych. Badania te mogą ułatwić opracowanie nowych metod leczenia chorób u ludzi, w tym raka. Dzięki za oglądanie!