Name: Opisywanie zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj metodę opisu regulacji transkryptomu mikroRNA przez czynniki transkrypcyjne z wykorzystaniem analizy bioinformatycznej i danych z sekwencjonowania ChIP-seq.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant od CLL Global Research Foundation. University of Texas MD Anderson Cancer Center jest częściowo wspierany przez National Institutes of Health poprzez Cancer Center Support Grant (P30CA16672).

1. Identyfikacja miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego w promotorze genów mikroRNA przy użyciu metody eksploracji danych
<ol>
	<li>Przeglądarka genomu Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz (UCSC) umożliwia wyodrębnienie danych sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) wygenerowanych w ramach projektu Encyklopedia elementów DNA (ENCODE).
	<ol>
		<li>Otwórz przeglądarkę tabel w przeglądarce genomu UCSC.</li>
		<li>Użyj następujących specyfikacji, aby wyodrębnić tabelę: Klad: (Ssaki), genom: (Człowiek), Montaż: (Luty 2009 (GRch37 / hg18)), grupa: (regulacja), ścieżka (TxnFactorChIP), tabela: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), region: (Genom), format wyjściowy (wszystkie geny z wybranej tabeli).</li>
		<li>Zapisz dane wyjściowe z wersji 1.1.2 jako plik .txt i w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
		<li>Sortuj i filtruj według interesującego Cię czynnika transkrypcyjnego (np. STAT2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skorzystaj z listy promotorów mikroRNA opartej na sygnaturze epigenetycznej H3K4me3 dostępnej w Baeer i wsp.9. Skopiuj tę listę do pliku .txt.</li>
	<li>Aby dopasować się do współrzędnych w ludzkim genomie, zmapuj dane z 1.1 i 1.2 (np. STAT3 wiążące się z domniemanymi promotorami mikroRNA) i określ medianę powinowactwa wiązania za pomocą kodu napisanego w języku Csharp, jak opisano w uzupełniającym pliku kodowania 1.</li>
</ol>
2. Użyj shRNA, aby obniżyć ekspresję interesującego czynnika transkrypcyjnego
<ol>
	<li>Płytka 1,5 x 106 komórek z 293 ludzkiej linii komórek embrionalnych nerki w 10 cm płytce przy około 50% zbieganiu (DMEM z 10% FBS).</li>
	<li>Komórki transfekcyjne z 293 ludzkiej linii komórek zarodkowych nerki z 5 μg lentiwirusa zielonej fluorescencji (GFP) zawierającego shRNA skierowanego do interesującego czynnika transkrypcyjnego oraz z 5 μg wektorów pakowania za pomocą odczynnika do transfekcji dla komórek adherentnych zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Jako kontrolę, transfekować komórki z 293 ludzkiej linii komórek embrionalnych nerki za pomocą zaszyfrowanego shRNA i wektorów opakowania zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Przechowywać mieszankę transfekcyjną na komórkach przez 16 godzin (w temperaturze 37 °C, inkubator CO2), a następnie zmienić pożywkę na 10 ml świeżej 10% pożywki DMEM z 10% FBS.</li>
	<li>Odczekać 48 godzin po transfekcji, odwirować kulturę komórkową (300 x g, 5 min) i zebrać zakaźny supernatant. Przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy 0,45 μm (25-milimetrowa membrana z octanu celulozy bez środków powierzchniowo czynnych) w celu usunięcia wszelkich pływających komórek.</li>
	<li>Zagęścić supernatant i zebrać lentiwirusa za pomocą ultraodśrodkowego urządzenia filtrującego o wartości progowej 100 kDa. Wirować w temperaturze 950 x g przez 30 - 60 minut, aż objętość zostanie zagęszczona do mniej niż 250 μl. Skoncentrowany wirus należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Transfekcja komórek lentiwirusem. Wyjmij zamrożonego lentiwirusa z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmroź do temperatury pokojowej. Przenieś 100 μl supernatantu wirusowego do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
	<ol>
		<li>Zwiększyć objętość w probówce do 1 ml za pomocą zredukowanej pożywki surowicy. Dodać bromek heksadimetryny do 1 ml zawiesiny wirusa o końcowym stężeniu 10 ng/ml, delikatnie wymieszać i odstawić mieszaninę na 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować 5 x 106 komórek na każdą transdukcję i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml pożywki zawierającej wirusa. Pozostaw komórki w inkubatorze na 4 - 24 godziny, a następnie dodaj 0,5 ml pożywki z 20% FBS do końcowego stężenia 10% FBS.</li>
	<li>Odczekaj od 48 do 72 godzin i wybarwij komórki jodkiem propidyny (PI) i białkiem zielonego fluorescencyjnego (GFP) zgodnie z instrukcjami producenta. Chroń ogniwa przed światłem i użyj sortera FACS do pomiaru szybkości komórek GFP+ / PI-. Ponieważ PI barwi tylko martwą komórkę, wskaźnik ten jest oszacowaniem wydajności transfekcji w żywych komórkach.</li>
	<li>Posortuj dodatnią populację komórek do ekspresji GFP (GFP+) za pomocą sortera FACS, jak opisano wcześniej 10.</li>
	<li>Użyj Western immune blotting, jak opisano wcześniej 10, aby określić poziomy czynnika transkrypcyjnego będącego przedmiotem zainteresowania przed i po zakażeniu komórek będących przedmiotem zainteresowania (na przykład komórek CLL) wyznaczonymi shRNA.</li>
</ol>
3. Określ poziom ekspresji transkryptomu mikroRNA w komórkach transfekowanych czynnikiem transkrypcyjnym-shRNA
<ol>
	<li>Wyizoluj RNA za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Oznacz RNA i zhybrydyzuj go do mikromacierzymikroRNA 11.</li>
	<li>Określ różnicowo wyrażone mikroRNA w komórkach transfekowanych czynnikiem transkrypcyjnym-shRNA lub z pustymi kontrolami wektorowymi5.</li>
	<li>Walidacja wyników mikromacierzy dla mikroRNA o najbardziej zróżnicowanej ekspresji za pomocą PCR 5 w czasie rzeczywistym.</li>
</ol>
4. Określ nakładanie się podejścia bioinformatycznego i shRNA w opisie transkryptomu zależnego od czynnika transkrypcyjnego
<ol>
	<li>Aby określić oczekiwane i obserwowane proporcje genów mikroRNA, które zawierają miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego w swoich promotorach i zostały obniżone w komórkach transfekowanych czynnikiem transfekcyjnym shRNA, wykonaj następujące czynności:
	<ol>
		<li>Uzyskaj stosunek genów, które zawierają interesujący ich czynnik transkrypcyjny w ich promotorze / całkowitym mikroRNA z listy wygenerowanej w 1.3. Ta lista jest oczekiwanym stosunkiem (np. geny mikroRNA z miejscami wiązania STAT3 / całkowita liczba badanych genów mikroRNA = 0,25).</li>
		<li>Określ liczbę genów, które zostały obniżone w komórkach transfekowanych czynnikiem transfekcyjnym czynnika transkrypcyjnego shRNA z listy wygenerowanej w 3.3 ORAZ ma czynnik transkrypcyjny interesujących miejsc wiązania z listy wygenerowanej w 1.3. Ta liczba/całkowita liczba genów regulowanych w dół jest obserwowanym stosunkiem (np. geny mikroRNA z miejscami wiązania STAT3/całkowita liczba mikroRNA regulowanych w dół = 0,6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj statystyk χ2, aby porównać obserwowane i oczekiwane stosunki, które zostały wygenerowane powyżej i określić, czy lista genów, które zostały obniżone w komórkach transfekowanych czynnikiem transkrypcyjnym shRNA, jest wzbogacona o miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego w ich promotorze.</li>
</ol>

<ol><li>Bentwich, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hundreds+of+conserved+and+nonconserved+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs.</a> Nat Genet. 37, 766-770 (2005).</li>
<li>Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+are+highly+enriched+within+microRNA+precursor+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences.</a> Biol Direct. 6, 61(2011).</li>
<li>Rozovski, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29-3+regulates+microRNA+gene+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells.</a> Mol Cancer. 12, 50(2013).</li>
<li>Turner, M. J., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+microRNA+expression+in+C.+elegans%3A+promoting+better+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding.</a> RNA Biol. 6, 49-53 (2009).</li>
<li>Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+preferentially+target+the+genes+with+high+transcriptional+regulation+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).</li>
<li>Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34%2C+SIRT1+and+p53%3A+the+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop.</a> Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).</li>
<li>Baer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter+DNA+hypermethylation+and+hypomethylation+is+associated+with+aberrant+microRNA+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).</li>
<li>Hazan-Halevy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+is+constitutively+phosphorylated+on+serine+727+residues%2C+binds+DNA%2C+and+activates+transcription+in+CLL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells.</a> Blood. 115, 2852-2863 (2010).</li>
<li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TARBP2+mutation+in+human+cancer+impairs+microRNA+processing+and+DICER1+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function.</a> Nat Genet. 41, 365-370 (2009).</li>
<li>Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+STAT+family+proteins%3A+lessons+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice.</a> Stem Cells. 17, 138-146 (1999).</li>
<li>Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+from+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+contain+signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29+1+and+STAT3+constitutively+phosphorylated+on+serine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues.</a> J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS biology. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Miranda, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pattern-based+method+for+the+identification+of+MicroRNA+binding+sites+and+their+corresponding+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes.</a> Cell. 126, 1203-1217 (2006).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489, 57-74 (2012).</li>
<li>Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+imprinted+epigenetic+modifications+of+the+human+NDN+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene.</a> Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).</li>
<li>Corcoran, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+mammalian+microRNA+promoters+emerge+from+polymerase+II+chromatin+immunoprecipitation+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data.</a> PLoS One. 4, e5279(2009).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+transcription+start+site+prediction+with+multi-objective+feature+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Mechanizm leżący u podstaw zależnej od polimerazy RNA II transkrypcji genów kodujących białka został szeroko zbadany. Podczas gdy elementy te stanowią zaledwie 1–2% ludzkiego genomu, dowody uzyskane w ramach projektu ENCODE sugerują, że ponad 80% ludzkiego genomu może podlegać transkrypcji 17 , a to, co reguluje transkrypcję niekodujących elementów DNA, pozostaje w dużej mierze nieznane 6.
Kilka badań, które wykazały, że Pol II jest również odpowiedzialny za transkrypcję ...

MicroRNA to endogenne małe niekodujące regulatorowe RNA, które zazwyczaj funkcjonują jako negatywne regulatory ekspresji mRNA na poziomie posttranskrypcyjnym. W ludzkim genomie znajduje się około 1000 niekodujących mikroRNA o długości od 20 do 25 nukleotydów 1,2. MikroRNA regulują ekspresję genów poprzez kanoniczne parowanie zasad między sekwencją nasienną mikroRNA a jego komplementarną sekwencją dopasowania nasion, która zwykle znajduje się w regionie 3' nieulegającym translacji (UTR) docelowych mRNA. Łącznie mikroRNA regulują ponad 30% genów kodujących białka 3, ale niewiele wiadomo na temat transkrypcji mikroRNA z DNA. Sugeruje się, że regulacja transkrypcji mikroRNA jest podobna do regulacji mRNA 4,5. W szczególności, podobnie jak w przypadku aktywności w promowaniu transkrypcji genów kodujących białka, uważa się, że czynniki transkrypcyjne aktywują transkrypcję mikroRNA 6. Interakcja czynnika transkrypcyjnego z mikroRNA została opisana jako czynnik modulujący ekspresję genów 7 i może również tworzyć pętle sprzężenia zwrotnego i sprzężenia zwrotnego. Na przykład Yamakuchi i wsp. opisali pętlę sprzężenia zwrotnego, w której p53 indukuje ekspresję mikroRNA34a, co z kolei hamuje translację represora p53 SIRT, zwiększając w ten sposób aktywność p53 8.
Podczas gdy konkretne przykłady ekspresji mikroRNA zależnej od czynnika transkrypcyjnego zostały już przedstawione, brakuje akceptowanej metody, która dostarczałaby informacji o tym, jak interesujący czynnik transkrypcyjny reguluje ekspresję transkryptomu mikroRNA. Celem proponowanego w niniejszym dokumencie protokołu jest zapewnienie dogłębnego opisu zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA. Łącząc publicznie dostępne dane, narzędzia bioinformatyczne i wykorzystując technologię mikromacierzy, naukowcy, którzy postępują zgodnie z tym algorytmem, będą w stanie uchwycić w skali genomicznej, w jaki sposób dowolny czynnik transkrypcyjny w dowolnym typie komórki reguluje ekspresję transkryptomu mikroRNA i zbadać domniemany wkład czynnika transkrypcyjnego-mRNA w regulację ekspresji mikroRNA.

<table><tbody><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Ultraodśrodkowe urządzenie filtrujące Amicon z progiem 100&nbsp; kDa</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol odczynnik</td><td>Life Tachnologies (Invitrogen)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>293 Linia komórkowa ludzka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85120602</td><td></td></tr></tbody></table>

opisywanie zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikrorna

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Podczas gdy regulacja transkrypcji genów kodujących białka była szeroko badana, niewiele wiadomo na temat tego, jak czynniki transkrypcyjne są zaangażowane w transkrypcję niekodujących RNA, szczególnie mikroRNA. W tym miejscu proponujemy strategię badania potencjalnej roli czynnika transkrypcyjnego w regulacji transkrypcji mikroRNA przy użyciu publicznie dostępnych danych, zasobów obliczeniowych i danych o wysokiej przepustowości. Używamy sygnatury epigenetycznej H3K4me3 do identyfikacji promotorów mikroRNA i danych sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) z projektu ENCODE w celu identyfikacji promotorów mikroRNA, które są wzbogacone o miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych. Poprzez transfekcję komórek będących przedmiotem zainteresowania shRNA ukierunkowanych na czynnik transkrypcyjny będący przedmiotem zainteresowania i poddanie komórek macierzy mikroRNA, badamy wpływ tego czynnika transkrypcyjnego na transkryptom mikroRNA. Jako przykład obrazowy posłużymy się naszym badaniem wpływu STAT3 na transkryptom mikroRNA komórek przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL).

STAT3 jest czynnikiem transkrypcyjnym, który zazwyczaj indukuje transkrypcję genów o działaniu antyapoptotycznym i proliferacyjnym 12. Obecnie nie wiadomo, czy STAT3 wpływa również na transkryptom niekodującego RNA. We wszystkich komórkach CLL STAT3 jest konstytutywnie fosforylowany w obrębie reszt seryny 707 10,13. Fosfoserynowy STAT3 przemieszcza się do jądra komórkowego, wiąże się z DNA i aktywuje geny, które w innych typach komórek są aktywowane przez tyrozynowy ...

Tutaj proponujemy strategię badania wpływu interesującego czynnika transkrypcyjnego na transkryptom mikroRNA, korzystając z publicznie dostępnych danych, zasobów obliczeniowych i danych o wysokiej przepustowości z macierzy mikroRNA po transfekcji komórek z małą spinką do włosów (sh)RNA ukierunkowaną na interesujący czynnik transkrypcyjny.

Opisywanie zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest opisanie sposobu, w jaki wybrany czynnik transkrypcyjny reguluje transkryptom mikroRNA. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, czy czynniki transkrypcyjne modulujące transkrypcję genów kodujących białka są również zaangażowane w transkrypcję mikroRNA. Główną zaletą tej metodologii jest integracja eksploracji danych, danych laboratoryjnych oraz analizy bioinformatycznej w celu zapewnienia kompleksowego opisu transkrypcji genów mikroRNA zależnej od aktywności badanego czynnika transkrypcyjnego.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat interakcji między transkrypcją genów mikroRNA a aktywnością czynnika transkrypcyjnego, należy pamiętać, że jest to metoda opisowa, a potwierdzenie takiej zależności powinno zostać przeprowadzone przy użyciu dodatkowych analiz. Aby rozpocząć, należy otworzyć przeglądarkę genomu, taką jak przeglądarka genomu University of California Santa Cruz, w celu wyodrębnienia danych z sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny. Po wejściu na stronę należy przejść do górnego menu, wybrać Tools i otworzyć Table Browser.Wprowadź specyfikacje, tak jak pokazano tutaj, do odpowiednich pól, a następnie wybierz Get Output, aby wyodrębnić tabelę. Zapisz wynik jako plik tekstowy. Następnie zaimportuj plik do arkusza kalkulacyjnego.Po otwarciu danych w programie arkusza kalkulacyjnego, posortuj kolumnę z nazwami i przefiltruj wyniki pod kątem interesującego czynnika transkrypcyjnego, np. STAT2. Następnie skopiuj listę promotorów mikroRNA na podstawie ich epigenetycznego sygnatu H3K4me3 i wklej tę listę do pliku txt. Następnie użyj dołączonego kodu napisanego w języku SQL, dostępnego w plikach z danymi uzupełniającymi, aby zmapować zebrane dane i wyznaczyć medianę powinowactwa wiązania.W pierwszej kolejności należy przenieść 1,5 miliona komórek HEK293 do szalki o średnicy 10 centymetrów i dodać DMEM uzupełniony o 10% FBS. Hodować komórki przez 24 godziny, aż osiągną około 50% konfluencji. Następnie należy wymienić medium.Następnie, zgodnie z instrukcjami producenta, dodaj czynnik transfekcyjny połączony z pięcioma mikrogramami lentiwirusa zawierającego białko fluorescencyjne GFP i docelowe shRNA oraz pięcioma mikrogramami wektorów pakujących. W ramach kontroli przeprowadź transfekcję identycznej płytki z komórkami, wykorzystując shRNA o sekwencji scrambled oraz wektory pakujące. Inkubuj mieszaninę do transfekcji na komórkach przez 16 godzin, a następnie wymień pożywkę na 10 mililitrów świeżej pożywki DMEM uzupełnionej o 10% FBS.48 godzin po transfekcji usuń pożywkę z komórek. Następnie wiruj przez pięć minut, aby zebrać zakaźny nadsącz. Przefiltruj nadsącz przez filtr strzykawkowy 0,45 µm w celu usunięcia wszelkich pływających komórek.Następnie przenieś pożywkę do urządzenia do filtracji ultracentryfużowej o progu odcięcia 100 kilodaltonów. Wirować pożywkę w celu skoncentrowania lentiwirusa, aż objętość wyniesie mniej niż 250 mikrolitrów. Przenieś pozostały płyn do krioprobówki i przechowuj skoncentrowany wirus w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu użycia.Po przygotowaniu do kontynuacji, wyjmij zamrożonego lentiwirusa z zamrażarki do -80°C i doprowadź fiolkę do temperatury pokojowej. Przenieś 100 µL supernatantu wirusowego do nowej probówki mikrodowirowej o pojemności 1,5 ml i dodaj 900 µL pożywki bez surowicy. Następnie do 1 ml zawiesiny wirusowej dodaj 10 ng/ml bromku heksadymetryny.Delikatnie wymieszaj zawartość probówki i pozostaw mieszaninę na pięć minut. Odwieź pięć milionów komórek dla każdej planowanej transdukcji, a następnie delikatnie resuspenduj osad komórkowy w 0,5 milliliters pożywki zawierającej wirusa. Przenieś komórki na płytkę 12-dołkową i inkubuj je przez okres od 4 do 24 godzin.Następnie dodaj dodatkowe 0.5 milliliters pożywki zawierającej 20%FBS. Od 48 do 72 godzin po transdukcji zbierz komórki i zabarw je jodkiem propidyny zgodnie z instrukcją producenta. Po zabarwieniu chroń komórki przed światłem i wykorzystaj analizę FACS do oszacowania wydajności transwekcji poprzez pomiar odsetka komórek GFP-dodatnich i negatywnych względem jodku propidyny.Następnie należy zebrać posortowaną populację komórek GFP-dodatnich i wyekstrahować z nich białka. Na koniec należy przeprowadzić analizę western blotting, aby określić poziomy docelowego czynnika transkrypcyjnego przed i po zainfekowaniu komórek odpowiednim shRNA. Po transwekcji komórek CLL shRNA przeciwko STAT3, poziomy mRNA STAT3 oraz białka STAT3 uległy znacznemu obniżeniu.Ponadto analiza microRNA array komórek CLL wykazała 23 cząsteczki microRNA, których ekspresja różniła się istotnie pomiędzy komórkami CLL przetransfekowanymi shRNA przeciwko STAT3 a komórkami CLL przetransfekowanymi pustym wektorem. Wyniki microRNA array zostały zwalidowane dla siedmiu z tych genów, przedstawionych tutaj, przy użyciu ilościowej RT-PCR. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak immunoprecypitacja chromatyny, test przesunięcia elektromobilności (EMSA) oraz analiza różnicowa, aby potwierdzić, że ten czynnik transkrypcyjny wiąże i aktywuje promotor konkretnego genu docelowego.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak zintegrować analizę bioinformatyczną, ogólnodostępne dane oraz wyciszanie czynnika transkrypcyjnego przy użyciu podejścia shRNA, aby zbadać, w jaki sposób ten czynnik transkrypcyjny reguluje ekspresję genów mikroRNA.

describing-transcription-factor-dependent-regulation-microrna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

MikroRNA (miRNA) są istotnymi regulatorami ekspresji genów i wykazano, że odgrywają one rolę w licznych procesach biologicznych. Aby lepiej zrozumieć interakcje miRNA-UTR, stworzyliśmy obejmującą cały genom kolekcję reporterów lucyferazy 3' UTR, połączonych z nowym genem lucyferazy i odczynnikiem analitycznym, systemem LightSwitch.

Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego LightSwitch Luciferase z wykorzystaniem konstruktów reporterowych 3'UTR oraz mimiku mikroRNA w komórkach adherentnych

Opisujemy tutaj metodę regulacji tropizmu picornawirusa poprzez włączenie sekwencji komplementarnych do określonych mikroRNA do genomu wirusa.  Protokół ten można dostosować do wszystkich różnych klas wirusów, wprowadzając modyfikacje w zależności od długości i charakteru ich cyklu życia.

Regulacja tropizmu pikornawirusa w oparciu o mikroRNA

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.

Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)

Opisujemy zastosowanie spektrometru z przepływem zatrzymanym (stopped-flow) do badania reakcji redukcyjnej i utleniającej sideroforu A Aspergillus fumigatus (SidA), który jest monooksygenazą zależną od flawiny. Następnie przedstawiamy widma odpowiadające produktom reakcji SidA i obliczamy stałe szybkości ich powstawania.

Monitorowanie reakcji połowicznych redukcyjnych i utleniających monooksygenazy zależnej od flawiny z wykorzystaniem spektrofotometrii z szybkim mieszaniem (stopped-flow)

Prezentujemy kombinację mikroskopii krioelektronowej, nanotechnologii lipidowej i analizy struktury zastosowanej do rozdzielenia struktury związanej z błoną dwóch wysoce homologicznych form FVIII: ludzkiej i świńskiej. Opisano metodologię opracowaną w naszym laboratorium w celu spiralnego uporządkowania dwóch funkcjonalnych rekombinowanych form FVIII na ujemnie naładowanych nanorurkach lipidowych (LNT).

Helisowa organizacja czynnika krzepnięcia krwi VIII na nanorurkach lipidowych

Tutaj opisujemy proste metody przygotowania pęcherzyków, enkapsulacji maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej oraz monitorowania produkcji białek. Powstałe w ten sposób systemy bezkomórkowe mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia do budowania coraz bardziej złożonych mimik komórkowych.

Enkapsulacja bezkomórkowej maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej w pęcherzykach do budowy mimiki komórkowej

Poznaj metodę opisu regulacji transkryptomu mikroRNA przez czynniki transkrypcyjne z wykorzystaniem analizy bioinformatycznej i danych z sekwencjonowania ChIP-seq.

Opisywanie zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA

Przeglądaj więcej filmów