Name: In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy (PEMT) w surowych ekstraktach komórkowych Leishmania. Technika radiowa pozwala badać metabolizm lipidów bez konieczności oczyszczania enzymu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH ARRA RO3 AI078145 i 1SC3GM113743 dla RZ.

1. Przygotowanie ekstraktu komórkowego
<ol>
	<li>Hoduj komórki Leishmania w sterylnej plastikowej butelce zamkniętej hermetyczną nakrętką w temperaturze 26 ºC w pożywce wykonanej z 1x M199 uzupełnionej 20 mM HEPES pH7,4, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 5 μg/ml hemu, 0,35 g/L NaCO2H, 0,1 mM adeniny i 2 μg/ml biopteryny bez wstrząsania. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 1 500 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, gdy osiągną gęstość komórek 1-2 x 107/ml.</li>
	<li>Odrzucić supernatant pipetą i przemyć komórki poprzez ponowne zawieszenie osadu komórkowego za pomocą pipety serologicznej w połowie objętości kultury soli fizjologicznej buforowanej zimnymi fosforanami (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4). Supernatanty komórkowe należy utylizować zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa BL2.</li>
	<li>Ponownie odwirować komórki w temperaturze 1 500 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad za pomocą pipety. Przejdź do następnego kroku lub zatrzaskowo zamroź osad komórkowy w ciekłym azocie do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 ºC (do trzech miesięcy).</li>
	<li>Przygotuj 2x bufor do lizy (0,5 M sacharozy, 0,1 M TrisHCl, pH 7,5, 2 mM EDTA i 2x koktajl inhibitorów proteazy) i utrzymuj go w temperaturze 4 ºC na lodzie.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy (świeży lub zamrożony) w równej objętości 2x buforu do lizy. Dodaj 1x objętość szklanych koralików. Wirować energicznie w temperaturze 4 ºC przez 10 min.</li>
	<li>Dodaj 2 objętości 1x buforu do lizy i wymieszaj. Odwirować ekstrakty komórkowe w temperaturze 1 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu osadzenia nieuszkodzonych komórek i jąder.</li>
	<li>Przenieść supernatant za pomocą pipety do świeżej, chłodnej probówki wirówkowej i przechowywać ekstrakty komórkowe na lodzie aż do zakończenia doświadczenia.</li>
</ol>
2. Określ stężenie białka w ekstrakcie komórkowym za pomocą zestawu do oceny białka, takiego jak test kwasu bicunchoninowego
<ol>
	<li>Przygotować roztwór kwasu bicinchoninowego (BCA) (1 ml/probówkę), mieszając BCA i siarczan miedzi (II) w stosunku 49:1 (v/v).</li>
	<li>Przygotować wzorce białka 0, 10, 20, 30, 40, 50 i 60 μg/ml, rozcieńczając roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 10 mg/ml w 1 ml podwielokrotności roztworu BCA.</li>
	<li>Dodać 2 μl ekstraktów komórkowych w 1 ml roztworu BCA w dwóch egzemplarzach. Roztwory wzorcowe i próbki białka inkubować przez 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Przenieść próbki do lodu na 3 minuty. Zmierzyć absorbancję wzorców i próbek białek za pomocą spektrofotometru o długości fali 562 nm.</li>
	<li>Obliczyć stężenie białka w ekstraktach komórkowych, stosując wzorzec BSA jako odniesienie, zgodnie z opisem w protokole producenta. Rozcieńczyć ekstrakty komórkowe do stężenia białka 10 mg/ml z 1x buforem do lizy.</li>
</ol>
3. Test enzymatyczny w 200 μl na probówkę
UWAGA: Wykonaj następujące kroki w kapturze chemicznym.
<ol>
	<li>Zbadać każdą próbkę w dwóch egzemplarzach w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przygotuj 20 μl 1 M TrisHCl pH 7,5 na probówkę i trzymaj na lodzie. Przygotować 2 ml chloroformu/metanolu (roztwór zatrzymujący w stosunku 1:1 (v/v); roztwór zatrzymujący) w temperaturze pokojowej dla każdej probówki.</li>
	<li>Odpipetować 20 μl 1 M TrisHCl pH 7,5 do każdej stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie.</li>
	<li>Od tego momentu należy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa radiacyjnego. Dodać odpowiednik 0,06 μM (0,2 μCi) S-[metylo-3 H]adenozylo-L-metioniny i 50 μM zimnego SAM na probówkę, co daje w sumie 50,06 μM SAM. Dodać x μl zimnej wody, gdzie x = 200-(20 (dla buforu) + 20 (dla ekstraktów komórkowych) + objętość zimnego i radioaktywnego SAM) na probówkę.</li>
	<li>Przenieść każdą stożkową rurkę do wstępnie ogrzanej łaźni wodnej o temperaturze 30 °C. Dodać do każdej probówki 20 μl ekstraktów komórkowych (odpowiednik 200 μg białka), aby rozpocząć reakcję. Inkubować przez żądany czas (od 0 do 45 minut).</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, dodając 2 ml chloroformu/metanolu (roztwór zatrzymujący w stosunku 1:1; v/v) do każdej probówki. Przenieść rurkę stożkową do temperatury pokojowej (20-25 ºC).</li>
</ol>
4. Ekstrakcja lipidów
UWAGA: Wykonaj następujące kroki w kapturze chemicznym.
<ol>
	<li>Dodać 700 μl wody do każdej probówki zawierającej próbkę reakcji enzymatycznej. Wiruj energicznie przez 30 sekund. Wirować przy 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia fazy organicznej od wodnej.</li>
	<li>Przenieść dolną fazę organiczną do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety. Dodać 1 ml wody do każdej "dolnej fazy" zawierającej probówkę i energicznie wirować przez 30 sekund. Ponownie odwirować przy 1 500 x g przez 5 minut, aby oddzielić fazę organiczną od wodnej.</li>
	<li>Przenieś dolną fazę organiczną do probówki scyntylacyjnej za pomocą pipety. Suszyć próbki pod strumieniemN2. Fazy wodne zawierające niewbudowany radioaktywny SAM i radioaktywne stożkowe rurki należy usunąć zgodnie z wytycznymi dotyczącymi promieniowania.</li>
	<li>Dodać 2 ml / probówkę płynu scyntylacyjnego. Zmierzyć wbudowaną radioaktywność za pomocą licznika scyntylacyjnego zgodnie z protokołem producenta i zastosowaniem przyrządu.</li>
	<li>Obliczyć aktywność enzymatyczną w nmol/mg białka, korzystając z następującego równania ogólnego: 
	wartość cpm x 103 x [całkowite (radioaktywne i zimne) stężenie SAM (mM)] x 5 aktywność właściwa promieniotwórczego SAM (Ci/mmol) x [stężenie radioaktywnego SAM (mM)] 
	UWAGA: powyższy protokół może zostać zmieniony dla testu PEMT zależnego od stężenia SAM lub zależnego od białka. W przypadku testu enzymatycznego zależnego od stężenia SAM czas jest utrzymywany na stałym poziomie (15 minut, co mieści się w zakresie liniowym) i do testu dodaje się różne ilości zimnego SAM, podczas gdy w przypadku testu PEMT zależnego od białka stężenie SAM (wybraliśmy 0,05 mM) i czas są utrzymywane na stałym poziomie (15 min). Również pH buforu można zmienić w razie potrzeby, jeśli niektóre enzymy PEMT mają inną optymalną wartość pH.</li>
</ol>

<ol><li>Keogh, M. R., Courtney, P. D., Kinney, A. J., Dewey, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+phospholipid+N-.methyltransferases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of phospholipid N-.methyltransferases from Arabidopsis and soybean.</a> J Biol Chem. 284 (23), 15439-15447 (2009).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim Biophys Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+lipogenesis+in+white+adipose+tissue+contributes+to+the+resistance+to+high+fat+diet-induced+obesity+in+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Decreased lipogenesis in white adipose tissue contributes to the resistance to high fat diet-induced obesity in phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-deficient mice.</a> Biochim Biophys Acta. 1851 (2), 152-162 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+alters+plasma+VLDL+phospholipids+and+attenuates+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase alters plasma VLDL phospholipids and attenuates atherosclerosis in mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (9), 1349-1355 (2009).</li>
<li>Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+methylation+in+mammals%3A+from+biochemistry+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipid methylation in mammals: from biochemistry to physiological function.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (6), 1477-1487 (2014).</li>
<li>Nishimaki-Mogami, T., Suzuki, K., Takahashi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+phosphatidylethanolamine+methylation+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins+by+cultured+rat+hepatocytes%3A+rapid+inhibition+of+phosphatidylethanolamine+methylation+by+bezafibrate+increases+the+density+of+apolipoprotein+B48-containing+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of phosphatidylethanolamine methylation in the secretion of very low density lipoproteins by cultured rat hepatocytes: rapid inhibition of phosphatidylethanolamine methylation by bezafibrate increases the density of apolipoprotein B48-containing lipoproteins.</a> Biochim Biophys Acta. 1304 (1), 21-31 (1996).</li>
<li>Noga, A. A., Zhao, Y., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+requirement+for+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An unexpected requirement for phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase in the secretion of very low density lipoproteins.</a> J Biol Chem. 277 (44), 42358-42365 (2002).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+repression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+%28PEMT%29+in+BRCA1-mutated+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Epigenetic repression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase (PEMT) in BRCA1-mutated breast cancer.</a> Oncotarget. 5 (5), 1315-1325 (2014).</li>
<li>Cui, Z., Houweling, M., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+rat+hepatoma+cell+growth+by+expression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of rat hepatoma cell growth by expression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-2.</a> J Biol Chem. 269 (40), 24531-24533 (1994).</li>
<li>Cui, Z., Shen, Y. J., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+correlation+between+expression+of+phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2+and+growth+rate+of+perinatal+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inverse correlation between expression of phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2 and growth rate of perinatal rat livers.</a> Biochim Biophys Acta. 1346 (1), 10-16 (1997).</li>
<li>Minder, A. C., de Rudder, K. E., Narberhaus, F., Fischer, H. M., Hennecke, H., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+levels+in.Bradyrhizobium+japonicum.+membranes+are+critical+for+an+efficient+symbiosis+with+the+soybean+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine levels in.Bradyrhizobium japonicum. membranes are critical for an efficient symbiosis with the soybean host plant.</a> Mol Microbiol. 39 (5), 1186-1198 (2001).</li>
<li>Kodaki, T., Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+phosphatidylethanolamine+methylation+pathway.+Cloning+and+characterization+of+two+distinct+methyltransferase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast phosphatidylethanolamine methylation pathway. Cloning and characterization of two distinct methyltransferase genes.</a> J Biol Chem. 262 (32), 15428-15435 (1987).</li>
<li>Tanaka, Y., Amano, F., Maeda, M., Nishijima, M., Akamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine+N-.methyltransferase%2C+the+enzyme+catalyzing+the+second+and+the+third+steps+in+the+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+system%2C+from+mouse+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Med+Sci+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine N-.methyltransferase, the enzyme catalyzing the second and the third steps in the phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase system, from mouse liver microsomes.</a> Jpn J Med Sci Biol. 43 (3), 59-73 (1990).</li>
<li>Bibis, S. S., Dahlstrom, K., Zhu, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Leishmania+major+phosphatidylethanolamine+methyltransferases+LmjPEM1+and+LmjPEM2+and+their+inhibition+by+choline+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Leishmania major phosphatidylethanolamine methyltransferases LmjPEM1 and LmjPEM2 and their inhibition by choline analogs.</a> Mol Biochem Parasitol. 196 (2), 90-99 (2014).</li>
<li>deRudder, K. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti.+mutants+deficient+in+phospholipid+N-.methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti. mutants deficient in phospholipid N-.methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J Bacteriol. 179 (22), 6921-6928 (1997).</li>
<li>Aktas, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+the+enzyme+properties+of+the+phospholipid+N-.methyltransferase+PmtA+from+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of the enzyme properties of the phospholipid N-.methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens.</a> J Bacteriol. 191 (7), 2033-2041 (2009).</li>
<li>Ridgway, N. D., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase from rat liver.</a> Methods Enzymol. 209, 366-374 (1992).</li>
<li>Gaynor, P. M., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+methyltransferase+and+phospholipid+methyltransferase+activities+from+Saccharomyces+cerevisiae.+Enzymological+and+kinetic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine methyltransferase and phospholipid methyltransferase activities from Saccharomyces cerevisiae. Enzymological and kinetic properties.</a> Biochim Biophys Acta. 1045 (2), 156-163 (1990).</li>
<li>Arondel, V., Benning, C., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+expression+in+Escherichia+coli.+of+a+gene+encoding+phosphatidylethanolamine+methyltransferase+%28EC+2.1.1.17%29+from+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional expression in Escherichia coli. of a gene encoding phosphatidylethanolamine methyltransferase (EC 2.1.1.17) from Rhodobacter sphaeroides.</a> J Biol Chem. 268 (21), 16002-16008 (1993).</li>
<li>Wessel, M., Klusener, S., Godeke, J., Fritz, C., Hacker, S., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Agrobacterium+tumefaciens.+requires+phosphatidylcholine+in+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Virulence of Agrobacterium tumefaciens. requires phosphatidylcholine in the bacterial membrane.</a> Mol Microbiol. 62 (3), 906-915 (2006).</li>
<li>Klusener, S., Aktas, M., Thormann, K. M., Wessel, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+physiological+relevance+of+Agrobacterium+tumefaciens.+phosphatidylcholine+biosynthesis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Expression and physiological relevance of Agrobacterium tumefaciens. phosphatidylcholine biosynthesis genes.</a> J Bacteriol. 191 (1), 365-374 (2009).</li>
<li>Henderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+encoding+Leishmania+donovani.S.-adenosylhomocysteine+hydrolase%2C+a+potential+target+for+antiparasitic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene encoding Leishmania donovani.S.-adenosylhomocysteine hydrolase, a potential target for antiparasitic chemotherapy.</a> Mol Biochem Parasitol. 53 (1-2), 169-183 (1992).</li>
<li>Koszalka, G. W., Krenitsky, T. A. 5'-Methylthioadenosine (MTA) phosphorylase from promastigote of Leishmania donovani. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoszalka%2C+GW+%22Purine+and+Pyrimidine+Metabolism+in+Man+V%2C+Adv+Exp+Med+Biol%22">Purine and Pyrimidine Metabolism in Man V, Adv Exp Med Biol</a>. Nyhan, W. L., Thompson, L. F., Watts, R. W. E. 131, Springer US. 559-563 (1986).</li>
<li>Biastoff, S., Teuber, M., Zhou, Z. S., Dräger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+activity+measurement+of+a+recombinant+putrescine+N.-methyltransferase+from+Datura+stramonium%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">Colorimetric activity measurement of a recombinant putrescine N.-methyltransferase from Datura stramonium.</a> Planta Med. 72 (12), 1136-1141 (2006).</li>
<li>Hendricks, C. L., Ross, J. R., Pichersky, E., Noel, J. P., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+colorimetric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled colorimetric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 326 (1), 100-105 (2004).</li>
<li>Cannon, L. M., Butler, F. N., Wan, W., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereospecific+colorimetric+assay+for+%28S.%2CS.%29-adenosylmethionine+quantification+based+on+thiopurine+methyltransferase-catalyzed+thiol+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A stereospecific colorimetric assay for (S.,S.)-adenosylmethionine quantification based on thiopurine methyltransferase-catalyzed thiol methylation.</a> Anal Biochem. 308 (2), 358-363 (2002).</li>
<li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S.-adenosyl-L-methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S.-adenosyl-L-methionine.</a> Biochemistry. 25 (15), 4444-4449 (1986).</li>
<li>Wu, S. E., Huskey, W. P., Borchardt, R. T., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+instability+at+sulfur+of+S.-adenosylmethionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chiral instability at sulfur of S.-adenosylmethionine.</a> Biochemistry. 22 (12), 2828-2832 (1983).</li>
<li>Dorgan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 350 (2), 249-255 (2006).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanego konfliktu interesów

Ten prosty, szybki test PEMT pozwala na ilościowe określenie metylowanych form PE, które powstają w wyniku przeniesienia radioaktywnych grup metylowych z SAM na PE przy użyciu ekstraktu z całych komórek jako źródła białka. Jest szybki, czuły, powtarzalny, a także nadaje się do oczyszczonych enzymów 17. Monometylo- lub dimetylo-PE można dodać do testu, jeśli metylotransferaza będąca przedmiotem zainteresowania jest specyficzna dla tych substratów, a nie dla PE 12,13,18,19. Jeśli stosuje się oczyszczo...

Enzymy metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy (PEMT) katalizują kowalencyjne przyłączanie jednej lub więcej grup metylowych za pomocą S-adenozylometioniny (SAM) jako donora grupy metylowej na PE, monometylo-PE lub dimetylo-PE, aby uzyskać monometylo-PE, dimetylo-PE i/lub fosfatydylocholinę (PC). Enzymy te są prawie wszechobecne w komórkach zwierzęcych i grzybach. Można je również znaleźć w niektórych roślinach 1 i około 10% bakterii, szczególnie tych, które wchodzą w interakcje z eukariontami 2.
PEMT są istotne dla biologii komórki, nie tylko przyczyniając się do produkcji PC, która jest główną klasą lipidów w komórkach zwierzęcych, ale także spełniając inne ważne funkcje komórkowe. U ssaków PEMT ulegają ekspresji głównie w wątrobie, gdzie są niezbędne do prawidłowego wydzielania lipoprotein o bardzo niskiej gęstości, a także przyczyniają się do otyłości wywołanej dietą 3, miażdżycy 4 i insulinooporności 5. Dodatkowo PEMT ssaków ulega również ekspresji w adipocytach, choć do niższych poziomów, i uczestniczy w odkładaniu tłuszczu 6,7. Wykazano również rolę PEMT w rozwoju raka 8, apoptozie 9 i wzroście komórek 10. Wykazano, że u bakterii enzymy PEMT są ważne dla prawidłowego wzrostu komórek 2, wirulencji 2 i symbiozy z rośliną żywicielską 11.
Celem i uzasadnieniem obecnego protokołu jest pomiar aktywności PEMT z ekstraktów z całych komórek bez potrzeby oczyszczania enzymu. Opracowano dwa odrębne protokoły pomiaru aktywności PEMT. Pierwszy i najpowszechniejszy polega na przeniesieniu trytytowanej grupy metylowej z radioaktywnego SAM na PE, co jest tematem tego artykułu. Protokół ten został pierwotnie opracowany do pomiaru aktywności PEMT z komórek drożdży 12 i ssaków (wątroby) 13 w celu zrozumienia biosyntezy PC w tych komórkach, a także określenia specyficzności tych enzymów. Później technika ta została zastosowana do innych typów komórek, takich jak bakterie 2 (przy użyciu podstawowej wartości pH dla testu 15) i pasożytnicze pierwotniaki 14. Technika ta może być stosowana zarówno z ekstraktami z całych komórek, jak i z oczyszczonym enzymem, i potencjalnie może być stosowana do dowolnego systemu ekstrakcji komórek. Zaprojektowano również test nieradioaktywny, który opiera się na enzymatycznym oznaczaniu ilościowym S-adenozylohomocysteiny, produktu transmetylacji SAM 16. Ten drugi test może być wygodniejszy, ponieważ nie obejmuje radioaktywności, ale nadaje się tylko do oczyszczonych enzymów.

<table><tbody><tr><td>S-[metylo-3H]adenozylo-L-metionina (specyficzna aktywność 5-15 Ci/mMol)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>Podwielokrotną ilość odczynnika i zamrozić w temperaturze -20 &deg; C; postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa radiacyjnego podczas korzystania z tego odczynnika</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche Life Sciences</td><td>11836170001</td><td>rozcieńczyć go na świeżo&nbsp;</td></tr><tr><td>Koraliki szklane, płukane kwasem, 425-600 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu bicunchoninowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny MicroBeta2 z 1-detektorem</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300</td><td></td></tr><tr><td>roztwór podstawowy BSA (10 mg / ml)</td> <td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Ciecz scyntylacyjna&nbsp;</td><td>Produkt Badawczy International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek (chlorowodorku) S-(5'-adenozylo)-L-metioniny&nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td><td>rozcieńczyć odczynnik w 20 mM HCl i zamrozić podwielokrotności w temperaturze -80 & stopni; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy są enzymami biosyntetycznymi, które katalizują transfer jednej lub więcej grup metylowych z S-adenozylo-L-metioniny na fosfatydyloetanoloaminę, monometylo-fosfatydyloetanoloaminę, lub dimetylofosfatydyloetanoloaminę, dając monometylo-fosfatydyloetanoloaminę, dimetylo-fosfatydyloetanoloaminę lub fosfatydylocholinę. Enzymy te są wszechobecne w komórkach zwierzęcych, grzybach, a także znajdują się w około 10% bakterii. Pełnią różne ważne funkcje w fizjologii komórki poza ich bezpośrednią rolą w metabolizmie lipidów, takich jak insulinooporność, cukrzyca, miażdżyca, wzrost komórek lub zjadliwość. Niniejszy manuskrypt informuje o prostym, bezkomórkowym teście enzymatycznym, który mierzy transfer trytyowanych grup metylowych z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z całych komórek jako źródła enzymu. Powstałe metylowane formy fosfatydyloetanoloaminy są hydrofobowe, a zatem można je oddzielić od rozpuszczalnej w wodzie S-[metylo-3] adenozylo-L-metioniny przez ekstrakcję organiczną. Test ten może być potencjalnie zastosowany do dowolnych innych typów komórek i wykorzystany do testowania inhibitorów/leków specyficznych dla metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy będącej przedmiotem zainteresowania bez konieczności oczyszczania enzymu.

Rysunek 1 przedstawia zależny od czasu test PEMT, który został przeprowadzony z Leishmania ekstrakt z całych komórek jako źródło enzymu, z wykorzystaniem endogennej PE jako substratu. Ilość radioaktywności w fazie organicznej określono za pomocą licznika scyntylacyjnego. Otrzymane wartości wykorzystano do obliczenia ilości grup metylowych znakowanych trytem, które zostały przeniesione na PE. Aktywność PEMT była liniowa przez około 20 min. Następnie, około 30 min,...

Niniejszy raport opisuje test enzymatyczny in vitro do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z komórek Leishmania. Test ten opiera się na przeniesieniu radioaktywnej grupy metylowej z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do endogennej fosfatydyloetanoloaminy.

In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Ogólnym celem tej metodologii jest ilościowe oznaczenie aktywności fosfatydyloetanoloaminy metylotransferazy (PEMT) w ekstraktach z całych komórek. Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu metabolizmu lipidów, takie jak znaczenie fosfatydyloetanoloaminy metylotransferaz w biosyntezie fosfatydylocholiny. Główną zaletą tego protokołu jest możliwość pomiaru aktywności w ekstrakcie z całych komórek, co eliminuje konieczność oczyszczania enzymu.Niniejszy protokół może dostarczyć informacji na temat tego, w jaki sposób pasożyty syntetyzują fosfatydylocholinę, będącą ich najliczniej występującym lipidem. Protokół ten można zastosować również do innych typów komórek, takich jak komórki ssaków i bakterie. Hodowlę komórek Leishmania prowadzono w sterylnej plastikowej butelce zamkniętej szczelną zakrętką w temperaturze 26 °C w uzupełnionym medium M199 bez wytrząsania.Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 1500G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, gdy osiągną gęstość od 10 do 20 milionów komórek na mililitr. Po usunięciu supernatantu za pomocą pipety przemyj komórki, resuspendując osad komórkowy pipetą serologiczną w objętości zimnego soliżowego roztworu fosforanowego (PBS) stanowiącej połowę objętości hodowli.Ponownie odwiruj komórki przy 1550G przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Usuń nadsącz za pomocą pipety. Przejdź do następnego kroku lub zamroź gwałtownie osad komórkowy w ciekłym azocie w celu długoterminowego przechowywania w temperaturze -80 °C.Następnie resuspender osad komórkowy w równoważnej objętości 2X buforu do lizy. Dodać objętość 1X kulek szklanych i intensywnie mieszać w wstrząsarku vortex w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Dodać dwie objętości 1X buforu do lizy i wymieszać.Następnie odwiruj ekstrakty komórkowe przy 1500G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, aby wytrącić nieuszkodzone komórki i jądra. Przenieś nadosad za pomocą pipety do nowej, schłodzonej probówki do wirowania i przechowuj ekstrakty komórkowe w lodu aż do zakończenia eksperymentu. Dodaj dwa mikrolitry ekstraktów komórkowych do jednego mililitra roztworu kwasu bicinchoniniowego i wykonaj pomiar w dublecie.Inkubuj standardy i próbki białek przez 10 minut w uprzednio ogrzanej kąpieli wodnej o temperaturze 60°C. Przenieś próbki na lód na trzy minuty. Zmierz absorbancję standardów i próbek białek za pomocą spektrofotometru przy długości fali 562 nm.Oblicz stężenie białka w ekstraktach komórkowych, wykorzystując standard albuminy surowicy bydlęcej jako punkt odniesienia, zgodnie z protokołem producenta. Rozcieńcz ekstrakty komórkowe do stężenia białka 10 mg/mL za pomocą buforu do lizy 1X. W dygestorium przygotuj każdą próbkę oraz jej duplikat w 15 ml probówce stożkowej.Do każdej probówki przygotuj 20 µL 1 M Tris-HCl o pH 7,5 i przechowuj w lodzie. Przygotuj również w temperaturze pokojowej po 2 ml roztworu zatrzymującego chloroform-metanol do każdej probówki. Do każdej 15 ml probówki stożkowej znajdującej się w lodzie pipetuj 20 µL 1 M Tris-HCl.Następnie, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa radiacyjnego, dodaje się do każdej probówki ilość odpowiadającą 0,06 µM trytowanego SAM oraz 50 µM nieznacznionego SAM, co daje łącznie 50,06 µM SAM. W tym momencie do każdej probówki dodaje się objętość wody destylowanej obliczoną zgodnie z protokołem tekstowym. Każdą probówkę stożkową przenosi się do uprzednio podgrzanej do 30 °C łaźni wodnej.Do każdej probówki dodaj 20 µL ekstraktów komórkowych, aby rozpocząć reakcję. Inkubuj próbki przez wybrany czas. Zatrzymaj reakcję, dodając do każdej probówki dwa mililitry chloroformu z metanolem.Przenieść probówki stożkowe do temperatury pokojowej. Pracując w dygestorium, dodać 700 µL wody do każdej probówki zawierającej próbkę reakcji enzymatycznej. Intensywnie wymieszać w wstrząsarku wirowej (vortex) przez 30 sekund.Następnie odwiruj próbki przy 1500g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby oddzielić fazę organiczną od wodnej. Podczas przenoszenia dolnej fazy kluczowe jest, aby nie pobrać żadnej części fazy wodnej, ponieważ zafałszowałoby to obliczenia analizy. Za pomocą pipety przenieś dolną fazę organiczną do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.Do każdej probówki zawierającej fazę dolną należy dodać 1 mL wody i intensywnie mieszać w wstrząsarku wirówkowym przez 30 sekund. Następnie ponownie odwirować próbki przy 1500G przez pięć minut w celu oddzielenia fazy organicznej od fazy wodnej. Dolną fazę organiczną przenieść pipetą do probówki scyntylacyjnej.Osusz próbki w strumieniu gazu azotowego. Zutylizuj fazy wodne zawierające nieinkorporowany radioaktywny SAM oraz radioaktywne probówki stożkowe zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ochrony radiologicznej. Następnie dodaj do każdej probówki 2 ml cieczy scyntylacyjnej.Zmierz wbudowaną radioaktywność za pomocą licznika scyntylacyjnego zgodnie z protokołem producenta i specyfikacją użytych urządzeń. Oblicz aktywność enzymatyczną w nanomolach na miligram białka, korzystając z równania zamieszczonego w protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj zależny od czasu test PEMT, który przeprowadzono z wykorzystaniem ekstraktu z całych komórek Leishmania jako źródła enzymu, stosując endogenną PE jako substrat.Ilość radioaktywności w fazie organicznej została określona za pomocą licznika scyntylacyjnego i wykorzystana do obliczenia ilości grup metylowych z trytem przeniesionych na PE. Aktywność PEMT była liniowa przez około 20 minut. Następnie osiągnęła plateau około 30 minuty, po czym pozostała stała przez kolejne 15 minut. Zgodnie z oczekiwaniami, nie wykryto aktywności PEMT w przypadku braku dodatku ekstraktów komórkowych, natomiast została ona wykryta po dodaniu ekstraktów komórkowych do analizy.Ponadto aktywność ta została zniesiona w obecności 100 micromolar octadecyltrimethylammonium bromide, który jest specyficznym inhibitorem metylotransferaz fosfatydyloetanolaminy LMJ PEM One i LMJ PEM two z Leishmania major. Aktywność PEMT była również zależna od stężenia białka i była liniowo proporcjonalna do ilości białka zastosowanego w teście enzymatycznym. Na koniec przeprowadzono test PEMT zależny od stężenia SAM, w którym przetestowano zwiększające się stężenia SAM.Aktywność PEMT osiągnęła plateau przy stężeniu SAM wynoszącym około 0,5 mM. Opanowanie tego protokołu zajmuje od trzech do pięciu godzin, w zależności od liczby próbek. Podczas realizacji protokołu bardzo ważne jest użycie świeżo zakupionego SAM, ponieważ związek ten jest niestabilny.Należy pamiętać, że praca z patogenami i substancjami promieniotwórczymi może być niezwykle niebezpieczna. Dlatego ważne jest przestrzeganie wytycznych dotyczących bezpieczeństwa oraz stosowanie odpowiedniego sprzętu laboratoryjnego.

in-vitro-assay-to-measure-phosphatidylethanolamine-methyltransferase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznego substratu tRNA dla homologu metylotransferazy DNA/tRNA 2 (Dnmt2) z Entamoeba histolytica, Ehmeth, oraz pomiar jego aktywności metylotransferazy. To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania aktywności innych białek Dnmt2.

Analiza metylacji tRNA in vitro z użyciem enzymu DNA i tRNA metylotransferazy Dnmt2 (Ehmeth) z Entamoeba histolytica

Ten film demonstruje test enzymatyczny oparty na chromatografii cienkowarstwowej do określenia aktywności pirofosfokinazy przy użyciu znakowanych radioaktywnie nukleotydów. Metoda dostarcza informacji na temat syntezy nukleotydów i reakcji fosfotransferu.

Test aktywności enzymatycznej oparty na chromatografii cienkowarstwowej: technika określania aktywności pirofosfokinazy in vitro za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Metylacja argininy białek, katalizowana przez klasę enzymów, tj. metylotransferazy białkowe argininy (PRMT), to proces enzymatycznego dodawania grup metylowych do arginin w białkach. Test metylacji in vitro jest najbardziej wiarygodnym narzędziem do oceny stanu metylacji znanych lub nowych substratów PRMT.

Metody in vitro Test metylacji do badania metylacji białek argininy

Opisujemy podstawowy protokół ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro. Protokół ten można zoptymalizować w oparciu o poziom aktywności i wymagania dla danej oczyszczonej ATPazy.

Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

Istnieje zapotrzebowanie, aby testy przedkliniczne nowej klasy leków "sierocych" zwanych farmakologicznymi białkami opiekuńczymi były powtarzalne, szybkie i skuteczne. Opracowaliśmy prosty, wysoce ustandaryzowany i wszechstronny test oparty na hodowli komórkowych do badań przesiewowych dla kwalifikujących się pacjentów, a także nowatorskie farmakologiczne leki opiekuńcze.

In vitro Pomiar enzymów w celu zbadania farmakologicznej reakcji białka opiekuńczego w chorobie Fabry'ego i Pompego

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

Tutaj prezentujemy metodę przesiewową dla inhibitorów pirofosfatazy związanej z błoną (z Thermotoga maritima) opartą na reakcji błękitu molibdenowego w formacie płytki 96-dołkowej.

Badania przesiewowe w kierunku inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną Thermotoga maritima

Palmitoylacja polega na włączeniu 16-węglowego ugrupowania palmitynianowego do reszt cysteinowych docelowych białek w odwracalny sposób. W tym miejscu opisujemy podejście biochemiczne, test przesunięcia żelu acylo-pegylowego (APEGS), w celu zbadania stanu palmitoilacji dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania w lizatach mózgu myszy.

Test przesunięcia żelu acylo-pegylowego do ilościowego oznaczania palmitoylacji białek błony mózgowej

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Poznaj metodę pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy (PEMT) w surowych ekstraktach komórkowych Leishmania. Technika radiowa pozwala badać metabolizm lipidów bez konieczności oczyszczania enzymu.

In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

Przeglądaj więcej filmów