Name: Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj technikę in utero elektroporacji do modyfikacji komórek w korze mózgowej, hipokampie, wzgórzu i podwzgórzu myszy C57BL/6. Ta metoda umożliwia szybkie badanie rozwoju mózgu bez konieczności generowania genetycznie zmodyfikowanych zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie techniczne przez Melanie Pfeifer i Nikolaia Schmarowskiego (Instytut Anatomii Mikroskopowej i Neurobiologii, Uniwersyteckie Centrum Medyczne w Moguncji).

Oświadczenie etyczne: Postępowanie z myszami i procedury eksperymentalne były prowadzone zgodnie z europejskimi, krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Elektroporacja w macicy
Uwaga: Elektroporacja in utero została przeprowadzona, jak poprzednio opublikowano12,14. W związku z tym metoda ta została opisana jedynie pokrótce w dalszej części (rysunek 1).
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Przygotować szybko zielony roztwór plazmidu o wysokiej klasie transfekcji (zawierający 1,5 pCAGGS), jak opisano wcześniej12.</li>
		<li>Pociągnij i zmiel (kąt 35°) kapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica 0,8-0,9) do iniekcji.</li>
		<li>Sterylizuj narzędzia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>chirurgia
	<ol>
		<li>Leki przeciwbólowe (karprofen, 4 mg/kg masy ciała, s.c., 24 godziny na dobę) należy podać co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu.</li>
		<li>Utrzymuj długość znieczulenia maksymalnie 35-45 min (Etap III - etap znieczulenia chirurgicznego wg Guedela15 - maksymalnie 25-30 min).</li>
		<li>Znieczulenie ciężarnych myszy w czasie za pomocą izofluranu (indukcja w komorze: 2,8%, operacja przez maskę: 2,5%). Potwierdź znieczulenie przez brak reakcji na szczypanie palca.</li>
		<li>Nałóż maść do oczu, aby zapobiec suchości oczu podczas znieczulenia.</li>
		<li>Wysterylizuj obszar chirurgiczny 7,5% roztworem jodu prowidonu i przykryj mysz sterylną gazą (zwilżoną 0,9% roztworem soli fizjologicznej alkoholu benzylowego), odsłaniając tylko obszar operacyjny.</li>
		<li>Rozciąć jamę brzuszną skalpelem (nacięcie skóry: 1,5-2 cm, nacięcie mięśni: 1-1,5 cm).</li>
		<li>Uchronić otwartą jamę brzuszną przed wysuszeniem poprzez zwilżenie podgrzanym 0,9% roztworem soli fizjologicznej alkoholu benzylowego lub innym sterylnym roztworem izotonicznym zgodnie z zaleceniami personelu weterynaryjnego lub komitetu. </li>
		<li>Ostrożnie wyjmij rogi macicy (za pomocą kleszczy pierścieniowych nie dotykaj macicy palcami).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja DNA i elektroporacja. Uwaga: dokładne informacje na temat kierowania na konkretne regiony znajdują się w sekcji 2.
	<ol>
		<li>Powoli wstrzyknąć kolorowy roztwór DNA do komory, jak pokazano na rysunku 1 i sekcji 2, przez przygotowane naczynia włosowate borokrzemianowe.</li>
		<li>Zastosuj odpowiednie napięcie dla odpowiedniego stadium embrionalnego (np. 36-38 V dla E14) za pomocą specjalistycznych platynowych elektrod typu kleszczowego (długość cyklu interwałowego 50 ms, przerwa 950 ms). Podczas podawania napięcia pulsuj łopatkami elektroporacyjnymi, aby zminimalizować uszkodzenie ściany macicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie pozabiegowe
	<ol>
		<li>Ostrożnie wymień rogi macicy w jamie brzusznej.</li>
		<li>Zszyj mięsień i nacięcie skóry osobno.</li>
		<li>Pozwól myszy odpocząć na urządzeniu podtrzymującym termicznie w celu odzyskania.</li>
		<li>Nadzoruj mysz podczas rekonwalescencji (zachowanie, zużycie paszy i wody), 4 godziny, 24 godziny i 48 godzin po operacji. W razie potrzeby należy zastosować dodatkowe leki przeciwbólowe (karprofen, 4 mg/kg masy ciała, 24 godziny zapasów) przez kolejne 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transfekcja określonych obszarów mózgu
Uwaga: Pozycja bieguna dodatniego jest pokazana jako kąt między pionową linią środkową przechodzącą przez komorę wypełnioną roztworem DNA (prawa lub trzecia komora) a pozycją bieguna dodatniego. Podczas napełniania lewej komory pozycje są odwrócone lustrzanie. Na rycinie 4 przedstawiono położenie ucha pierwotnego, które stanowi ważne punkty odniesienia.
<ol>
	<li>Transfekcja obszarów korowych (ryc. 2A, tabela 1).
	<ol>
		<li>Wykonać zabieg chirurgiczny zgodnie z opisem w punkcie 1.2. Do elektroporacji in utero obszarów korowych należy użyć zarodków E14.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1,5-2 μl roztworu DNA zawierającego 4 μg DNA do prawej komory bocznej przez przygotowane naczynia włosowate borokrzemianowe.
		<ol>
			<li>Ostrożnie ustaw zarodek za pomocą kleszczy pierścieniowych tak, aby nad miejscem nakłucia nie było widocznych naczyń.</li>
			<li>Powoli wstrzyknąć roztwór DNA około 0,75 mm korony od szwu lambdoidalnego i 0,5 mm bocznie od szwu strzałkowego (ryc. 3). Upewnij się, że głębokość wsunięcia wynosi 1,2 mm (E14, mierzona od ściany macicy). Sprawdź, czy ma niebiesko-zielone zabarwienie z ostrym rozgraniczeniem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przyłóż napięcie za pomocą specjalistycznych elektrod platynowych typu kleszczykowego (długość cyklu interwału 50 ms, przerwa 950 ms).
		<ol>
			<li>Użyj łopatki elektrody 3 lub 5 mm.</li>
			<li>Użyj napięcia w zakresie 36-38 V.</li>
			<li>Umieść środek elektrod tuż przed zawiązkami ucha.</li>
			<li>Aby transfekować korę zaśledzionową, użyj kątów od 330-0 °, aby transfekować korę ruchową 0-40 °, aby transfekować korę somatosensoryczną 40-95 °, aby transfekować korę gruszkowatą 95-110 ° (ryc. 2A).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeprowadzić zabieg po elektroporacji/pielęgnacji pooperacyjnej zgodnie z opisem w punkcie 1.4. Złożyć myszy, złożyć je w ofierze i przeanalizować zarodki 4 dni po elektroporacji (E18), jak opisano w punkcie 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja hipokampa (ryc. 2B, tabela 1).
	<ol>
		<li>Wykonać zabieg chirurgiczny zgodnie z opisem w punkcie 1.2. Do elektroporacji in utero tworzenia hipokampa należy użyć zarodków E15.</li>
		<li>Wstrzyknąć 2 μl roztworu DNA zawierającego 4 μg DNA do prawej komory bocznej przez przygotowane naczynia włosowate borokrzemianowe.</li>
		<li>Przyłóż napięcie za pomocą specjalistycznych elektrod platynowych typu kleszczykowego (długość cyklu interwału 50 ms, przerwa 950 ms).
		<ol>
			<li>Użyj łopatki elektrody 3 lub 5 mm.</li>
			<li>Użyj napięcia w zakresie 38-40.</li>
			<li>Umieść środek bieguna ujemnego tuż przed zawiązkiem ucha, a środek bieguna dodatniego na środku zawiązka ucha.</li>
			<li>Aby transfekować zakręt zębaty, użyj kątów od 190-210°, aby wykonać transfekcję rogówki (CA)3 210-230°, aby transfekować CA2 230-250°, aby przetransfekować CA1 250-275° (ryc. 2B).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeprowadzić zabieg po elektroporacji/pielęgnacji pooperacyjnej zgodnie z opisem w punkcie 1.4. Przeprowadzić analizę po całkowitym utworzeniu hipokampa (po urodzeniu, p21) zgodnie z opisem w punkcie 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja jądra przegrody bocznej i prążkowia (ryc. 2C, tabela 1) 
	Uwaga: Kąty pokrywają się z kątami transfekcji hipokampa. Aby skutecznie przetoczyć jądro przegrody bocznej i prążkowie bez niepożądanej transfekcji hipokampa, należy zastosować wcześniejsze stadia embrionalne (E12).
	<ol>
		<li>Wykonać zabieg chirurgiczny zgodnie z opisem w punkcie 1.2. Do elektroporacji in utero jądra przegrody bocznej i prążkowia należy użyć zarodków E12.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 μl roztworu DNA zawierającego 4 μg DNA do prawej komory bocznej przez przygotowane naczynia włosowate borokrzemianowe.</li>
		<li>Przyłóż napięcie za pomocą specjalistycznych elektrod platynowych typu kleszczykowego (długość cyklu interwału 50 ms, przerwa 950 ms).
		<ol>
			<li>Użyj elektrody 0,5 mm.</li>
			<li>Użyj 33 V.</li>
			<li>Umieść środek elektrod na poziomie zawiązków ucha.</li>
			<li>Aby transfekować jądro przegrody bocznej, użyj kątów od 100 do 170 °, aby transfekować prążkowie 170-240 ° (ryc. 2C).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeprowadzić zabieg po elektroporacji/pielęgnacji pooperacyjnej zgodnie z opisem w punkcie 1.4. Złożyć ofiary myszy i przeanalizować zarodki 6 dni po elektroporacji (E18), jak opisano w punkcie 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja wzgórza i podwzgórza (ryc. 2D, tabela 1)
	<ol>
		<li>Wykonać zabieg chirurgiczny zgodnie z opisem w punkcie 1.2. Do elektroporacji in utero wzgórza i podwzgórza należy użyć zarodków E12-E13.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1-1,5 μl roztworu DNA zawierającego 4 μg DNA do komory bocznej (lewej lub prawej) przez przygotowane naczynia włosowate borokrzemianowe. Odczekaj 2-3 minuty, aż roztwór rozleje się do trzeciej komory. Alternatywnie wstrzyknąć bezpośrednio do trzeciej komory. 
		Uwaga: Zwiększa to specyficzność, ale może powodować zmniejszenie przeżywalności (wysokie ryzyko uszkodzenia).</li>
		<li>Przyłóż napięcie za pomocą specjalistycznych elektrod platynowych typu kleszczykowego (długość cyklu interwału 50 ms, przerwa 950 ms).
		<ol>
			<li>Użyj elektrody 0,5 lub 3 mm.</li>
			<li>Użyj napięcia w zakresie 33-35 V.</li>
			<li>Umieść środek elektrod tuż za zawiązkami ucha.</li>
			<li>Aby transfekować wzgórze, użyj kątów od 25-40°, aby transfekować podwzgórze 90-180° (ryc. 2D).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeprowadzić zabieg po elektroporacji/pielęgnacji pooperacyjnej zgodnie z opisem w punkcie 1.4. Złożyć ofiary myszy i przeanalizować zarodki 6 dni po elektroporacji (E18), jak opisano w punkcie 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Fiksacja perfuzji
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Podgrzać 4% paraformaldehydu (PFA) do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Napełnić strzykawkę o pojemności 50 ml PBS (4 °C), a drugą strzykawkę podgrzanym PFA. Unikaj bąbelków.</li>
		<li>Podłączyć strzykawki do trójdrogowego zaworu odcinającego. Podłącz trzeci koniec do skrzydlatego zestawu do infuzji (motyla).</li>
		<li>Przepłukać zestaw do infuzji skrzydełkowej PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzji
	<ol>
		<li>Myszy (w ciąży lub po porodzie przetoczone) należy głęboko znieczulić podskórnym chlorowodorkiem ketaminy (60 mg/kg) i ksylazyną (7,5 mg/kg).</li>
		<li>Potwierdź etap tolerancji chirurgicznej poprzez brak reakcji na szczypanie palca.</li>
		<li>Otwórz jamę brzuszną tuż pod klatką piersiową.</li>
		<li>Ostrożnie przeciąć membranę.</li>
		<li>Ostrożnie otwórz klatkę piersiową przez nacięcie w każdym miejscu aż do obojczyka.</li>
		<li>Włóż końcówkę motyla do lewej komory serca (zaczynając od wierzchołka serca).</li>
		<li>Przeciąć uszek lewego przedsionka.</li>
		<li>Powoli ukrwić mysz PBS (około 10 ml).</li>
		<li>Przełączyć zawór trójdrogowy.</li>
		<li>Przepłucz mysz 5-10 ml 4% PFA.</li>
		<li>Odetnij głowę myszy za pomocą nożyczek i wypreparuj mózg, zaczynając od otworu wielkiego. Wykonaj sekcję zgodnie z wcześniejszymi publikacjami 16.</li>
		<li>Postfiksuj mózg przez 2 dni w 4% PFA. Utrzymuj mózg w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Generowanie przekrojów 70 μm (np. za pomocą wibratomu).</li>
	<li>Opcjonalnie: Wzmocnij fluorescencję za pomocą barwienia przeciwciałami.
	<ol>
		<li>Zablokuj skrawki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (0,1-0,2% Triton X-100, 5% normalna surowica kozia)</li>
		<li>Inkubować O/N z odpowiednim przeciwciałem (anty-GFP, 1:1,000)</li>
		<li>Przemyć 3-5 razy 0,1 M buforem fosforanowym.</li>
		<li>Inkubować 3-5 godzin z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorescencją (Alexa Fluor 488 sprzężone anty-królicze IgG, 1:1,000).</li>
		<li>Opcjonalnie: barwienie przeciwstawne 4-6-diaminodino-2-fenyloindolem (DAPI, 0,2 g/ml w 0,1 M buforze fosforanowym) przez 1 min.</li>
		<li>Analizuj fluorescencję za pomocą odpowiedniego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).</li>
<li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+generation%2C+migration%2C+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).</li>
<li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li>
<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22FNMOL%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> FNMOL. 4 (November), 37(2011).</li>
<li>Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted-in-schizophrenia-1+%28Disc1%29+is+necessary+for+migration+of+the+pyramidal+neurons+during+mouse+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Hu+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development.</a> Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).</li>
<li>Niwa, M., Kamiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+DISC1+by+In+Utero+Gene+Transfer+Disturbs+Postnatal+Dopaminergic+Maturation+in+the+Frontal+Cortex+and+Leads+to+Adult+Behavioral+Deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits.</a> Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).</li>
<li>Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+ventral+forebrain+cells+migrate+to+the+cortex+and+contribute+to+the+generation+of+cortical+myelinating+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes.</a> Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).</li>
<li>Baumgart, J., Grebe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C57BL%2F6-specific+conditions+for+efficient+in+utero+electroporation+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system.</a> J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> JoVE. (54), (2011).</li>
<li>Guedel, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuedel%2C+AE+%22Inhalation+anesthesia%3A+a+fundamental+guide%22">Inhalation anesthesia: a fundamental guide</a>. , Macmillan. New York. (1937).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mizutani, K., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitors+resume+generating+neurons+after+temporary+inhibition+of+neurogenesis+by+Notch+activation+in+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex.</a> Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%2C+Growth+%26+Differ%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje szczegółowo, jak transfekować korę zaśledzionową, korę ruchową, korę somatosensoryczną, korę gruszkowatą, róg amonialny 1-3, zakręt zębaty, prążkowie, jądro przegrody bocznej, wzgórze i podwzgórze myszy C75BL / 6. Ze wszystkimi dostarczonymi informacjami jest to pierwszy protokół, który dostarcza wszystkich niezbędnych informacji do łatwego odtworzenia transfekcji tych obszarów mózgu w myszy C57BL/6. Poprzednie publikacje koncentrowały się głównie na kilku konkretnych regionach, dlatego szczegółowe i...

Od pierwszego opisu w 2001 roku przez trzy niezależne grupy 1-3, elektroporacja stała się powszechnie używanym standardowym narzędziem do analizy ekspresji genów w ośrodkowym układzie nerwowym gryzoni. W porównaniu z generacją myszy z nokautem, która, pomimo ciągłego ulepszania technik, nadal jest czasochłonna i kosztowna, elektroporacja in utero przemawia swoją prostotą. Tak więc elektroporacja in utero umożliwia szybkie i skuteczne badania przyrostu i utraty funkcji 4.
Aby transfekować obszary mózgu, roztwór zawierający ujemnie naładowany plazmid jest wstrzykiwany do komory. Podczas impulsu elektrycznego ujemnie naładowane DNA migruje w kierunku bieguna dodatniego, a zatem transfekowany obszar można wybrać po prostu zmieniając położenie bieguna dodatniego. Często wykazano, że wiele obszarów ośrodkowego układu nerwowego może być ukierunkowanych na 3,5-8. Na przykład ostatnie badania pokazują specyficzne transfekcje hipokampa, kory gruszkowatej lub prążkowia 9-11. Jednak informacje o odpowiednich pozycjach są często słabo ustandaryzowane i nie zawsze łatwo je przenieść na różne szczepy myszy.
Transfekcja pewnych etapów embrionalnych jest daleka od trywialnej. Przy wyborze zestawu do specyficznej elektroporacji in utero należy wziąć pod uwagę wiele czynników. Po pierwsze, aby optymalnie transfekować poszczególne stadia zarodkowe, potrzebna jest wiedza na temat odpowiednich napięć. Wysokie napięcia zmniejszają przeżywalność, podczas gdy niskie napięcia zmniejszają wydajność transfekcji 2,3,12. Również rozmiar łopatki elektrody odgrywa kluczową rolę, ponieważ użycie zbyt dużych łopatek elektrod powoduje zmniejszenie swoistości lub może spowodować śmierć z powodu zaburzenia rytmu serca 4,12,13. Przyłożone napięcie oraz rozmiar i położenie łopatki elektrody są najważniejszymi cechami, które należy wziąć pod uwagę, ale istnieją również inne czynniki wpływające na wynik elektroporacji, takie jak zastosowana ilość roztworu DNA.
Opracowaliśmy szczegółowy protokół, który umożliwia szybką i efektywną transfekcję różnych obszarów mózgu myszy C57BL/6 12. W tym protokole podano szczegółowe informacje na temat napięć, które mają być używane, oraz rozmiaru łopatki elektrody w celu zwiększenia specyficzności. Ponadto podawane są informacje o komorze, która ma być wypełniona, wraz z zaleceniami dotyczącymi ilości roztworu plazmidu i położenia elektrody. Wskazanie szczegółowych informacji o położeniu na mapie i dalsza wizualizacja tych pozycji umożliwia prostą, specyficzną i wydajną elektroporację in utero kory zaśledzionowej, kory ruchowej, kory somatosensorycznej, kory gruszkowatej, rogu amonu 1-3, zakrętu zębatego, prążkowia, jądra przegrody bocznej, wzgórza i podwzgórza.

<table><tbody><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Roth</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>Kapilary</td> ze szkła borokrzemianowego Addgene <td></td><td></td></tr><tr><td>(średnica 0,8-0,9 mm)</td> <td>Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Forene)</td><td>Abbott</td><td>PZN 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>numer zgody: 400684.00.00</td><td></td></tr><tr><td>maść do oczu (Bepanthen Augen und Nasensalbe)</td><td>Bayer&nbsp;</td><td>PZN 01578681</td><td></td></tr><tr><td>0,9% alkohol benzylowy 0,9% roztwór soli</td><td>Apteka Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Moguncji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gaza (ES-Kompressen)</td><td>Hartmann</td><td>407835</td><td></td></tr><tr><td>sterylny 5-0 Perma-Hand Jedwabny</td> szew <td>Ethicon Johnson & Kleszcze</td> pierścieniowe Johnson <td>K890H</td><td></td></tr><tr><td>1/ 1,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11101-09</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze pierścieniowe 4,8/ 6 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze pierścieniowe 2,2/ 3 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson-ząbkowane, proste 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>IrisNożyczki-Delikatne, Proste-Ostre/ Blunt 10 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Mayo-Stille Nożyczki-Proste 15 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14012-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo NeedleHolder-z zamkiem-Węglik wolframu 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator CUY21 SC&nbsp;</td><td>Nepa Gene Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FST 250 Sterylizator gorących koralików</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszlifierka EG-44</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 Ściągacz Micropette</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody platynowe 650P 0,5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P0,5</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody platynowe 650P 3 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P3</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody platynowe 650P 5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody platynowe 650P 10 mm</td><td></td> System anestezjologiczny <td>Nepagene</td> CUY650P10 <td></td></tr><tr><td></td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>CV-30511-3 Vapor 19.3</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury 220V AC</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr></tbody></table>

kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy c57bl/6

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Elektroporacja in utero jest szeroko stosowaną techniką szybkiej i efektywnej czasoprzestrzennej manipulacji różnymi genami w ośrodkowym układzie nerwowym gryzoni. Nadekspresja pożądanych genów jest tak samo możliwa, jak badania nad utratą funkcji za pośrednictwem shRNA. Dzięki temu oferuje szeroki zakres zastosowań. Możliwość celowania w poszczególne komórki na określonym obszarze dodatkowo zwiększa zakres potencjalnych zastosowań tej bardzo przydatnej metody. Do skutecznego celowania w określone regiony niezbędna jest wiedza na temat subtelności, takich jak stadium embrionalne, napięcie, które należy przyłożyć, a co najważniejsze, położenie elektrod.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół, który pozwala na specyficzną i efektywną elektroporację in utero kilku regionów ośrodkowego układu nerwowego myszy C57BL/6. W szczególności pokazano, jak transfekować regiony, które rozwijają się w korę zaśledzionową, korę ruchową, korę somatosensoryczną, korę gruszkowatą, rogówkę amonialną 1-3, zakręt zębaty, prążkowie, jądro przegrody bocznej, wzgórze i podwzgórze. W celu uzyskania informacji o odpowiednim stadium zarodkowym podaje się odpowiednie napięcie dla odpowiedniego stadium zarodkowego. Co najważniejsze, przedstawiona jest mapa kątów, która wskazuje odpowiednie położenie bieguna dodatniego. Ten ustandaryzowany protokół ułatwia skuteczną elektroporację w macicy, co może również prowadzić do zmniejszenia liczby zwierząt.

Rycina 2 przedstawia przykłady specyficznej elektroporacji in utero obszarów rozwijających się w korę retrosplenialną, korę ruchową, korę somatosensoryczną, korę piriformową, pole CA1-3, zakręt zębaty, prążkowie, jądro przegrody bocznej, wzgórze i podwzgórze. Wyniki transfekcji przedstawiono obok zalecanego kąta (Rycina 2). Dla lepszej wizualizacji kątów in vivo na embrionie pokazano również pozycję elektrody (0,5 mm) (Rycina 5, embrion in utero</em...

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Ogólnym celem tej manipulacji komórkowej in vivo jest specyficzna modyfikacja komórek w określonych obszarach ośrodkowego układu nerwowego myszy, takich jak kora mózgu, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej oraz prążkowie. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwoju i funkcji mózgu, na przykład poprzez identyfikację różnych kaskad sygnalizacyjnych i określenie stopnia różnicowania komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na szybką i efektywną manipulację różnymi typami komórek w ośrodkowym układzie nerwowym bez czasochłonnego procesu tworzenia genetycznie zmodyfikowanych myszy.Zasadniczo demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ osoby rozpoczynające pracę z tą techniką często mają trudności z ustaleniem właściwej pozycji elektrod, co jest kluczowe dla specyficznej elektroporacji. Aby rozpocząć tę procedurę, należy skalpelem rozciąć jamę brzuszną znieczulonej ciężarnej myszy. Aby zapobiec wysychaniu otwartej jamy brzusznej, należy nawilżyć ją ciepłym 0,9% roztworem soli fizjologicznej z dodatkiem alkoholu metylowego.Następnie ostrożnie wyekstrahuj rogi macicy za pomocą kleszczy pierścieniowych. Dalej, ustaw embrion E14 w taki sposób, aby powyżej miejsca nakłucia nie było widocznych naczyń. W celu lepszej wizualizacji użyj elektrody 5 mm, aby zlokalizować kąt i położenie pożądanego obszaru w mózgu do transfekcji.W celu przeprowadzenia elektroporacji in utero obszaru kory, powoli wstrzyknij od 1.5 do 2 µL roztworu DNA do lewej komory bocznej. Upewnij się, że głębokość wprowadzenia wynosi od 1 do 2 mm, mierzona od ściany macicy. Następnie sprawdź, czy występuje niebiesko-zielone zabarwienie z wyraźną linią demarkacyjną.W celu lepszej wizualizacji należy użyć elektrody 5-milimetrowej, aby określić kąt i pozycję pożądanego miejsca w mózgu do transfekcji. Następnie należy umieścić środek 3-milimetrowych platynowych łopatek elektrody tuż przed przedsionkami usznymi, upewniając się, że nie znajdują się one nad naczyniami krwionośnymi ani łożyskiem. Następnie należy przyłożyć napięcie, aby rozpocząć transfekcję.W celu przeprowadzenia elektroporacji in utero formacji hipokampa, wstrzyknij 2 µL roztworu DNA do prawego komory bocznej embrionu w 15. dniu rozwoju (E15). Następnie umieść ujemny biegun platynowych elektrod płaskich o rozmiarze od 3 do 5 mm bezpośrednio przed zrazem usznym, a biegun dodatni w środkowej części zrazu usznego. Po tym przyłóż napięcie, aby rozpocząć transfekcję.W celu przeprowadzenia elektroporacji in utero jądra przegrody bocznej i prążkowia, wstrzyknij 1 µL roztworu DNA do prawego brzuszka bocznego zarodka w stadium E12. Następnie umieść elektrody o długości 5 mm na poziomie pierwotnych struktur ucha. Po tym czasie przyłóż napięcie, aby rozpocząć transfekcję.W celu przeprowadzenia elektroporacji in utero wzgórza oraz podwzgórza, wstrzyknij od 1 do 1,5 µL roztworu DNA do komory bocznej zarodka w stadium E12–E13. Następnie odczekaj od dwóch do trzech minut, aby roztwór mógł przedostać się do trzeciej komory. Następnie umieść elektrody o średnicy 5 lub 3 mm bezpośrednio za prymordiami małżowin usznych.Następnie przyłóż napięcie, aby rozpocząć transfekcję. Ten schemat przedstawia odpowiednie położenie bieguna dodatniego i ujemnego dla transfekcji obszarów kory mózgowej. A ten pokazuje położenie bieguna dodatniego i ujemnego dla transfekcji struktur hipokampa.Pozycje bieguna dodatniego i ujemnego dla transfekcji prążkowia oraz jądra przegrody bocznej przedstawiono tutaj. Odpowiednie pozycje elektrod do transfekcji wzgórza i podwzgórza pokazano tutaj. Specyficzność transfekcji zależy od rozmiaru elektrody.Zwiększenie rozmiaru elektrod zmniejsza specyficzność transfekcji. Jest to szczególnie zauważalne we wczesnych stadiach embrionalnych, ale widoczne również w późniejszych stadiach embrionalnych. Po opanowaniu technika ta, przy prawidłowym wykonaniu, może zająć 15 minut.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się z embrionami i matkami z dużą ostrożnością. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić transfekcję konkretnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego u myszy Black 6.

cortex-hippocampus-thalamus-hypothalamus-lateral-septal-nucleus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Połączenie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i transdukcji in utero jest potężnym podejściem do badania zmian morfologicznych w ultrastrukturze układu nerwowego podczas rozwoju. Ta połączona metoda pozwala na dogłębny wgląd w zmiany w szczegółach strukturalnych leżących u podstaw neuroplastyczności w odniesieniu do ich reprezentacji topograficznej.

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Poznaj technikę in utero elektroporacji do modyfikacji komórek w korze mózgowej, hipokampie, wzgórzu i podwzgórzu myszy C57BL/6. Ta metoda umożliwia szybkie badanie rozwoju mózgu bez konieczności generowania genetycznie zmodyfikowanych zwierząt.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6 (Wideo) | JoVE Journal

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Przeglądaj więcej filmów