Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Ogólnym celem tej manipulacji komórkami in vivo jest specyficzna modyfikacja komórek określonych regionów w ośrodkowym układzie nerwowym kory myszy, hipokampa, wzgórza, podwzgórza, jądra przegrody bocznej i prążkowia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju i funkcji mózgu, na przykład poprzez identyfikację różnych kaskad sygnałowych i określenie poziomu różnicowania komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na szybką i skuteczną manipulację różnymi typami komórek w ośrodkowym układzie nerwowym bez czasochłonnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Ogólnie rzecz biorąc, demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, często mają trudności ze znalezieniem właściwej pozycji elektrody, co ma kluczowe znaczenie dla określonej elektroporacji. Aby rozpocząć tę procedurę, rozetnij jamę brzuszną znieczulonej ciężarnej myszy skalpelem. Zapobiegaj wysuszeniu otwartej jamy brzusznej, zwilżając ją 0,9% ciepłym roztworem soli fizjologicznej alkoholu metylowego.

Następnie ostrożnie usuń rogi macicy za pomocą kleszczy pierścieniowych. Następnie należy umieścić zarodek E14 tak, aby nad miejscem nakłucia nie było widocznych naczyń. Aby uzyskać lepszą wizualizację, użyj 5-milimetrowej elektrody, aby zlokalizować kąt i położenie pożądanego obszaru w mózgu do transfekcji.

W celu elektroporacji in utero obszaru korowego powoli wstrzyknij od 1,5 do dwóch mikrolitrów roztworu DNA do lewej bocznej komory. I upewnij się, że głębokość wsunięcia wynosi od jednego do dwóch milimetrów, mierząc od ściany macicy. Następnie sprawdź, czy ma niebiesko-zielone zabarwienie z ostrym rozgraniczeniem.

Aby uzyskać lepszą wizualizację, użyj 5-milimetrowej elektrody, aby zlokalizować kąt i pozycję pożądanego miejsca w mózgu do transfekcji. Następnie umieść środek trzymilimetrowych platynowych elektrod tuż przed zawiązkami ucha i upewnij się, że nie są one umieszczone nad naczyniami lub łożyskiem. Następnie przyłóż napięcie, aby rozpocząć transfekcję.

W celu elektroporacji in utero tworzenia się hipokampa wstrzyknąć dwa mikrolitry roztworu DNA do prawej bocznej komory zarodka E15. Następnie umieść biegun ujemny łopatek elektrod platynowych o średnicy od trzech do pięciu milimetrów tuż przed zawiązkiem ucha, a biegun dodatni na środku zawiązka ucha. Następnie przyłóż napięcie, aby rozpocząć transfekcję.

W celu elektroporacji in utero jądra przegrody bocznej i prążkowia wstrzyknąć jeden mikrolitr roztworu DNA do prawej bocznej komory zarodka E12. Następnie umieść 5-milimetrowe elektrody na poziomie zawiązków ucha. Następnie przyłóż napięcie, aby rozpocząć transfekcję.

W celu elektroporacji in utero wzgórza i podwzgórza wstrzyknąć od jednego do 1,5 mikrolitra roztworu DNA do bocznej komory zarodka od E12 do E13. Następnie odczekaj dwie do trzech minut, aż roztwór dyfunduje do trzeciej komory. Następnie umieść 5 lub trzymilimetrowe elektrody tuż za zawiązkami ucha.

Następnie przyłóż napięcie, aby rozpocząć transfekcję. Ten schemat pokazuje odpowiednie pozycje dla dodatnich i ujemnych biegunów dla transfekujących obszarów korowych. A ten pokazuje pozycje dodatniego i ujemnego bieguna do transfekcji formacji hipokampa.

Pokazano tutaj pozycje dodatniego i ujemnego bieguna transfekcji prążkowia i jądra przegrody bocznej. Pokazano tutaj odpowiednie pozycje elektrod do transfekcji wzgórza i podwzgórza. Specyfika transfekcji zależy od wielkości elektrody.

Zwiększenie rozmiaru łopatki elektrody zmniejsza specyfikę transfekcji. Jest to szczególnie widoczne w młodszych stadiach embrionalnych, ale także widoczne w późnych stadiach embrionalnych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się z zarodkami i matkami z dużą ostrożnością. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak transfekować określone regiony w ośrodkowym układzie nerwowym myszy Black 6.