Name: Prosta alternatywa dla wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu specyficznego dla mózgu knockdownu miRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metodę dostarczania antagomirów do mózgu za pomocą peptydu neurotropowego u myszy. Technika ta umożliwia specyficzny knockdown mikroRNA, omijając barierę krew-mózg i ułatwiając badanie neurodegeneracji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Souvik Maiti za pomoc w projektowaniu antagomirów. Dziękujemy również Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey i Bijay Pattnaik za ich pomoc w metodach eksperymentalnych. Prace te zostały sfinansowane przez Radę Badań Naukowych i Przemysłowych (BSC0123). HS, MV i RR potwierdzają stypendium Rady Badań Naukowych i Przemysłowych w Indiach. MAS potwierdza stypendium Komisji ds. Grantów Uniwersyteckich w Indiach.

Uwaga: Wszystkie procedury, w tym zwierzęta badane, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt (IAEC) w Instytucie Genomiki i Biologii Integracyjnej w New Delhi (IGIB/AEC/10/2013). Protokół ten jest specjalnie dostosowany do celowanego dostarczania Antagomiru-29 do mózgu i knockdown miR-29.
1. Strategia projektowania Antagomiru
<ol>
	<li>Pobierz dojrzałą sekwencję miRNA z miRBazy11 (<a href="http://www.mirbase.org/">http://www.mirbase.org/</a>).</li>
	<li>Pobierz sekwencje powiązanych członków rodziny miRNA za pomocą linku "Rodzina genów" w rekordzie miRBazy 
	(<a href="http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009">http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009</a> ).</li>
	<li>Odwrotne uzupełnienie sekwencji: <a href="http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html">http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html</a> zapewnia wygodne narzędzie do odwracania sekwencji dopełnienia.</li>
	<li>Oznacz pozycje, które mają zostać zmodyfikowane przez LNA, korzystając z następujących wskazówek:
	<ol>
		<li>Wybierz reszty tyminy umieszczone w odległości 3-4 zasad od siebie do modyfikacji LNA, ponieważ pirymidyny LNA są bardziej stabilne niż puryny12.</li>
		<li>Wybierz reszty cytozyny oddzielone 3-4 resztami, jeśli poprzedni krok daje mniej niż pięć modyfikacji.</li>
		<li>Nadaj priorytet pięciu modyfikacjom do końca 5' antagomiru, ponieważ pozwala to uniknąć sekwencji zasiewu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Preparat kompleksu Antagomir-neuropeptyd
Uwaga: Jest to najbardziej krytyczny krok w protokole i wymaga standaryzacji. Aby ustandaryzować protokół, zamiast antagonukleotydu9 można użyć dowolnego fluorescencyjnie znakowanego oligonukleotydu (FLO). Peptydy powinny mieć wysoką czystość (stopień HPLC, czystość 98%). Sekwencje i ładunek peptydu i antagomiru podano w tabeli 1.
<ol>
	<li>Zdecyduj o liczbie pieprzyków antagomiru do wstrzyknięcia na podstawie ładunku molowego na antagomirze, jego toksyczności i wagi myszy. Obliczyć liczbę moli peptydu do wstrzyknięcia na podstawie stosunku ładunku molowego antagomiru : peptide. 
	UWAGA: Standaryzuj stosunek ładunku molowego antagomiru : peptydu pod kątem toksyczności i skutecznego dostarczania do mózgu myszy. Do standaryzacji należy stosować różne współczynniki ładunków molowych znakowanego fluorescencyjnie oligonukleotydu: peptydu. Odkryliśmy, że zarówno Antagomir-29, jak i grupa kontrolna były toksyczne przy 4 mikrogramach/gram masy ciała myszy. Antagomir-29 i grupa kontrolna były używane przy 2 mikrogramach/gramach masy ciała, ale to skuteczne stężenie prawdopodobnie będzie się różnić dla każdego mikroRNA.</li>
	<li>Rozcieńczyć peptyd i antagomir w oddzielnych probówkach do mikrofuge z roztworów podstawowych sterylną 10% D-glukozą do pożądanego stężenia końcowego, jak obliczono w kroku 1.</li>
	<li>Trzymaj probówkę do mikrofuge z roztworem peptydów na wirze z umiarkowaną prędkością wirowania.</li>
	<li>Dodaj 1/3 roztworu antagomiru do probówki z roztworem peptydu, powoli, kroplami, podczas gdy dokładnie miesza się go w mieszalniku wirowym.</li>
	<li>Kontynuuj mieszanie roztworów na wirze przez następne 1 minutę, a następnie pozostaw mieszaninę na 1 minutę.</li>
	<li>Powtórz kroki 4 i 5 jeszcze dwa razy, aby wymieszać pozostały roztwór antagomiru z roztworem peptydu w tej samej probówce do mikrofuge. Powolne dodawanie ma kluczowe znaczenie dla tworzenia kompleksów monodyspersyjnych, które są skuteczne w transfekcji. Szybkie dodawanie może prowadzić do agregacji kompleksów i ich wytrącania.</li>
	<li>Inkubować kompleks przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez wirowania. W tym czasie inkubacji zaaklimatyzuj myszy do laboratorium, w którym zostaną wykonane zastrzyki.</li>
</ol>
3. Iniekcja do żyły ogonowej kompleksu Antagomir-neuropeptyd
<ol>
	<li>Aby unieruchomić zwierzę, umieść mysz w uwięzi lub decapicone o odpowiedniej wielkości.</li>
	<li>Oczyść powierzchnię ogona za pomocą bawełnianego wacika nasączonego ciepłą wodą (około 40°C). Będzie to sprzyjać rozszerzeniu naczyń krwionośnych i zwiększy widoczność żyły.</li>
	<li>Zbliżyć się do ogona ze strzykawką insulinową o małej objętości (0,5 – 1,0 cm3) pod kątem 15-20°. Należy uważać, aby nie wprowadzić powietrza do strzykawki. Zacznij od dystalnej części ogona. Wstrzyknąć kompleks. Wyjąć igłę i przyłożyć wacik antyseptyczny bezpośrednio do miejsca wstrzyknięcia (około 5-10 sekund), aby zatrzymać krwawienie.</li>
	<li>Umieść mysz w indywidualnie wentylowanej klatce w grupie 3-5 sztuk, z kolbą kukurydzy i bibułą jako wzbogaceniem. Nie należy trzymać myszy bez wstrzyknięć i myszy z wstrzyknięciami w tej samej klatce.</li>
</ol>
4. Testy behawioralne
Uwaga: Zachowaj odstęp 3-4 godzin między wstrzyknięciem a testami behawioralnymi, aby umożliwić powrót do zdrowia po wstrzyknięciu. Przenieś mysz do cichego pokoju. Nie przeszkadzaj zwierzętom w tym okresie aklimatyzacji.
<ol>
	<li>Zaaklimatyzuj mysz w nowym pomieszczeniu przez 30 minut, a następnie rozpocznij następujące testy behawioralne. Zachowaj 10-minutową przerwę między każdym testem behawioralnym.</li>
	<li>Zapięcie kończyn tylnych: 
	UWAGA: Ten test wskazuje na dysfunkcję motoryczną i upośledzenie neurologiczne.
	<ol>
		<li>Delikatnie podnieś mysz, przytrzymując ją w pobliżu podstawy ogona na czystym tle.</li>
		<li>Sprawdź pozycję tylnych kończyn przez 10-15 sekund. Mysz typu dzikiego odchyla tylne kończyny od brzucha, podczas gdy mysz ataksyjna ma tendencję do cofania jednej lub obu tylnych kończyn w kierunku brzucha przez ponad 50% czasu zawieszonego13.</li>
		<li>Umieść mysz z powrotem w klatce</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test półki:
	<ol>
		<li>Delikatnie podnieś mysz, trzymając ogon i trzymaj ją na półce klatki.</li>
		<li>Obserwuj mysz szczególnie w rogu klatki. Mysz typu wild może z łatwością pokonywać rogi bez strachu i utraty równowagi. Ataksyjna mysz traci równowagę, zastyga lub trzęsie się podczas chodzenia po półce klatki i na rogach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test odcisku stopy myszy: 
	UWAGA: Do tego testu należy przygotować arkusz chłonny na podłodze wąskiego pasa startowego (~70 cm długości, ~5 cm szerokości ze ściankami o wysokości ~5 cm).
	<ol>
		<li>Chwyć delikatnie mysz jedną ręką i nałóż tusz na tylne kończyny za pomocą pędzla.</li>
		<li>Umieść arkusz chłonny na podłodze wąskiego pasa startowego.</li>
		<li>Pozwól myszy chodzić lub przebiegać po chłonnym arkuszu w linii prostej na pasie startowym od jednego końca do drugiego.</li>
		<li>Powtórz ten proces jeszcze dwa razy z każdą myszką, używając świeżego arkusza chłonnego.</li>
		<li>Zmierz odległość między dwoma kolejnymi krokami w ruchu do przodu. Nie uwzględniaj odpowiednio pierwszych i ostatnich kilku śladów stóp, w których zwierzę dopiero rozpoczyna i kończy swój bieg.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+novel+therapeutic+targets+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases.</a> Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).</li>
<li>Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA%3A+Implications+for+Alzheimer+Disease+and+other+Human+CNS+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders.</a> Current Genomics. 10, 154-168 (2009).</li>
<li>Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+Disease+and+Potential+Therapeutic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications.</a> Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).</li>
<li>Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Promise+of+MicroRNA+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">The Promise of MicroRNA Replacement Therapy.</a> Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).</li>
<li>Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+microRNA+function+by+antimiR+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Silence%22%5BJournal%5D)">Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides.</a> Silence. 3, 1-17 (2012).</li>
<li>Trang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Delivery+of+Tumor+Suppressor+microRNA+Mimics+Using+a+Neutral+Lipid+Emulsion+Inhibits+Lung+Tumors+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice.</a> Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).</li>
<li>Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotactic+Injection+of+MicroRNA-expressing+Lentiviruses+to+the+Mouse+Hippocampus+CA1+Region+and+Assessment+of+the+Behavioral+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome.</a> J Vis Exp. (76), e50170(2013).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448, 39-43 (2007).</li>
<li>Roshan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-specific+knockdown+of+miR-29+results+in+neuronal+cell+death+and+ataxia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice.</a> RNA. 20, 1287-1297 (2014).</li>
<li>Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+DNA%E2%88%92RNA+Heteroduplex+Formation%3A+Effects+of+Locked+Nucleic+Acid+Nucleotides+Incorporated+into+the+DNA+Strand%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand.</a> Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).</li>
<li>Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+Chemistry+and+Therapeutic+Applications+of+Locked+Nucleic+Acid+%28LNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA).</a> Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).</li>
<li>Guyenet, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Composite+Phenotype+Scoring+System+for+Evaluating+Mouse+Models+of+Cerebellar+Ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia.</a> J. Vis. Exp. (39), (2010).</li>
<li>Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+Approaches+for+Neuronal+Delivery+of+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids.</a> Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).</li>
<li>Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Penetrating+Peptide-Mediated+Therapeutic+Molecule+Delivery+into+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System.</a> Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).</li>
<li>Hwang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brain-targeted+rabies+virus+glycoprotein-disulfide+linked+PEI+nanocarrier+for+delivery+of+neurogenic+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA.</a> Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj pokazujemy szeroko dostępną metodologię badania skutków modulacji miRNA. Obecnie większość prób scharakteryzowania in vivo funkcji miRNA polega na stworzeniu myszy z nokautem lub transgenu, który ulega ekspresji gąbki miRNA. Większość miRNA, nawet tych specyficznych dla typu komórki, ulega ekspresji w więcej niż jednym narządzie. Na przykład miRNA, początkowo uważane za specyficzne dla układu krwiotwórczego, ulegają również ekspresji w mózgu ze względu na obecność mikrogleju. Tak więc nawet specyficzna...

MikroRNA stały się nowymi celami terapeutycznymi ze względu na ich uniwersalną rolę w regulacji ekspresji genów i bezpośrednie dowody na udział w chorobie. MiRNA są aktywnie badane pod kątem ich potencjału jako celów terapeutycznych1,2. Co więcej, zmiany w ekspresji miRNA są związane z kilkoma chorobami3, a symulacja tych zmian poprzez sztuczne zakłócenia ekspresji miRNA może być wykorzystana do badania szlaków komórkowych zaangażowanych w manifestację choroby. Specyficzne tkankowo dostarczanie leków ukierunkowanych na miRNA jest obecnie głównym wyzwaniem dla opracowywania leków opartych na miRNA. Antagomiry i mimiki miRNA są obiecującymi środkami do zaburzania poziomów miRNA4-6. Jednak specjalne cechy, które zwiększają ich specyficzność i skuteczność, muszą zostać włączone do projektu antagomirów, zanim będą mogły być wykorzystane do zaburzeń ekspresji miRNA in vivo.
MikroRNA są szczególnie istotne jako cele w obecnie nieuleczalnych chorobach neurodegeneracyjnych i neurorozwojowych. Bariera krew-mózg stanowi ograniczenie w dostarczaniu antagomirów do mózgu. Iniekcje stereotaktyczne są szeroko stosowane w modelach gryzoni w celu dostarczania cząsteczek do określonych miejsc w mózgu7. Wymaga to umiejętności, rozległych inwestycji w oprzyrządowanie i czasu. Iniekcje stereotaktyczne są inwazyjne, wiążą się z operacją, powodują co najmniej niewielkie obrażenia i są ograniczone do dostarczania miejscowego. Zastosowanie peptydów penetrujących komórki z preferencją do celowania w neurony może przeciwdziałać tym ograniczeniom, ponieważ mogą one być dostarczane drogą przeznaczyniową, ale naruszają barierę krew-mózg. Taki peptyd pochodzący z glikoproteiny wirusa wścieklizny (RVG) był wcześniej używany do dostarczania siRNA przeciwko wirusowi japońskiego zapalenia mózgu u myszy8. Odkryliśmy, że używając peptydu do dostarczania antagomiru, miRNA mogą być skutecznie powalone w mózgu myszy9.
Drugim dużym wyzwaniem związanym z knock-downem miRNA jest mały rozmiar miRNA i obecność blisko spokrewnionych izoform sekwencji. Weźmy przykład rodziny mmu-miR-29, która składa się z trzech blisko spokrewnionych izoform: miR-29a, b i c. Antagomiry są również na ogół modyfikowane wzdłuż kręgosłupa, aby zwiększyć ich stabilność i uczynić je odpornymi na atak nukleaz. Zablokowane kwasy nukleinowe (LNA) mają dodatkową zaletę, ponieważ zwiększają stabilność termiczną, a nawet prowadzą do degradacji celu poza przeszkodą steryczną10. Wprowadzanie modyfikacji wzdłuż całej sieci szkieletowej może być skuteczne, ale kosztowne. Wcześniej widzieliśmy, że modyfikacje przekraczające optymalną liczbę mogą nie zwiększać jeszcze bardziej skuteczności. Projekt antagomira zakłada zatem optymalną modyfikację antagomiru.
Aby niekowalencyjnie skompleksować antagomir z neurotropowym peptydem, stosuje się naładowane rozszerzenie hepta- do nona-argininy. Stosuje się reszty D-argininy, ponieważ zapewniają one większą stabilność, ponieważ nie są podatne na rozszczepienie przez proteazy. Rozciągnięcia hepta- do nona-argininy działają jako skuteczne środki penetrujące komórki, chociaż nie nadają specyficzności typu komórki. Poprzez kowalencyjne połączenie peptydu RVG z łącznikiem nona-argininy, wytworzono neurotropowy, penetrujący komórki peptyd. Dodatnio naładowane reszty peptydu oddziałują z ujemnie naładowanym szkieletem kwasu nukleinowego, tworząc kompleksy. Kompleksy te mogą być wykorzystywane do skutecznej transfekcji DNA lub RNA do hodowanych komórek oraz in vivo do tkanek.

<table><tbody><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Restrainer lub Decapicone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wąski pas startowy</td><td></td><td></td> <td>~ 70 cm długości, ~ 5 cm szerokości ze ścianami o wysokości ~ 5 cm.</td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy znakowane fluorescencyjnie (siGLO)</td><td>GE Healthcare Dharmacon INC</td><td>D0016300120</td><td></td></tr><tr><td>10% sterylna D-glukoza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antagomir-29</td><td>Niestandardowa synteza</td><td></td><td>Exiqon</td></tr><tr><td>Antagomir-control</td><td>Niestandardowa synteza</td><td></td><td>Exiqon</td></tr><tr><td>Neuropeptyd RVG</td><td>G.L.Biochem ( Szanghaj) Ltd.</td><td>niestandardowa synteza</td><td>>98% czystości</td></tr><tr><td>Neuropeptyd RVM</td><td>G.L.Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td>Niestandardowa synteza</td><td>>98% czystości</td></tr><tr><td>Inne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bawełna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciepła woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe Arkusze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>chłonne</td></tr><tr><td>Tusz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antyseptyczny</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

prosta alternatywa dla wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu specyficznego dla mózgu knockdownu mirna

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MikroRNA (miRNA) są kluczowymi regulatorami ekspresji genów. W mózgu procesy życiowe, takie jak rozwój neurologiczny i funkcje neuronalne, zależą od prawidłowej ekspresji mikroRNA. Perturbacja mikroRNA w mózgu może być wykorzystana do modelowania chorób neurodegeneracyjnych poprzez modulację śmierci komórek neuronalnych. Obecnie wstrzyknięcie stereotaktyczne jest stosowane do dostarczania środków knockdown miRNA do określonego miejsca w mózgu. W tym miejscu omawiamy strategie projektowania antagomirów przeciwko miRNA z modyfikacjami zablokowanych nukleotydów (LNA). Następnie opisz metodę specyficznego dla mózgu dostarczania antagomirów, równomiernie w różnych regionach mózgu. Metoda ta jest prosta i ma szerokie zastosowanie, ponieważ pozwala przezwyciężyć operację, związany z nią uraz i ograniczenie miejscowego dostarczania w iniekcjach stereotaktycznych. Przygotowaliśmy kompleks neurotropowego, penetrującego komórki peptydu glikoproteiny wirusa wścieklizny (RVG) z antagomirem przeciwko miRNA-29 i wstrzykiwanym przez żyłę ogonową, aby specyficznie dostarczyć do mózgu. Konstrukcja antagomiru zawierała cechy, które umożliwiają specyficzne celowanie w miRNA i tworzenie niekowalencyjnych kompleksów z peptydem. Knockdown miRNA w komórkach neuronalnych spowodował apoptozę śmierci komórki i związane z nią wady behawioralne. W związku z tym metoda może być stosowana w ostrych modelach neurodegeneracji poprzez zaburzenia miRNA.

Stosując przedstawioną tutaj procedurę, przygotowano kompleksy 50µg fluorescencyjnie znakowanego oligonukleotydu (FLO) i ~850µg peptydu RVG o molowym stosunku ładunku 1:15 (FLO : peptyd), które wstrzyknięto jednorazowo do żyły ogonowej. Jako kontrolę dostarczania wykorzystano kompleks nieneurotropowego peptydu białka macierzy wirusa wścieklizny (RVM) i FLO. Następnego dnia wyizolowano mózg i wątrobę myszy, a następnie przygotowano zawiesiny pojedynczych komórek. Komórki obserwowano pod mikroskopem pod kątem zielonej fluo...

MikroRNA odgrywają kluczową rolę w mózgu i są potencjalnymi celami do modelowania neurodegeneracji. Jednak zaburzanie poziomów miRNA jest trudne ze względu na krótką długość miRNA i niedostępność tkanki mózgowej. Ten film przedstawia metodę projektowania antagomiru i dostarczania specyficznego dla mózgu przy użyciu neuropeptydu u myszy.

Prosta alternatywa dla wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu specyficznego dla mózgu knockdownu miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie peptydy przenikającego przez błony komórkowe wraz z zmodyfikowanym oligonukleotydem antysensownym w celu specyficznego wyciszenia mikroRNA w mózgu myszy. Osiągnięto to poprzez zaprojektowanie anty-miRNA przeciwko May 29. W badaniu tym wykorzystaliśmy anty-miRNA u samców w celu ukierunkowania na mikroRNA z modyfikacjami kwasów nukleinowych typu lock.Oznacza to, że modyfikacje LNA zostały wprowadzone w pięciu różnych pozycjach. Wprowadzenie modyfikacji LNA zwiększa powinowactwo wiązania do mikroRNA. Dodatkowo zapewnia ono odporność na nukleazy, co zwiększa efektywność celowania w mikroRNA.Kompleksy ANTIGO MAR z peptydem przygotowano in vitro i wstrzyknięto myszom do żyły ogonowej. Wyciszenie mikroRNA doprowadziło do zmian behawioralnych, co sugeruje udział tego mikroRNA w ataksji; trzy kolejne iniekcje były wystarczające, aby wywołać zauważalną zmianę w chodu. Po zakończeniu leczenia pobrano tkankę mózgową i potwierdzono wyciszenie mikroRNA. CPP, czyli peptydy przenikające przez błony komórkowe, stały się w ostatnim czasie atrakcyjnymi nośnikami do dostarczania kwasów nukleinowych.W niniejszym badaniu wykorzystano jeden z takich bogatych w argininę peptydów neurotropowych, który może tworzyć kompleksy z LNA na zasadzie oddziaływań ładunkowych; po podaniu do krążenia ogólnoustrojowego peptyd ten dociera do wyznaczonego miejsca docelowego, którym w tym przypadku są komórki neuronalne, zapewniając prawidłowe uwolnienie LNA do wnętrza tych komórek. Sekwencje członków rodziny ME 29 pobrano z bazy mease, a 16 antysensownych MER zsyntetyzowano z modyfikacjami lock nucleic acid w pięciu równomiernie rozmieszczonych pozycjach w celu przygotowania kompleksów. Roztwory peptydów i antygo o odpowiednich stężeniach przygotowano oddzielnie w sterylnym 10% glucose.W warunkach aseptycznych roztwór Antigo dodawano powoli, kroplami, do roztworu peptydów przy łagodnym mieszaniu. Powolne dodawanie oraz delikatne mieszanie są kluczowe dla powstania monodyspersyjnych kompleksów o rozmiarach w skali tric.Antigo dodawano za każdym razem w trzech równych częściach, przeznaczając minutę na mieszanie, a następnie minutę na inkubację bez mieszania. Szybkie dodawanie może prowadzić do agregacji kompleksów i wytrącenia osadu. Kompleks Antigo jest teraz gotowy do wstrzyknięcia.Kompleks podano za pomocą wstrzyknięcia do żyły ogonowej. Myszy zwrócono do tej samej klatki. Testy behawioralne w kierunku ataksji przeprowadzano codziennie, trzy godziny po wstrzyknięciu.Myszą trzymano za ogon, nie pozwalając jej dotykać żadnych otaczających przedmiotów. Zwróć uwagę na sposób, w jaki kończyny tylne są rozstawione przez 10 sekund. W teście krawędziowym myszy musiały przejść wzdłuż cienkiej krawędzi klatki.Myszy przechodzą przez wąski kanał, pozostawiając ślady tuszem pokrytych tylnych łap na pasku grubego papieru chłonnego. Aby uniknąć błędnych danych pochodzących z czterech kończyn, zbadajmy efekt zastosowanej terapii. Wyizolowano mózg oraz inne tkanki od myszy leczonych i kontrolnych.Stwierdzono, że peptyd R VG dostarcza znakowane fluorescencyjnie siRNA specyficznie do mózgu, a nie do innych tkanek, takich jak wątroba. Kontrolny peptyd nieneurotropowy RVM dostarczył siRNA do wątroby. Myszy traktowane ANTIER 29 wykazywały wady kończyn tylnych.Myszy kontrolne traktowane anme o losowej sekwencji (scrambled) były w stanie pokonać krawędź, natomiast po zastosowaniu anme przeciwko MARE 29 u myszy zaobserwowano łagodne deficyty w tym teście. W teście śladów stóp (footprint Assay) odnotowano wyraźne skrócenie długości kroku u myszy traktowanych. Dodatkowo, za pomocą QR tpcr potwierdziliśmy obniżenie poziomu mid 29 A oraz mid 29 B w celu opracowania terapeutyków opartych na micro NNA.Specyficzne dostarczenie anty-mikroRNA do mózgu stanowi wyzwanie ze względu na barierę krew-mózg. Wykorzystując zaprezentowaną tutaj technikę, możemy uniknąć konwencjonalnych metod dostarczania anty-mikroRNA do mózgu. Metoda ta sprawia, że wyciszanie mikroRNA staje się technicznie wykonalne i zwiększa specyficzność tkankową.

a-simple-alternative-to-stereotactic-injection-for-brain-specific

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Źródło: Ullah, I., et.al. Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje precyzyjną technikę podawania donosowego w celu dostarczania ukierunkowanych na neurony kompleksów peptyd-siRNA do mózgu myszy za pomocą specjalistycznego urządzenia pozycjonującego. Znieczulone myszy są zabezpieczone w pozycji głowy w dół i do przodu, aby zoptymalizować wdychanie siRNA, jednocześnie...

donosowe podawanie siRNA do mózgu myszy za pomocą urządzenia pozycjonującego

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Tutaj opisujemy dostarczanie mikroRNA za pomocą rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 9 w mysim modelu choroby nerwowo-mięśniowej. Pojedyncze podanie obwodowe myszom spowodowało trwałą nadekspresję miRNA w neuronach mięśniowych i ruchowych, co dało możliwość zbadania funkcji miRNA i potencjału terapeutycznego in vivo.

Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni

Ten protokół dostarcza przepływ pracy, jak połączyć sztuczną interferencję RNA za pośrednictwem mikroRNA z optogenetyką, aby stymulować specyficznie presynaptyczne butony ze zmniejszoną ekspresją selektywnych genów w nienaruszonych obwodach neuronalnych.

Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

Hamowanie mikroRNA specyficzne dla tkanek to technologia, która jest słabo rozwinięta w dziedzinie mikroRNA. W tym artykule opisujemy protokół skutecznego hamowania rodziny mikroRNA miR-181 w komórkach mioblastów z serca. Technologia nanowektorowa jest wykorzystywana do dostarczania gąbki mikroRNA, która wykazuje znaczące inhibicję rodziny miR-181 specyficznej dla układu krążenia in vivo.

In vivo (in vivo) Nanowektorowe dostarczanie gąbki mikroRNA specyficznej dla serca

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący urządzenie do pozycjonowania myszy, który umożliwia odpowiednie rozmieszczenie myszy do donosowego podawania preparatu peptydowo-siRNA ukierunkowanego na mózg, umożliwiając skuteczne wyciszanie genów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego

Opisany tutaj jest protokół charakteryzujący moduły biologicznie synergicznych miRNA i ich łączenie w krótkie transgeny, co pozwala na jednoczesną nadekspresję dla zastosowań terapii genowej.

Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Poznaj metodę dostarczania antagomirów do mózgu za pomocą peptydu neurotropowego u myszy. Technika ta umożliwia specyficzny knockdown mikroRNA, omijając barierę krew-mózg i ułatwiając badanie neurodegeneracji.

Prosta alternatywa dla wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu specyficznego dla mózgu knockdownu miRNA

Przeglądaj więcej filmów