Prosta alternatywa dla wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu specyficznego dla mózgu knockdownu miRNA

Tutaj pokazujemy zastosowanie peptydu penetrującego komórki ze zmodyfikowanym oligonukleotydem antysensownym do specyficznego niszczenia mikro RNA w mózgu myszy. Udało się to osiągnąć poprzez zaprojektowanie antygo przeciwko 29 maja. W tym badaniu wykorzystaliśmy samce antygo do celowania w modyfikacje kwasów nukleinowych blokujące mikroRNA.

Oznacza to, że modyfikacje LNA zostały włączone w pięciu różnych pozycjach. W tym przypadku włączenie modyfikacji LNA zwiększa jego powinowactwo wiązania do mikro RNA. Nadaje również odporność jądra, a tym samym zwiększa skuteczność celowania w mikroRNA.

Kompleksy ANTIGO MAR z peptydem przygotowano in vitro i wstrzyknięto myszom przez żyłę ogonową. Knockdown mikro RNA spowodował zmiany w zachowaniu, które sugerują udział tego mikroRNA w ataksji, trzy kolejne wstrzyknięcia wystarczyły, aby wywołać zauważalną zmianę chodu po leczeniu, pobrano tkankę mózgową i potwierdzono knockdown mikroRNA. CPP lub peptydy samopenetrujące stały się ostatnio atrakcyjnymi nośnikami dostarczania kwasów nukleinowych.

Tutaj użyliśmy jednego z takich bogatych w argininę peptydów neurotropowych, który może ulegać kompleksowaniu opartemu na ładunku z LNA, który po podaniu do krążenia ogólnoustrojowego dotrze do wyznaczonego miejsca docelowego, czyli w tym przypadku komórek nerwowych i zapewni prawidłowe uwalnianie LNA do tych komórek. Sekwencje członków rodziny ME 29 pobrano z maczu, a 16 antysensownych MER zsyntetyzowano z modyfikacjami kwasu nukleinowego lock w pięciu równomiernie rozmieszczonych pozycjach w celu przygotowania kompleksów. Roztwory peptydu i antigo o odpowiednich stężeniach przygotowano oddzielnie w sterylnym 10% roztworze glukozy.

W warunkach aseptycznych. Roztwór Antigo powoli dodawano kroplami do roztworu peptydów, delikatnie mieszając. Powolne dodawanie i delikatne mieszanie mają kluczowe znaczenie dla tworzenia mono rozproszonych kompleksów, których wielkość mieści się w skali tric.

Antygo dodawano za każdym razem w trzech równych częściach, pozostawiając minutę na mieszanie, a następnie minutę inkubacji bez mieszania. Szybkie dodawanie może prowadzić do agregacji kompleksów i wytrącania się. Kompleks Antigo jest teraz gotowy do wstrzyknięcia.

Kompleks podawano poprzez iniekcję do żyły ogonowej. Myszy zostały umieszczone z powrotem w tej samej klatce. Testy behawioralne w kierunku ataksji przeprowadzano codziennie, trzy godziny po wstrzyknięciu.

Mysz była trzymana za ogon, co nie pozwalało jej dotykać żadnych otaczających ją przedmiotów. Zwróć uwagę na sposób, w jaki tylne kończyny są rozłożone na 10 sekund. W teście półki myszy musiały chodzić po cienkiej półce klatki.

Myszy przechodzą przez cienki kanał, pozostawiając ślady stóp z tuszem na pasku grubego chłonnego atramentu papierowego, tylko tylne łapy. Aby uniknąć mylących danych Z czterech kończyn, zobaczmy efekt leczenia antigo. Odizolowaliśmy mózg i inne tkanki od leczonych i kontrolowanych myszy.

Odkryliśmy, że peptyd R VG dostarcza znakowane fluorescencyjnie siRNA specyficznie do mózgu, ale nie do innych tkanek, takich jak wątroba. Nieneurotropowy peptyd kontrolny RVM dostarczał siRNA do wątroby. Myszy leczone ANTIER 29 wykazywały wady kończyny tylnej.

Myszy kontrolowane z klasem, którym podawano jajecznicę, mogły pokonywać półkę, ale po leczeniu anme przeciwko MARE 29 myszy wykazywały łagodne wady w tym teście. W teście odcisku stopy nastąpiło uderzające skrócenie długości kroku u leczonych myszy. Dodatkowo potwierdziliśmy za pomocą QR tpcr, że poziomy w połowie 29 A i w połowie 29 B zostały obniżone w celu opracowania terapii opartych na mikro NNA.

Specyficzne dla mózgu dostarczanie anty mikroRNA jest wyzwaniem ze względu na barierę krew-mózg. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki, możemy uniknąć konwencjonalnej metody dostarczania anty mikroRNA do mózgu. Metoda ta sprawia, że knockdown mikroRNA jest technicznie wykonalny i zwiększa specyficzność tkankową.