Name: Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj metodę obrazowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych myszy za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Technika umożliwia śledzenie dynamiki leukocytów w czasie rzeczywistym w warunkach homeostazy i zapalenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez EMBO (do Y.E.), Foundation Machaon (do Y.E.) i SNSF (do B.A.I.). Dziękujemy Centrali Bioobrazowania za dostępność mikroskopu Nikon A1r i pomoc techniczną. Dziękujemy Pani Clarissie Bartley za korektę języka angielskiego.

UWAGA: Procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem Etycznym ds. Opieki nad Zwierzętami w Genewie, Szwajcaria oraz Kantonalnym Biurem Weterynaryjnym. Numer pozwolenia GE/63/14.
1. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki ze szpiku kostnego
<ol>
	<li>Ofiarować mysz (8-12 tygodni) przez zwichnięcie szyjki macicy. Sterylizuj tylne nogi 70% etanolem. Usuń skórę z tylnych nóg</li>.
	<li>Wypreparuj kości udowe i piszczelowe myszy i usuń tkankę z nóg za pomocą skalpela. Opłucz nogi 90% etanolem i umieść w naczyniu hodowlanym wypełnionym PBS.</li>
	<li>Pod kapturem hodowlanym oczyść tkankę z kości udowych i piszczelowych za pomocą skalpela i oddziel w stawie kolanowym. Odetnij każdy koniec kości.</li>
	<li>Przepłukać szpik kostny z każdej kości za pomocą igły 23G i strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej preparatem (DMEM/F12 bez czerwieni fenolowej, 1% surowica szczurzego) do probówki z gwintem o pojemności 50 ml. Rozbij agregacje komórkowe poprzez delikatne przejście przez igłę 23G i strzykawkę o pojemności 1 ml. Doprowadzić całkowitą objętość do 25 ml za pomocą pożywki preparatycznej.</li>
	<li>Odwirować 250 x g, 5 min, 4 °C. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml buforu RBLC do lizy czerwonych krwinek (8,3 g NH4Cl, 1 g NaHCO3, 1 ml EDTA (100 mM), uzupełnić do 1 l wodą destylowaną, przefiltrować 0,22 μm) w probówce z gwintem o pojemności 15 ml. Inkubować przez 30 sekund na lodzie.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki i odwirować 250 x g, 5 min, 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml pożywki do przygotowania.</li>
</ol>
2. Wzbogacanie neutrofili przez selekcję negatywną
<ol>
	<li>Dodaj 150 μl koktajlu wzbogacającego neutrofile myszy (zestaw platformy do izolacji komórek, taki jak EasySep). Wymieszać i inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 10 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej. Odwrócić raz i odwirować 250 x g, 3 min, 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Zawiesić granulki w 1,75 ml pożywki w 5 ml polistyrenowych probówek z okrągłym dnem. Dodaj 250 μl koktajlu Biotin Select. Wymieszać i inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Wiruj cząstki magnetyczne (z zestawu platformy do izolacji komórek) przez 30 sekund, aby ponownie zawiesić cząstki. Dodaj 500 μl cząstek magnetycznych do zawiesiny komórek. Wymieszać i inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Umieść rurkę w magnesie. Poczekaj 3 min.</li>
	<li>Odwróć magnes na nowe probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu, aby zebrać żądane nieoznakowane komórki. Nie należy brać ostatniej kropli wiszącej w tubce. Niechciane komórki pozostaną w rurce wewnątrz magnesu. Wyrzuć tę rurkę do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne.</li>
	<li>Umieść nową rurkę w magnesie. Poczekaj 3 min.</li>
	<li>Odwróć magnes na nową rurkę śrubową o pojemności 15 ml, aby zebrać żądane nieoznakowane komórki. Nie należy brać ostatniej kropli wiszącej w tubce.</li>
	<li>Całkowita objętość do 5 ml z DMEM bez czerwieni fenolowej.</li>
</ol>
3. Etykietowanie neutrofili
<ol>
	<li>Dodaj 0,5 μl barwnika pomarańczowego, takiego jak Cell Tracker Orange (stężenie robocze 1 μM, CMRA – octan chlorometylodolu, zapas 10 mM w DMSO). Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml pożywki do sporządzania. Wirówka 250 x g, 5 min, 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml pożywki w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Weź podwielokrotność do policzenia za pomocą hematocytometru.</li>
	<li>Inkubować 5 minut w temperaturze 37 °C. Odwirować 250 x g, 5 min, 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml PBS. Odwirować 250 x g, 5 min, 4 °C do umycia.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Zawiesić osad jako 10x106 komórek na 100 μl PBS. Przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia dożylnego. UWAGA: komórki muszą być wstrzykiwane dożylnie tak szybko, jak to możliwe. Zwykle uzyskuje się 6-12x106 neutrofili/mysz.</li>
</ol>
4. Przygotowanie myszy do mikroskopii przyżyciowej
UWAGA: Krok 4.1.) oraz 4.2.) należy przeprowadzić na początku doświadczenia, aby uniknąć wydłużenia czasu oczekiwania znakowanych neutrofili na lodzie.
<ol>
	<li>Zważ mysz CX3CR1gfp (8-12 tygodni).</li>
	<li>Przygotować 800 μl środków znieczulających (ketamina 60 mg/kg, ksylazyna 4,5 mg/kg, acepromazon 1,75 mg/kg w PBS).</li>
	<li>Znieczulić mysz. Iniekcja i.p. z 200 μl / 20 g myszy. Kontroluj znieczulenie, szczypiąc palce u nóg i sprawdzając częstość oddechów.</li>
	<li>Wstrzyknąć neutrofile (10x106 komórek w 100 μl PBS) dożylnie, używając bocznych żył ogonowych lub zatoki zaoczodołowej, w dogodnym dla eksperymentatora</li> terminie.
	<li>Połóż mysz na poduszce grzewczej i zabezpiecz oczy żelem do oczu.</li>
	<li>Szklane szkiełko nakrywkowe (o średnicy 35 mm) umieszcza się w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm, które ma otwór o średnicy 30 mm. Olej służy do utrzymywania naczynia do hodowli tkankowych w kontakcie ze szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Naciąć skórę brzucha nożyczkami, aby odsłonić otrzewną. Naciąć otrzewną nożyczkami, aby odsłonić jelito.</li>
	<li>Dodać 200 μl PBS (podgrzanego w temperaturze 37 °C) do jamy otrzewnej. Weź mysz w dłoń i odwróć ją twarzą do dołu, tak aby jelito wydostało się z jamy otrzewnej przy delikatnym nacisku. Umieść mysz w naczyniu do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Delikatnie rozwiń jelito wysterylizowanymi patyczkami kosmetycznymi na szkiełko nakrywkowe, aby odsłonić naczynia krezkowe.</li>
	<li>Pokrój papierowe chusteczki w pasma i zwilż je podgrzanym PBS w temperaturze 37°C. Unieruchomij jelito za pomocą kawałków papierowych chusteczek, aby zmniejszyć ruchy wynikające z perystaltyki.</li>
	<li>Umieść naczynie do hodowli tkankowej i mysz w komorze z termostatem o temperaturze 37 °C na specjalnie wykonanej tacy, stoliku mikroskopu odwróconego. Wprowadzić strzykawkę zawierającą środki znieczulające s.c. do tylnej nogi. UWAGA: Dodatkowo mysz może otrzymywać tlen (0,5 l/min) za pomocą maski.</li>
	<li>Kontroluj mysz do znieczulenia, ściskając palce u nóg i sprawdzając częstość oddechów co 30 minut. W razie potrzeby podaj dawkę środków znieczulających (20 μl), aby prawidłowo utrzymać znieczulenie. UWAGA: Należy unikać wysuszania naczyń krwionośnych. Dlatego jego wilgotność jest utrzymywana poprzez regularne zwilżanie tkanek papierowych używanych do unieruchamiania jelita PBS podgrzanym w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
5. Pomiar zachowania neutrofili i monocytów w naczyniach objętych stanem zapalnym in vivo za pomocą mikroskopii przyżyciowej
<ol>
	<li>Ustaw lasery na 488 i 561 - na najniższą moc niezbędną do uniknięcia fototoksyczności wywołanej laserem. W naszych eksperymentach jest to mniej niż 0,5%. Intensywność GFP w monocytach i pomarańczowego barwnika w neutrofilach jest tak duża, że zwykle wystarcza 0,3%. UWAGA: Odpowiada to mocy lasera od 0,15 do 0,25 mW w naszym systemie.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy o rozdzielczości 512 x 512 pikseli (tj. 635 μm) w 2,2 sekundy z otwartym otworkiem za pomocą suchego obiektywu 20X mikroskopu odwróconego. Użyj głębokości z od 10 do 20 μm, która zapewnia wystarczający sygnał przy niskich mocach lasera. 
	UWAGA: Zazwyczaj przeprowadzamy eksperymenty z głębokością z od 12 do 16 μm. W przypadku prezentowanych rysunków i filmów głębokość z wynosi 20 μm. Kontrast fazowy pozwala na identyfikację ścian śródbłonka, a obrazowanie wykonuje się na żyłach krezkowych. Ponieważ patrolujące komórki poruszają się dość wolno, z prędkością 5-10 μm/min6, rejestrowanie pola zainteresowania co 20 sekund jest zadowalające. Przy opisanych ustawieniach zmotoryzowany stolik pozwala na nagrywanie do 7 pól zainteresowania jednocześnie.</li>
	<li>Umieść mysz i naczynia krezkowe w komorze termostatu mikroskopu, aby umożliwić im regenerację po preparacji przez 30 minut przed uzyskaniem pierwszego filmu. W tym czasie wybierz kilka dziedzin zainteresowań. Ustaw ostrość na powierzchni świetlnej naczynia znajdującej się najbliżej obiektywu. W razie potrzeby skorzystaj z lekkiej autofluorescencji śródbłonka, aby ustawić ostrość. 
	UWAGA: Zabieg chirurgiczny podczas preparacji myszy nieznacznie obciąża śródbłonek. W związku z tym zwijanie neutrofili i (lub) monocytów można zaobserwować w ciągu pierwszych 15 minut po przygotowaniu preparatu u myszy.</li>
	<li>Nagrywaj pierwszy film przez 30 minut w warunkach ustalonych, jeden obraz co 20 sek. 
	UWAGA: Oprogramowanie rejestruje każde pole zainteresowania w ciągu 2,2 sekundy, a zmotoryzowany stolik automatycznie przenosi się z jednego pola na drugie. Wraca do pierwszej pozycji w ciągu 20 sekund w ciągu 30 minut nagrywania filmu.</li>
	<li>Aby zainicjować stan zapalny naczyń krwionośnych, należy dodać kroplę 20 μl PBS zawierającą 100 μg agonisty TLR2/TLR1 Pam3CSK4 12 bezpośrednio na obrazowane naczynia.</li>
	<li>Kontroluj fokus dla każdego pola zainteresowania. 
	UWAGA: W trakcie akwizycji zawsze następują niewielkie zmiany ostrości na osi z. Pomimo głębokości 10-20 μm może to spowodować spadek intensywności fluorescencji. Dlatego w razie potrzeby ręcznie zmień ostrość na każde pole zainteresowania na końcu każdego filmu. Nagrywaj filmy przez 30 minut i łącznie do 3 godzin po zainicjowaniu stanu zapalnego.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu poświęć znieczuloną mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>
6. Generowanie plików filmowych i śledzenie leukocytów
UWAGA: Oprogramowanie do akwizycji firmy Nikon generuje pliki .nd2, ale poniższa procedura będzie podobna w przypadku innego oprogramowania i marek.
<ol>
	<li>Eksportuj pliki jako serie tiff.</li>
	<li>Przejdź do oprogramowania ImageJ (<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>). Zaimportuj serię tiff. Każdy kanał jako inny plik.</li>
	<li>Zastosuj filtr mediany o promieniu 2,0 piksela dla kanałów zielonego i czerwonego, aby zredukować szum tła (Filtry procesowe > > mediana...).</li>
	<li>Konwertuj pliki na binarne (Process > Binary > Create Binary). Włącz oprogramowanie do obliczania progu dla każdego obrazu.</li>
	<li>Scalanie kanałów w jedną serię obrazów (Obraz > Kolor > Scal kanały...). Wybierz monocyty w kanale zielonym, neutrofile w kanale czerwonym i światło przechodzące w kanale szarym.</li>
	<li>Konwertuj obrazy ułożone w stos na kolory RGB (Kolor obrazu > > Stos na RGB).</li>
	<li>Zapisz plik jako .avi</li>
	<li>Dane są importowane i kompilowane w oprogramowaniu Imaris (Bitplane). Ruchy monocytów i neutrofili są następnie śledzone za pomocą Kreatora śledzenia plamek.</li>
</ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaching+multiple+barriers%3A+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li>
<li>Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLey%2C+K+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. 445, 255-279 (2008).</li>
<li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+blood+vessels+and+tissues+by+a+population+of+monocytes+with+patrolling+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior.</a> Science. 317, 666-670 (2007).</li>
<li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33, 375-386 (2010).</li>
<li>Hanna, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+NR4A1+%28Nur77%29+controls+bone+marrow+differentiation+and+the+survival+of+Ly6C-+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes.</a> Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).</li>
<li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+junctional+adhesion+molecule+JAM-C+regulates+polarized+transendothelial+migration+of+neutrophils+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo.</a> Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).</li>
<li>Proebstl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+support+neutrophil+subendothelial+cell+crawling+and+breaching+of+venular+walls+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo.</a> J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).</li>
<li>Wantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cathelicidin+promotes+adhesion+of+classical+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes.</a> Circ Res. 112, 792-801 (2013).</li>
<li>Ozinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repertoire+for+pattern+recognition+of+pathogens+by+the+innate+immune+system+is+defined+by+cooperation+between+toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498, 371-375 (2013).</li>
<li>Carlin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nr4a1-dependent+Ly6C%28low%29+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li>
<li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li>
<li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109(2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Metodologie opisane w tym manuskrypcie zapewniają spójne podejście do skutecznego badania zachowania monocytów i neutrofili w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.
Kluczowym etapem przygotowania jest unieruchomienie jelita za pomocą tkanek zwilżonych PBS. Jeśli zostanie wykonane prawidłowo, naczynia krezkowe są ładnie naświetlone na szkiełku nakrywkowym w celu uzyskania obrazu. Umożliwia to wybór kilku obszarów zainteresowania do monitorowania zachowania leukocytów w żył...

Neutrofile i monocyty to komórki wrodzonego układu odpornościowego, które nieustannie krążą we krwi. Po urazie lub infekcji sygnały zapalne indukują diapedezę leukocytów w uszkodzonych i zakażonych tkankach, inicjując w ten sposób komórkową odpowiedź immunologiczną 1-3. Szybkość mobilizacji leukocytów decyduje o pozytywnym wyniku odpowiedzi immunologicznej. Te skomplikowane procesy opierają się na określonych cząsteczkach (np. Selektynach, chemokiny związane ze śródbłonkiem) obecnych w śródbłonku objętym stanem zapalnym, które pomagają w tworzeniu kontaktów adhezyjnych między krążącymi leukocytami a śródbłonkiem 1-3. Aby uzyskać wgląd w cząsteczki zaangażowane w kaskadę rekrutacji leukocytów, ważne jest, aby zobrazować kinetykę rekrutacji komórek i śledzić zachowanie każdej komórki/populacji. Skuteczna metoda polega na mikroskopii przyżyciowej na transgenicznych myszach wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych w komórkach będących przedmiotem zainteresowania.
Do tej pory opracowano kilka podejść wykorzystujących mikroskopię przyżyciową do obrazowania naczyń krwionośnych 4,5. Na przykład obrazowanie unaczynienia skóry właściwej ucha lub żył krezkowych za pomocą przyżyciowej mikroskopii konfokalnej wykorzystano do identyfikacji zachowania patrolowego mysich monocytów oniskiej zawartości Ly6C i ludzkichmonocytów CD14 dimCD16 + po stronie światła naczyń krwionośnych w warunkach stanu ustalonego 6-8. Mysi model unaczynienia Cremaster jest często używany do monitorowania zachowania neutrofili lub zapalnych monocytów owysokim poziomie Ly6C w warunkach zapalnych lub niedokrwiennych u myszy transgenicznych. W takim przypadku cremaster jest stymulowany poprzez wstrzyknięcie domosznowe IL1β, CCL2, TNFβ lub fMLP. Po 2-4 godzinach tkanki są następnie chirurgicznie eksterioryzowane i analizowane za pomocą przyżyciowej mikroskopii konfokalnej 9-11.
Poniższy protokół opisuje metodę jednoczesnego monitorowania monocytów i neutrofili za pomocą dowolnego mikroskopu konfokalnego z odwróconą fluorescencją. Ponadto nasza metoda szczegółowo opisuje, jak obrazować to samo naczynie przed (stan stacjonarny) i po zapaleniu oraz jak śledzić kinetykę rekrutacji leukocytów. W tym celu wykorzystujemy mysz CX3CR1gfp/wt, której monocyty wyrażają eGFP, dożylnie wstrzyknięte mysim neutrofilami znakowanymi pomarańczowym barwnikiem. Za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego możliwe jest (1) śledzenie i analizowanie patrolującychniskich monocytów Ly6C w warunkach stanu stacjonarnego oraz (2) śledzenie rekrutacji zarówno monocytów, jak i neutrofili w tym samym naczyniu po miejscowym zapaleniu. Tutaj tworzymy stany zapalne za pomocą agonisty TLR2/TLR1 Pam3CSK4 12. Co więcej, takie obrazowanie może pomóc w określeniu roli określonych cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania w różnych etapach kaskady rekrutacji leukocytów, jeśli zostanie przeprowadzone na określonych myszach z nokautem lub w obecności przeciwciał blokujących 6,9,13.

<table><tbody><tr><td>Probówki z okrągłym dnem polistyrenowe o pojemności 5 ml&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>10x CFI Plan Apochromat 0,45&nbsp; &nbsp; DT:4mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Apochromat VC 0,75 DT:1mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Pomarańczowy CMRA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania neutrofili myszy EasySep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-042</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny typu A</td><td>Nikon</td><td></td><td>dowolny lepki olej&nbsp;</td></tr><tr><td>System kontroli temperatury Life Box</td><td>Obrazowanie</td><td></td><td></td>życia</tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Nikon A1R</td> Mikroskop odwrócony <td>Nikon</td><td>A1R</td><td>, zmotoryzowany stolik x/y/z, oprogramowanie NIS elements</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>bez czerwieni fenolowej DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td>dowolne podłoże wolne od czerwieni fenolowej jest odpowiednie</td></tr><tr><td>PAM3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>rozpuszczają się w PBS</td></tr><tr>Technologie <td></td><td>komórek macierzystych</td><td>surowicy szczurów</td><td>zawarte w EasySep Zestaw do wzbogacania neutrofili myszy</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Skuteczna odpowiedź immunologiczna zależy od szybkiej mobilizacji leukocytów krwi do miejsca infekcji lub urazu. Badanie migracji leukocytów in vivo ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia molekularnych podstaw transśródbłonkowej migracji leukocytów i interakcji z śródbłonkiem naczyniowym. Jednym z potężnych podejść jest mikroskopia przyżyciowa na transgenicznych myszach wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych w komórkach będących przedmiotem zainteresowania.
Tutaj prezentujemy protokół obrazowania monocytów i neutrofili w myszy CX3CR1gfp/wt i.v., której wstrzyknięto pomarańczowe neutrofile znakowane barwnikiem za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego. Filmy poklatkowe zebrane od 30 min do kilku godzin obrazowania pozwalają na analizę zachowania leukocytów w żyłach krezkowych zarówno w stanie stacjonarnym, jak i zapalnym. Opisujemy również kroki w celu miejscowego wywołania zapalenia naczyń krwionośnych za pomocą agonisty TLR2 / TLR1 Pam3SK4 i monitorowania późniejszej rekrutacji neutrofili i monocytów.
Przedstawiona technika może być również wykorzystana do monitorowania innych populacji leukocytów i badania cząsteczek zaangażowanych w rekrutację lub handel leukocytami za pomocą innych bodźców lub transgenicznych myszy.

W manuskrypcie opisano zoptymalizowany protokół umożliwiający łatwe monitorowanie w czasie rzeczywistym zachowania monocytów i neutrofili w żyłach krezkowych znieczulonych myszy. Użycie komory termostatowanej w 37 °C jest niezbędne w celu utrzymania temperatury ciała myszy, a także ze względu na zależność ruchu leukocytów od temperatury. Przygotowanie myszy przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2 pokazuje cały obszar widoczny pod mikroskopem. Światło przechodzące pozwala na identyfikację żył krezkowych (cz...

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Ogólnym celem tej procedury konfokalnej mikroskopii intravitalnej jest monitorowanie dynamiki neutrofilli i monocytów w żyłach krezkowych w warunkach stanu spoczynku oraz stanu zapalnego u myszy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak molekularne podstawy migracji leukocytów, ich rekrutacji oraz oddziaływania z śródbłonkiem naczyniowym. Głównymi zaletami tej techniki są możliwość śledzenia i analizy patrolowania monocytów LY 60 low w warunkach stanu spoczynku, a także obserwacja rekrutacji zarówno monocytów, jak i neutrofili do tego samego naczynia po lokalnych bodźcach zapalnych. Procedurę zaprezentuje Stefan Ler, technik laboratoryjny. Aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z szpiku kostnego, należy wysterylizować tylne kończyny myszy w wieku od 8 do 12 tygodni 70% etanolem, a następnie za pomocą skalpela pobrać kości udowe i piszczelowe po oddzieleniu wszystkich kości.Opłucz kończyny 90% etanolem i przenieś kości do naczynia hodowlanego wypełnionego PBS. Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, użyj skalpela, aby oczyścić kości udowe i piszczelowe oraz rozdzielić je w stawie kolanowym. W kolejnym kroku odetnij końce kości i użyj strzykawki 1 ml z medium przygotowawczym i igłą 23 G, aby wypłukać szpik z każdej kości do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.Rozbić agregaty komórkowe, przepuszczając je ponownie przez końcówkę igły, a następnie uzupełnić całkowitą objętość zawiesiny komórkowej do 25 mililitrów świeżą pożywką. Odwirować komórki, a następnie resuspenderować. Zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy erytrocytów i przenieść komórki do 15-mililitrowej probówki stożkowej na lodzie. Po 30 sekundach przerwać lizę, dodając 10 mililitrów pożywki.Ponownie odwiruj komórki i resuspenduj osad w kolejnych dwóch mililitrach medium przygotowawczego, aby wzbogacić frakcję neutrofili poprzez selekcję negatywną. Najpierw inkubuj komórki szpiku kostnego z 150 µL koktajlu do wzbogacania neutrofili mysich w temperaturze 0 °C przez 10 minut.Po zakończeniu inkubacji dodać 10 ml DMEM bez czerwieni fenolowej. Odwrócić probówkę jeden raz i odwirować komórki. Ponownie zawiesić osad w 1,75 ml medium przygotowawczego, a następnie przenieść komórki do polistyrenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności pięciu ml.Następnie inkubuj komórki z 250 µL koktajlu selekcyjnego z biotyną na lodzie przez 10 minut. Po zakończeniu inkubacji resuspendujemy cząsteczki magnetyczne z zestawu do izolacji komórek, wierzając próbkę w vorteksie przez 30 sekund. Następnie inkubuj komórki z 500 µL cząsteczek na lodzie przez 10 minut.Po zakończeniu inkubacji umieść probówkę w magnesie. Po trzech minutach przelej zawartość do nowej probówki o okrągłym dnie z polistyrenu o pojemności pięciu mililitrów. Aby zebrać nieoznakowane komórki, umieść probówkę z nieoznakowanymi komórkami w magnesie.Po trzech minutach odwróć magnes nad 15 mililitrową probówką stożkową, aby przenieść nieoznaczone komórki, pozostawiając ostatnią kroplę w probówce. Następnie uzupełnij objętość do pięciu mililitrów świeżym medium dm bez czerwieni fenolowej. Teraz dodaj do komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza pół mikrolitra odpowiedniego barwnika cytoplazmatycznego, takiego jak użyty tutaj CellTracker Orange.Po dwóch minutach w temperaturze 37 °C należy przemyć komórki 2,5 ml medium przygotowawczego, a następnie zawiesić osad w 1 ml medium przygotowawczego w probówce o pojemności 1,5 ml, policzyć komórki i inkubować je przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Po odwirowaniu komórek zawieszamy osad w 1 ml PBS, a następnie przeprowadzamy kolejną wirowkę. Należy użyć oleju, aby przymocować szklane okładniczkę o średnicy 35 mm do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm z otworem o średnicy 30 mm.Następnie resuspendować osad w stężeniu 1×10⁷ komórek na 100 µL PBS i jak najszybciej po znakowaniu umieścić komórki w lodzie. Wstrzyknąć znakowane neutrofile dożylnie znieczulonej myszy CX3CR1 GFP w wieku od 8 do 12 tygodni i umieścić zwierzę na podgrzewaczu. Następnie niezwłocznie nanieść maść na oczy zwierzęcia i za pomocą nożyczek rozciąć skórę brzucha, odsłaniając otrzewną, a następnie naciąć otrzewną nożyczkami, aby odsłonić jelita.Następnie podaj 200 µL PBS o temperaturze 37 °C do jamy otrzewnej i odwróć mysz brzuchem do góry nad naczyniem hodowlanym, aby usunąć jelita z jamy otrzewnej przy użyciu delikatnego nacisku. Następnie, używając sterylnych patyczków bawełnianych, ostrożnie rozwiń jelita na szkiełku nakrywce, aby odsłonić naczynia krezkowe, i unieruchom tkankę kawałkami papieru do tkanek nasączonymi PBS o temperaturze 37 °C, aby ograniczyć ruchy wynikające z perystaltyki. Bardzo ważne jest, aby poświęcić odpowiednią ilość czasu na staranne unieruchomienie jelita za pomocą nasączonych PBS tkanek.W przeciwnym razie ruchy wynikające z perystaltyki podczas akwizycji obrazu zniweczą eksperyment. Następnie przenieś naczynie hodowlane i mysz do komory termostatycznej o temperaturze 37 °C na specjalnie wykonanym stoliku do śledzenia w mikroskopie odwróconym i podaj drugą dawkę środków znieczulających domięśniowo w tylną łapę. Teraz ustaw odpowiednie lasery na najniższą moc niezbędną do uniknięcia fototoksyczności indukowanej laserem i pozwól myszy odpocząć przez 30 minut.Po powrocie zwierzęcia do stanu równowagi, zarejestruj pierwszy film przez 30 minut w warunkach stanu stacjonarnego. Następnie, aby wywołać stan zapalny naczyń krwionośnych, nanieś kroplę 20 µL PBS zawierającą 100 µg agonisty TLR2/TLR1 PAM3CSK4 bezpośrednio na obrazowane naczynia. Na koniec zarejestruj drugi film, dbając o kontrolę ostrości po dodaniu agonisty, ponieważ stan zapalny powoduje zmiany w szerokości śródbłonka, co zmienia ogniskowanie w osi Z. Tutaj, w tym filmie, przedstawiono poszczególne etapy przetwarzania obrazu dla pierwszego punktu czasowego filmu zarejestrowanego w warunkach stanu stacjonarnego, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Patrolowanie zielonych monocytów LASIK cilo w warunkach stanu stacjonarnego można wizualizować na tle czerwonych neutrofili krążących w krwiobiegu. Tutaj przedstawiono to samo pole widzenia 90 minut po dodaniu PAM trzy CSK cztery, co doprowadziło do masowej rekrutacji neutrofili i monocytów do ściany śródbłonka, którą monocyty skrupulatnie skanują. Przy użyciu odpowiedniego oprogramowania można śledzić dokładne ścieżki patrolowania śródbłonka przez monocyty i neutrofile przed i po zainicjowaniu stanu zapalnego.Należy zauważyć, że utrata ostrości w osi Z lub przesunięcie w płaszczyźnie XY mogą wystąpić w wyniku ruchów jelit, co może doprowadzić do niepowodzenia eksperymentu. Technikę tę można dalej modyfikować, wykorzystując różne modele myszy modyfikowanych genetycznie lub wstrzykując przeciwciała blokujące bądź leki farmakologiczne, aby określić rolę konkretnych interesujących nas cząsteczek w zachowaniu leukocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat monitorowania dynamiki nasycenia leukocytów w żyłach krezkowych.

imaging-neutrophils-monocytes-mesenteric-veins-intravital-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

W tym filmie demonstrujemy wizualizację interakcji krwinek i śródbłonka w żyłach krezkowych w modelu myszy, któremu wstrzyknięto dootrzewnowo lipopolisacharyd.

Mikroskopia przyżyciowa do analizy interakcji komórka-śródbłonek krwi w mysim modelu zapalenia

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Ten obecny protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery, znakowanie in vivo i techniki obrazowania przyżyciowego, aby umożliwić monitorowanie dynamicznego procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt.

Przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β

Protokół opisuje nowatorski model komory okiennej kości udowej dla myszy, który może być używany do śledzenia ruchu komórek w szpiku kości udowej in vivo. Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa służy do obrazowania trzech składników szpiku kostnego kości udowej (układu naczyniowego, macierzy kolagenowej i neutrofili) w czasie.

Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Monocyty są ważnymi mediatorami arteriogenezy w kontekście choroby tętnic obwodowych. Wykorzystując macierz przypominającą błonę podstawną i mikroskopię przyżyciową, protokół ten bada naprowadzanie monocytów i angiogenezę związaną z nowotworem po wstrzyknięciu monocytów w mysim modelu podwiązania tętnicy udowej.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Migracja neutrofili polega na szybkiej i ciągłej przebudowie błony plazmatycznej w odpowiedzi na chemoatraktant i jego interakcje z mikrośrodowiskiem zewnątrzkomórkowym. Opisana w niniejszym dokumencie jest procedura oparta na przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej w celu zbadania dynamiki przebudowy błony w neutrofilach wstrzykniętych do ucha znieczulonych myszy.

Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

Ten protokół przedstawia metodę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego krezki i wizualizacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w żyłkach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Przepływ krwi w tętnicy krezkowej górnej był ograniczony przez 1 godzinę, po czym nastąpiła reperfuzja, co umożliwiło bezpośrednie ilościowe określenie adhezji leukocytów i NETozy.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Poznaj metodę obrazowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych myszy za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Technika umożliwia śledzenie dynamiki leukocytów w czasie rzeczywistym w warunkach homeostazy i zapalenia.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów